Bildgebung des primären Hirnrinde Zellen unter Verwendung einer 2D Kultursystem zu leben

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, das Zellverhalten während der Abstammungsprogression von neuralen Stammzellen zu Neuronen oder Gliazellen zu beobachten. Diese Methode kann helfen, Fragen im Bereich der neurologischen Entwicklung zu beantworten, wie z.B. die Rolle symmetrischer und asymmetrischer Zellteilungen, die Verlängerung des Zellzyklus und die Zellwachstumsraten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Beobachtung der Zelllinie über lange Zeiträume ermöglicht.

Dies ermöglicht die Beobachtung des Schalters von der Neurogenese zur Gliagenese innerhalb einer einzigen Linie und eine direkte Komponierung von sublinearen neuralen und glialen Vorläufern. Beginnen Sie mit der Entnahme der Gehirne von 5 bis 10 e14-Embryonen in einer Petrischale mit kaltem Seziermedium. Ziehen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Haut und den Schädel heraus und isolieren Sie das Gehirn.

Verwenden Sie bei der Arbeit unter dem Stereomikroskop eine Präparierzange, um die Hirnhäute zu entfernen. Teile dann das Telencephalon in der Mitte, um die Hemisphären zu trennen. Um das dorsolaterale Telencephalon zu isolieren, schneiden Sie entlang der dorsomedialen Kurve und der Pallio- und Subpalliumgrenze.

Übertragen Sie die dorsolateralen Telencephalons in ein 2-ml-Röhrchen mit Präpariermedium auf Eis, bis alle Gehirne präpariert sind. Nach der Mikrodissektion des dorsolateralen Telencephalons legen Sie das Gewebe in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen mit dem gesammelten Gewebe fünf Minuten lang in Kaltdissektionsmedium bei vier Grad Celsius und 340 mal G, um das Gewebe auszufällen.

Entfernen Sie nach dem Schleudern den Überstand mit einer Pipette und fügen Sie 1 ml 37 Grad Celsius 0,05 % Trypsin-EDTA für den chemischen Aufschluss hinzu. 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation fügen Sie 2 ml Proliferationsmedium hinzu, um die Trypsim-Aktivität zu hemmen.

Polieren Sie anschließend die Spitze einer Pasteurpipette aus Glas einige Sekunden lang über einem Gasbrenner oder Bunsenbrenner, um die Öffnung etwas zu verkleinern. Verzweifeltes FCS, um die Spitze der Pipette zu beschichten. Dissoziieren Sie dann die Zellen mechanisch mit der feuerpolierten und FCS-beschichteten Pasteur-Pipette, indem Sie auf und ab pipettieren und dabei darauf achten, dass keine Blasen entstehen.

Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 340 mal G. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, fügen Sie dann einen Millimeter Proliferationsmedium hinzu und resuspendieren Sie die Zellen mit einer Pipette. Entfernen Sie das PBS von der mit Poly-D-Lysin vorbehandelten Platte. Zeichnen Sie dann ein Zeichen auf die Unterseite der Platte, das als Referenz zur Bestimmung des Nullpunkts verwendet werden kann.

Nachdem Sie die Zellen zum zweiten Mal in Proliferationsmedium resuspendiert haben, bereiten Sie eine Eins-zu-Eins-Verdünnung der Zellsuspension mit einer 0,4%igen Trypanblaulösung vor. In die Objektträger der Zählkammer laden und die Anzahl der ungefärbten lebensfähigen Zellen zählen. Nicht lebensfähige Zellen werden blau angezeigt.

Verdünnen Sie die Zellen in Proliferationsmedium, um 10 bis sechste Zellen pro Millimeter zu erhalten. Geben Sie 500 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Um Retrovirus-transduzierte Zellen abzubilden, legen Sie die Gewebekulturplatte in eine Bildgebungskammer, die mit Temperatur- und Kohlendioxidreglern verbunden ist, um die Zellen unter konstanten Bedingungen von 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zu halten.

Wählen Sie eine Position in der xy-Achse, die als Nullpunkt dienen soll, und kalibrieren Sie den Nullpunkt. Wählen Sie 10 bis 15 Positionen pro Vertiefung aus, die mit 10-facher Vergrößerung abgebildet werden sollen. Stellen Sie die Software so ein, dass Phasenkontrastbilder alle fünf Minuten und Fluoreszenzbilder alle drei Stunden erforderlich sind, um die Phototoxizität zu verringern.

Überprüfen und justieren Sie den Fokus in den ersten drei Stunden des Experiments, da er sich ändern kann, während sich die Temperatur ausgleicht. Beenden Sie die Erfassung nach sieben Tagen und fahren Sie mit der Immunzytochemie nach der Bildgebung fort. Starten Sie die Zellverfolgungssoftware und wählen Sie einen Benutzernamen.

