Halbautomatische Biopanning bakterielle Anzeige Bibliotheken für Peptid Affinität Reagenz Entdeckung und Analyse der daraus resultierenden Isolate

Das übergeordnete Ziel dieses Bio-Panning-Verfahrens besteht darin, Peptid-Capture-Wirkstoffe schnell auf ein spezifisches Proteinziel von Interesse zu isolieren und die unspezifischen Kandidaten schnell und effektiv aus der weiteren nachgelagerten Analyse zu eliminieren. Diese Methode kann für die Entdeckung robuster Peptid-Affinitätsreagenzien für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, von der Erkennung biologischer Bedrohungen bis hin zur Diagnose von Krankheiten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Peptid-Affinitätsreagenzien in etwa einer Woche ohne erheblichen Schulungsaufwand schnell isoliert werden können.

Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Reagenzien für die Peptidaffinität außerhalb der Zellen zu entdecken, könnten die Peptide auch als lebende Materialien verwendet werden. Im Allgemeinen ist der schwierigste Aspekt für Personen, die neu in dieser Methode sind, die nachgelagerte Sequenzanalyse der Kandidaten, die stark mit den hier gezeigten experimentellen Protokollen zusammenspielt. Das Bio-Panning von bakteriellen Displaybibliotheken ist ein zyklischer Prozess, der mit einer negativen Sortierung gegen die magnetischen Kügelchen selbst beginnt, um alle unspezifischen Bindemittel auf dem Bead-Material oder angehängte Fängerproteine zu entfernen.

Die negative Fraktion, die die magnetischen Kügelchen nicht bindet, sollte erhalten bleiben. Eine zusätzliche negative Sortierung kann gegen potenzielle kreuzreaktive Proteinziele durchgeführt werden, und die negative Fraktion, die die magnetischen Kügelchen nicht bindet, bleibt wieder erhalten. Nachfolgende positive Sortierschritte sind der negativen Sortierung gegen ein Proteinziel sehr ähnlich, aber diesmal bleibt die magnetisch beadgebundene positive Fraktion erhalten.

Für die positive Sortierung der bakteriellen Display-Bibliothek inokulieren zunächst 500 Milliliter Luria Broth Miller, ergänzt mit Chloramphenicol oder LBCM-25, mit etwa einer mal 10 bis 11. Zellen einer vielfältigen bakteriellen Display-Sortierbibliothek, die durch negative Sortierung von unerwünschten Peptiden vorerschöpft sind. Inkubieren Sie die Bibliothek bei 37 Grad Celsius bei 225 U/min, bis die Kultur einen OD 600 von 0,5 bis 0,55 erreicht. Dann induzieren Sie die Peptidexpression mit 0,04 %L-Arabinose für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius unter Schütteln.

Legen Sie die Kultur am Ende der Einführungsphase auf Eis. Und sammeln Sie zwei mal zehn bis elfte Bakterienzellen durch Zentrifugation. Suspendieren Sie das Pellet in 1,5 Millilitern PBS durch leichtes Schwenken.

Und teilen Sie die Bakterien bei Bedarf für eine zweite Zentrifugation in mehrere Mikrozentrifugenröhrchen auf. Das Pellet wird in einem Milliliter PBS, ergänzt mit dem gewünschten Biotinylierungsziel, für eine 45-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius auf einer rotierenden Plattform erneut suspendiert. In der Zwischenzeit waschen Sie 100 Mikroliter Streptavidin-kodierte Kügelchen in einem Millimeter PBS, ergänzt mit Rinderserumalbumin (BSA), durch Zentrifugation.

Legen Sie die gewaschenen Kügelchen in einen Magnetpulverabscheider und entfernen Sie vorsichtig den Supernadent, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören. Am Ende der rotierenden Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen, um jedes ungebundene Ziel im Supernadent zu sammeln, und resuspendieren Sie das an das Zielprotein gebundene Bakterienzellpellet in einem Milliliter PBS plus BSA. Verwenden Sie das gesamte Volumen der Bakterienzellen, um das Kügelchen wieder zu suspendieren.

Inkubieren Sie bei vier Grad Celsius auf einer rotierenden Plattform für 30 Minuten. Legen Sie dann die Perlen- und Bakterienlösung auf Eis. Schalten Sie das Auto-Max-Instrument ein, um das System zu initialisieren, und wählen Sie im Trennmenü die Optionen Jetzt waschen, Spülen und Ausführen aus, um die Leitungen mit den Wasch- bzw. Laufpuffern des Herstellers zu grundieren.

Am Ende der Wäsche grundieren Sie die Fäden noch einmal mit PBS plus BSA-Puffer. Wenn das Gerät fertig ist, geben Sie die Bakterien- und Kügelchenmischung in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und spülen Sie das Röhrchen mit weiteren 500 Mikrolitern frischem PBS plus BSA. Ziehen Sie die Wäsche mit der Bakterien- und Bead-Mischung und legen Sie das Röhrchen in den Probenschlitz eines konischen Röhrchengestells mit vier Grad Celsius.

