Name: Bildgebung des primären Hirnrinde Zellen unter Verwendung einer 2D Kultursystem zu leben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Erfahren Sie die Live-Bildgebung von Zellen der primären Hirnrinde mittels Zeitraffer-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der Entwicklung von neuralen Stammzellen zu Neuronen und Gliazellen über längere Zeiträume.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) und FAPERN (Fundação de Amparo eine Pesquisa Do Rio Grande do Norte).

Alle Versuche mit lebenden Tieren, die in diesem Protokoll beschrieben werden, werden gemäß den nationalen und internationalen Gesetzen durchgeführt und wurden vom lokalen University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN) unter der Lizenz 009/2014 genehmigt. Das folgende Protokoll wird in einer sterilen Umgebung durchgeführt. Vertrautheit mit grundlegenden Zellkulturen wird erwartet.
1. Dorsolaterale Telencephalon-Mikrodissektion
<ol>
	<li>Bereiten Sie das Seziermedium (100 mL) vor: 98,5 mL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), 0,5 mL 5 M HEPES pH 7,4, 1 mL Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten/mL und 10.000 μg/mL).</li>
	<li>Sterilisieren Sie das Dissektionsmedium mit einem Filter.</li>
	<li>Entnahme von embryonalen Embryonen am Tag 14 (E14) einer trächtigen Maus C57/Bl6 (Mus musculus) unter Narkose mit Isofluran. 
	HINWEIS: Betrachten Sie E0 als den Tag der Erkennung des Vaginalplugs. Die Dissektion sollte spätestens 1 Stunde nach der Entnahme aus der trächtigen Maus abgeschlossen sein. Dieses Protokoll gilt auch für die Embryonen E11-E17.</li>
	<li>Entnahme der Embryonen durch Hysterektomie unter sterilen Bedingungen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Embryonen in eine Petrischale mit kaltem Präpariermedium (4 °C).</li>
	<li>Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel, indem Sie entlang der Längsfissur schneiden. Die Anzahl der Embryonen variiert in der Regel zwischen fünf und zehn. Jedes E14-Gehirn liefert etwa 2 x 106 Zellen, einschließlich Vorläuferzellen und postmitotischer Neuronen (Verhältnis 1:1) 
	HINWEIS: Verwenden Sie das Stereomikroskop für die folgenden Schritte.</li>
	<li>Entfernen Sie die Hirnhäute mit einer Präparierzange. Teile das Telencephalon in der Mitte, um die Hemisphären zu trennen. Um das dorsolaterale Telencephalon zu isolieren, schneiden Sie mit einer Dissektionszange entlang der dorsomedialen Kurve und der pallial-subpallialen Grenze. Das dorsolaterale Telencephalon wird in ein 2-ml-Röhrchen mit Kaltdissektionsmedium (4 °C) überführt, bis alle Gehirne präpariert sind.</li>
</ol>
2. Zelldissoziation und Beschichtung
<ol>
	<li>Bereiten Sie das Proliferationsmedium vor (50 ml DMEM + 10 % FCS): 44 ml Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 5 ml fötales Kälberserum (FCS), 0,5 ml 40 % Glukose, 0,5 ml Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten/ml und 10.000 μg/ml). Sterilisieren Sie das Proliferationsmedium.</li>
	<li>Bereiten Sie das Differenzierungsmedium vor (50 mL DMEM + 2 % B27): 48 mL DMEM, 1 mL B27, 0,5 mL 40 % Glucose, 0,5 mL Penicillin/Streptomycin (10.000 Einheiten/ml und 10.000 μg/ml). Filtrieren Sie das Differenzierungsmedium.</li>
	<li>Nach der Mikrodissektion des dorsolateralen Telencephalons von E14-Mäusen wird das Röhrchen mit dem gesammelten Gewebe und dem Kaltdissektionsmedium (für 5 min bei 4 °C, 340 x g) zentrifugiert, um das Gewebe auszufällen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und fügen Sie 1 ml vorgewärmtes (37 °C) Trypsin-EDTA (0,05 %) für den chemischen Aufschluss hinzu. 15 Minuten bei 37 °C inkubieren. 2 ml Proliferationsmedium hinzufügen, um die Trypsinaktivität zu stoppen.</li>