Klicken Sie auf Wählen Sie Ihren Benutzernamen und fahren Sie fort. Durchsuchen Sie den tTt-Arbeitsordner und wählen Sie ihn aus, um Abstammungsbäume, Statistiken und exportierte Bilder zu speichern. Wählen Sie als Nächstes das Experiment aus, das analysiert und geladen werden soll.

Wenn die Bilder zuvor vom tTt-Konverter konvertiert wurden, klicken Sie auf Protokolldateikonverter und geben Sie die Anzahl der Sekunden zwischen zwei aufeinanderfolgenden Zeitpunkten im Fenster des Protokolldateikonverters an. Klicken Sie auf Protokolldateien für das gesamte Experiment konvertieren. Wählen Sie die gewünschten Bilder manuell oder über die im Programm angezeigte Option aus und laden Sie sie.

Wählen Sie Datei, Öffnen, Neue Kolonie. Klicken Sie auf Tracking, gefolgt von Tracking starten, um das Tracking an einer ausgewählten Position zu starten. Ein Filmfenster wird angezeigt.

Wählen Sie die Zelle mit dem Tracking-Kreis aus und drücken Sie die Nulltaste. Die Software wechselt zum nächsten Frame. Positionieren Sie den Laufkreis weiterhin mit der Maus um die Spurzelle und klicken Sie in jedem Bild auf Null, um der Zelle eine Spurmarkierung hinzuzufügen.

Verwenden Sie die Tasten eins und drei, um zum vorherigen oder zum nächsten Frame zu wechseln. Um eine Spurmarkierung zu löschen, klicken Sie einfach auf die richtige Position zum Markieren und drücken Sie die Null. Wenn sich die Zelle geteilt hat, wählen Sie Laufweite, Grund stoppen, Division und verfolgen Sie eine Tochterzelle weiter, indem Sie eine der Zellen im Fenster des Zelleditors auswählen, dann Laufweite und Nachverfolgung starten.

Um die zweite Tochterzelle zu verfolgen, wählen Sie sie im Zelleditor aus und drücken Sie F2. Wenn die Zelle während der Videomikroskopie abgestorben ist, wählen Sie Apoptose. Wenn die Zelle das Beobachtungsfeld verlässt oder sich mit benachbarten Zellen vermischt, was die Nachverfolgung ausschließt, wählen Sie verloren aus. Um das Tracking zu stoppen und später fortzufahren, klicken Sie auf Unterbrechen.

Im Fenster des Zelleneditors wird während der Verfolgung ein Baum generiert. Um den Abstammungsbaum zu speichern, wählen Sie im Fenster des Zelleneditors Datei, Speichern, Aktueller Baum aus. Um den Film mit den Tracking-Daten zu exportieren, deaktivieren Sie den Tracking-Modus und wählen Sie im Filmfenster die Option "Film exportieren".

Legen Sie den Formatbereich der Frames, die Anzahl der Frames pro Sekunde und die Bitrate fest. Klicken Sie auf Export starten. Die folgenden Mikroaufnahmen zeigen den Phasenkontrast in GFP-Fluoreszenzbildern einer primären Zellkultur der Großhirnrinde.

Die GFP-Expression ist in den ersten Stunden der Bildgebung nicht vorhanden. Die Anzahl der GFP-exprimierenden Zellen nimmt mit der Zeit zu und die Intensität der GFP-Fluoreszenz nimmt zu, wie der gelbe Pfeil in diesen Bildern zeigt. Dieses Bild mit höherer Vergrößerung im Boxed-Bereich des vorherigen Bildes zeigt die GFP-exprimierenden Zellen im Detail.

Diese Phasenkontrastbilder zeigen ein Beispiel für die Zellteilung. Hier ist die Aufrundung der Vorläuferzellen zu sehen, gefolgt von der Verengung der Zellmembran und schließlich der Vervollständigung der Mitose. Dies ist ein Beispiel für einen Abstammungsbaum mit einer einzelnen Zelle.

Farbige Pfeile zeigen verschiedene Arten der Zellteilung an, symmetrische proliferative Teilung ist durch den gelben Pfeil dargestellt. Die asymmetrische Teilung wird durch den blauen Pfeil angezeigt. Die symmetrische terminale Teilung wird durch den roten Pfeil dargestellt und X zeigt den Zelltod an.

Die Zahlen geben die Zellzykluslänge der Vorläuferzellen an. Diese Technik kann in ein bis zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Zellverhalten während der Progression der Zelllinie von Stammzellen zu Neuronen oder Gliazellen zeigen können.