Legen Sie leere 15-Milliliter-Sammelröhrchen in die positiven und negativen Auswahlschlitze des Racks und bringen Sie das Rack auf die Instrumentenplattform. Weisen Sie jeder Probe auf dem Gestell ein Trennprogramm zu und fügen Sie zwischen jeder Probe und nach der letzten Probe einen Spülschritt hinzu. Wählen Sie Ausführen aus, um die Zellentrennung zu starten, und OK oder Weiter, um zu bestätigen, dass genügend Puffer verfügbar ist.

Wenn das Programm abgeschlossen ist, entfernen Sie das Gestell und legen Sie die positive Fraktion, die sowohl die Bakterien als auch die Kügelchen enthält, auf Eis. Nachdem Sie die Leitungen wie gerade demonstriert mit den Lauf- und Waschpuffern des Herstellers grundiert haben, wählen Sie Power und Ja, um das Gerät abzuschalten, und vergewissern Sie sich, dass sich 70 % Ethanol in der Flasche der Vorratslösung zur Dekontamination befinden. Wenn das Herunterfahren des Systems abgeschlossen ist, leuchten die Flaschen violett.

Die Maschine kann ausgeschaltet werden. Anschließend wird mit der gesamten positiven Sortierfraktion ein Liter LBCM25, ergänzt mit D-Glukose, für die Übernachtkultur bei 37 Grad Celsius unter Schütteln beimpft. Um den Erfolg der Isolierung des Affinitätsreagenzes nach jeder Sortierrunde zu analysieren, fügen Sie am Ende der Peptidinduktion nach der Sortierung fünf Mikroliter induzierter Zellen zu 25 Mikrolitern der Lösungen hinzu, wie in der Tabelle gezeigt.

Nach einer 45-minütigen Inkubation auf Eis sammeln Sie die Bakterien in jeder Lösung durch Zentrifugation und aspirieren das Supernadent aus jeder Probe. Wenn die Probenröhrchen auf Eis liegen, wählen Sie Administrator in der FAX-Gerätesoftware und öffnen Sie den entsprechenden Analyseordner. Klicken Sie auf Neues Experiment.

Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, um das Experiment umzubenennen, und klicken Sie auf globale Arbeitsblätter. Klicken Sie auf das Punktdiagramm-Symbol in der globalen Arbeitsblatttabelle, um ein neues Streudiagramm zu erstellen. Wählen Sie dann das Punktdiagramm selbst aus und wählen Sie das Inspektor-Symbol aus.

Klicken Sie im geöffneten Fenster auf die Felder neben der X- und Y-Achse, um die Achsen auf eine biexponentielle Anzeige einzustellen und das Inspektorfenster zu schließen. Klicken Sie auf das Experiment und erstellen Sie eine neue Probe, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken, um die Probe nach experimentell geeigneter Art umzubenennen. Klicken Sie dann auf das Pluszeichen, um die Probe zu erweitern und die Probe umzubenennen.

Um eine negative Kontrollprobe zu entnehmen, suspendieren Sie das reine PBS-Pellet in 500 Mikrolitern eiskaltem FAX-Laufpuffer und mischen Sie es gut durch Pippetten. Übertragen Sie die Probe in ein Faxröhrchen, schnippen Sie, um die Zellen in Lösung zu halten, und laden Sie die Probe auf das Probeninjektionsröhrchen oder SIT des Geräts. Doppelklicken Sie auf das aktuelle Probenröhrchen und klicken Sie auf erfasste Daten.

Zeigen Sie dann die Ereignisse im zuvor vorbereiteten Punktdiagramm für den seitlichen Streubereich im Vergleich zum Vorwärtspunktdiagramm an und passen Sie den Spannungsschwellenwert der Photomultiplier-Röhre unter der Registerkarte "Schwellenwert" nach Bedarf an, sodass die negativen Kontrollzellen in der Nähe der Mitte liegen. Wenn die Probe richtig abgelesen wird, passen Sie die Durchflussrate so an, dass 200-2.000 Ereignisse pro Sekunde angezeigt werden, und klicken Sie auf Daten aufzeichnen, um mindestens 10.000 Ereignisse zu erfassen. Wenn alle Ereignisse erfasst wurden, entfernen Sie das Probenröhrchen aus dem SIT.

Wählen Sie das Symbol für das Polygon-Tor aus, und zeichnen Sie ein Tor um den Großteil der Zellenpopulation im Streudiagramm. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm, um Bevölkerungshierarchie anzeigen auszuwählen, klicken Sie in der Bevölkerungshierarchie auf P1 und erstellen Sie ein neues Punktdiagramm, um die P1-Grundgesamtheit anzuzeigen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf jede Achse, um die Y-Achse in den FITC-Bereich und die X-Achse in den Vorwärtsstreubereich zu ändern und die Achsen auf eine biexponentielle Anzeige einzustellen.