	<li>Polieren Sie die Spitze einer Pasteurpipette aus Glas über einem Gasbrenner oder Bunsenbrenner einige Sekunden lang, um die Öffnung etwas zu verkleinern. Waschen Sie die Pipette, indem Sie FCS absaugen, um die Spitze zu beschichten. Um Blasen zu vermeiden, dissoziieren Sie die Zellen mechanisch mit einer feuerpolierten und FCS-beschichteten Pasteur-Pipette.</li>
	<li>Die Zellen zentrifugieren (5 min bei 4 °C, 340 x g). Überstand mit einer Pipette entfernen. Geben Sie 1 ml Proliferationsmedium hinzu und resuspendieren Sie die Zellen mit einer Pipette. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 1:1-Verdünnung der Zellsuspension mit einer 0,4%igen Trypanblau-Lösung vor. Nicht lebensfähige Zellen werden blau angezeigt. Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen (ungefärbt) mit einer Neubauer-Kammer.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Zellen in Proliferationsmedium, um 106 Zellen/ml zu erhalten. Geben Sie 500 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte (ca. 2,5 × 105 Zellen/cm2). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2, 
	HINWEIS: Verwenden Sie keine Abdeckgläser aus Glas, da diese sich während des Versuchs bewegen und das Betrachtungsfeld verändern können. Alternativ können Sie auch Gewebekulturplatten mit Glasboden verwenden. 
	HINWEIS: Wenn Sie keine mit Zellkulturen behandelten multidished Platten verwenden, ist es wichtig, Ihre Platten 2 h bei 37 °C mit Poly-D-Lysin (50 μg/ml) vorzubehandeln. PDL-behandelte Platten können nach dem Waschen mit destilliertem Wasser bei 4 °C gelagert werden.</li>
</ol>
3. Retrovirale vermittelte Transfektion
HINWEIS: Dies ist eine einfache Methode, um nur Vorläuferzellen zu transfizieren. Es können jedoch auch andere virale Vektoren oder chemische/elektrische Transfektion verwendet werden, um Gene von Interesse in kultivierte Zellen einzufügen.
<ol>
	<li>Um die Genexpression zu manipulieren und Zellen mit fluoreszierenden Reporterproteinen zu markieren, fügen Sie Retroviren hinzu, die Plasmide mit Genen von Interesse tragen, 2 h nach der Zellbeschichtung. 
	HINWEIS: Retrovirale Vektoren integrieren sich nur in das Genom von sich teilenden Zellen. Daher ist es wichtig, Zellen zu infizieren, wenn die Proliferation hoch ist. 
	HINWEIS: Wir verwendeten ein Plasmid, das die Beta-Aktin/CMV-Fusionssequenz (CAG) und eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) enthält, gefolgt von der kodierenden Sequenz für das grün fluoreszierende Protein (GFP), die als pCAG-IRES-GFP44 bezeichnet wird. Gene von Interesse konnten zwischen dem CAG-Promotor und der IRES-Sequenz kloniert werden37.</li>
	<li>Verdünnen Sie das Retrovirus in einem Differenzierungsmedium, um die gewünschte Anzahl von Partikeln pro ml zu erhalten. In jede Vertiefung werden 500 μl Differenzierungsmedium mit Retrovirus gegeben. 
	HINWEIS: Die Menge der verwendeten Retroviren hängt von seinem Titer ab und sollte so berechnet werden, dass 50 bis 100 infizierte Zellen pro Vertiefung erhalten werden. Dieser Titer ermöglicht die Identifizierung isolierter GFP-exprimierender Klone, deren Verwandtschaft durch die Verfolgung von Phasenkontrastbildern weiter bestätigt werden kann (siehe Abschnitt 6). Die Titration des Retrovirus sollte mit der gleichen Zellpopulation durchgeführt werden45.</li>
</ol>
4. Zeitraffer-Videomikroskopie
HINWEIS: Dieser Schritt erfordert ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit Inkubationskammer (siehe Materialtabelle).