Verwenden Sie das Polygon-Gate, um die negativen Kontrollzellen so eng wie möglich um die obere und linke Seite der Grundgesamtheit zu begrenzen, und wählen Sie P2 in der Populationshierarchie aus, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Gate umkehren auszuwählen. Weniger als 1 % der Bevölkerung sollte vor dem Tor stehen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm mit dem P2-Gate, um Populationen anzeigen auszuwählen, und wählen Sie die P2- und nicht P2-Populationen für die Anzeige aus.

Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf das Punktdiagramm mit dem P2-Gate, um Statistikansicht erstellen auszuwählen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Statistikansichtsfenster, um Statistikansicht bearbeiten auszuwählen. Fügen Sie auf der Registerkarte "Populationen" die Populationen nach Bedarf hinzu oder entfernen Sie sie, einschließlich der übergeordneten P1-Population. P2 und nicht P2 sollte bereits angezeigt werden.

Fügen Sie dann auf der Registerkarte Statistik den FITC-Bereich, das Medium und alle anderen Statistiken von Interesse hinzu und klicken Sie auf OK, um das Fenster zu schließen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das P2-Streudiagramm und wählen Sie Duplizieren, um ein ähnliches Punktdiagramm für den PE-Bereich und den FSC-Bereich zu erstellen. Passen Sie die Y-Achse an, und verwenden Sie die PBS-Stichprobe allein, um die P3-Population zu begrenzen.

Drehen Sie dann das Tor um. Und zeigen Sie die entsprechenden Populationen an. Wenn alle entsprechenden Gates eingestellt sind, verwenden Sie die Tabelle, um alle Samples auszuführen und etwa 10.000 Events pro Röhre aufzuzeichnen.

Wie in diesem repräsentativen Experiment kann die Bindung von Ypet Mona an ein festes Positivkontrollpeptid dazu beitragen, das Expressionsniveau der induzierten Peptidbibliothek innerhalb der Population zu überwachen. Zellen, denen oberflächensichtbare Peptide fehlen, werden in der Regel während des Sortierprozesses eliminiert, wie in den Runden drei und vier beobachtet wurde. Die Anreicherung der Bibliothek für Peptide, die an das spezifische Ziel von Interesse binden, wird in der Regel innerhalb von drei positiven Sortierrunden erreicht.

Eine vierte Sortierrunde kann von Vorteil sein, da die Peptidsequenzen mit der höchsten Affinität, die bereits in Runde drei vorhanden sind, wahrscheinlich in Runde vier weiter angereichert werden, was die Selektion potenzieller Kandidaten erleichtert. Die Spezifität wird bewertet, indem die Bindung an das beabsichtigte Ziel mit der Bindung an potenzielle kreuzreaktive Ziele, wie z. B. diejenigen, die für die negative Sortierung verwendet wurden, verglichen wird. Die Analyse von Sequenzen aus der Sortierrunde vier zeigt typischerweise sich wiederholende Sequenzen, die hervorragende Ausgangspunkte für Affinitäts- und Spezifitätsanalysen sind.

Die Sequenz-Alignment-Analyse der sich wiederholenden Sequenzen kann verwendet werden, um das Vorhandensein einer Konsensussequenz aufzudecken, die bei der Auswahl von Kandidaten helfen kann. Eine repräsentative Kolonie aus jeder sich wiederholenden Sequenz kann dann anhand von Fakten der Affinität und Spezifität auf der Zelle weiter analysiert werden, um die Peptidbindung an Ziel- und Kreuzreaktivproteine zu beurteilen. Sobald es gemeistert ist, kann ein vollständiges Bio-Experiment mit der anfänglichen Affinitäts- und Spezifitätsanalyse in weniger als zwei Wochen durchgeführt werden, wenn es ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Wenn Sie das gesamte Verfahren durchführen, ist es wichtig, daran zu denken, dass Sie möglicherweise mehrmals zwischen der Bindungsbewertung und der Sequenzanalyse wechseln müssen, um den Transit, der mit der Bindungsaffinität verbunden ist, vollständig zu verstehen. Wir haben eine ergänzende Makrodatei beigefügt, die wir entwickelt haben, um einen Großteil der Peptidanalyse zu automatisieren und die Kandidatenauswahl weiter zu rationalisieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Peptid-Capture-Wirkstoffe schnell aus einer bakteriellen Display-Bibliothek isolieren und unspezifische Kandidaten aus der weiteren nachgelagerten Analyse eliminieren können.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie ALIZA durchgeführt werden, um die Affinität und Spezifität der Zellbindung zu bestätigen.