<ol>
	<li>Nach der Retrovirus-Infektion wird die Gewebekulturplatte in einen Inkubator gestellt, der mit Temperatur- und CO2 -Reglern verbunden ist. 
	HINWEIS: Das Vorheizen der Kammer für 3 Stunden vor Beginn der Bildgebung kann dazu beitragen, Drift und Unschärfe während der Aufnahme zu minimieren. 
	HINWEIS: Die Kammer sollte die Zellen unter konstanten Bedingungen von 37 °C und 5 % CO2 halten.</li>
	<li>Wählen Sie eine Position in der XY-Achse, die als Nullpunkt dienen soll (XY = 0). Dies ermöglicht eine Referenz, um die Positionen in Zukunft wieder zu finden, z.B. nach einer post-imagingären Immunzytochemie (siehe Abschnitt 5). 
	HINWEIS: Es ist ratsam, ein Zeichen in die Platte zu zeichnen, das als Referenz für die Bestimmung des Nullpunkts verwendet werden kann.</li>
	<li>Wählen Sie die Positionen aus, die mit 10-facher Vergrößerung abgebildet werden sollen. 
	HINWEIS: Wählen Sie 10-15 Positionen pro Vertiefung, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, retroviral transfizierte Zellen zu beobachten. 
	HINWEIS: Objektive mit großer Reichweite (20x oder 40x) können verwendet werden, um Bilder mit höherer Auflösung zu erhalten. Abhängig vom Arbeitsabstand der Objektive können Glasbodenplatten erforderlich sein.</li>
	<li>Nehmen Sie alle 5 Minuten Phasenkontrastbilder und alle 3 Stunden Fluoreszenzbilder auf, um die Phototoxizität zu verringern. Überprüfen und justieren Sie den Fokus in den ersten 3 Stunden des Experiments, da er sich ändern kann, während sich die Temperatur ausgleicht. Überprüfen und justieren Sie den Fokus täglich. 
	HINWEIS: Wir beobachten, dass der Fokus nach den ersten 24 Stunden stabil wird. Es empfiehlt sich jedoch, den Fokus zu überwachen. Alternativ können Sie auch ein softwarebasiertes Autofokus-System verwenden.</li>
	<li>Nach 7 Tagen beenden Sie die Erfassung und fahren Sie mit der Immunzytochemie nach der Bildgebung fort (siehe Abschnitt 5).</li>
	<li>Nach der Immunzytochemie setzen Sie die Platte wieder in den Mikroskop-Inkubator ein, finden den Nullpunkt, setzen XYZ = 0 zurück und laden das Experiment mit gespeicherten Positionen neu. Erfassen Sie die Fluoreszenzbilder jeder Position mit geeigneten Fluoreszenzfiltern.</li>
</ol>
5. Immunzytochemie nach der Bildgebung
<ol>
	<li>Nach 7 Tagen in Kultur fixieren Sie die Zellkultur mit 4 % Paraformaldehyd (PFA)-Fixiermittel für 15 min bei Raumtemperatur. 
	ACHTUNG: PFA ist giftig und sollte in einem chemischen Abzug gehandhabt werden.</li>
	<li>Mit 0,5 mL PBS 0,1 M 5 Min. spülen. 3 Mal wiederholen.</li>
	<li>Inkubieren Sie über Nacht in Primärantikörpern bei 4 °C in 0,5 % Triton und 10 % normalem Ziegenserum in PBS 0,1 M. 
	HINWEIS: Verwenden Sie einen Anti-Microtubulie Associated Protein 2 (MAP2)-Antikörper, um den neuronalen Phänotyp zu bestätigen (Maus-IgG1, 1:1.000) und Anti-GFP, um die transduzierten Zellen zu markieren (Hühner-Antikörper, 1:500). Andere Antikörper können zum Nachweis von Vorläuferzellen oder Gliazellen verwendet werden.</li>
	<li>Mit 0,5 mL PBS 0,1 M 5 Min. spülen. 3 Mal wiederholen.</li>
	<li>Sekundärantikörper in 0,5 % Triton und 10 % normalem Ziegenserum in PBS 0,1 M verdünnen und 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Empfohlene Verdünnung: 1:1.000.</li>
	<li>Mit 0,5 mL PBS 0,1 M 5 Min. spülen. 3 Mal wiederholen.</li>
	<li>Für die Zellkernfärbung inkubieren Sie die Zellen 5 Minuten lang mit 0,1 μg/ml 4′6′-diamino-2-phenylindon (DAPI) in PBS 0,1 M.</li>
	<li>Mit 0,5 mL PBS 0,1 M 5 Min. spülen. 3 Mal wiederholen.</li>
	<li>Bewahren Sie die Zellen in PBS 0,1 M auf und schützen Sie sie vor Licht (z. B. wickeln Sie die Platte mit Folie ein).</li>
</ol>
6. Verfolgung von Zellen
HINWEIS: Hier beschreiben wir kurz die Hauptschritte zur Analyse von Zeitraffer-Videomikroskopie-Daten mit der Software The Tracking Tool (tTt), die unter dem Link in der Materialtabelle verfügbar ist.
HINWEIS: Wenn die Bildaufnahme mit einer anderen Software durchgeführt wird, importieren Sie die Bilddaten mit dem tTt Converter, der im tTt-Installationsprogramm verfügbar ist (Link in der Materialtabelle). Es werden nur die Bildformate png, tif oder jpg akzeptiert. Befolgen Sie die Schritte unter Abbildung 1 A - B, nachdem Sie den tTt-Konverter gestartet haben.
<ol>
	<li>Starten Sie die Software tTt und wählen Sie einen Benutzernamen aus. Klicken Sie auf die Schaltflächen "Benutzer hinzufügen" und "Weiter" (Abbildung 2A). Durchsuchen Sie den "TTTWorkFolder" (Abbildung 2B) und wählen Sie ihn aus. Abstammungsbäume, Statistiken und exportierte Bilder werden in diesem Ordner gespeichert. Wählen Sie anschließend das zu analysierende Experiment aus und laden Sie es (Abbildung 2B).</li>
	<li>Wenn die Bilder zuvor vom tTt Converter konvertiert wurden, klicken Sie auf "LogFileConverter" (Abbildung 3A) und geben Sie die Anzahl der Sekunden zwischen zwei aufeinanderfolgenden Zeitpunkten im LogFileConverter-Fenster an. Klicken Sie auf "Protokolldateien für gesamtes Experiment konvertieren" (Abbildung 1C).</li>
	<li>Wählen Sie in einer Liste von Bildern, die im tTt-Fenster angezeigt werden, die gewünschten Bilder aus, indem Sie sie manuell laden oder die im Programm angezeigte Option verwenden. Laden Sie Bilder (Abbildung 3).</li>
	<li>Wählen Sie Datei > Öffnen Sie > Neue Kolonie. Klicken Sie auf "Tracking", gefolgt von "Tracking starten", um das Tracking an einer ausgewählten Position zu starten.</li>
	<li>Ein Filmfenster wird angezeigt (Abbildung 4). Markieren Sie die Zelle mit dem Tracking-Kreis und drücken Sie die Taste 0. Die Software wechselt zum nächsten Frame. Positionieren Sie den Tracking-Kreis weiterhin mit der Maus um die getrackte Zelle und klicken Sie in jedem Frame auf 0, um eine Spurmarkierung auf der Zelle hinzuzufügen.</li>
	<li>Verwenden Sie die Tasten 1 und 3, um zum vorherigen bzw. nächsten Frame zu wechseln. Um eine Spurmarkierung zu löschen, klicken Sie einfach auf die richtige Position zum Markieren und drücken Sie 0.</li>
	<li>Wenn die Zelle geteilt ist, wählen Sie die Schaltfläche "Division" (rotes Rechteck bei Abbildung 4). Fahren Sie mit der Verfolgung einer Tochterzelle fort, indem Sie Umschalt+D drücken. Um die zweite Tochterzelle zu verfolgen, wählen Sie sie im Zelleditor aus und drücken Sie F2.</li>
	<li>Wenn die Zelle während der Videomikroskopie abgestorben ist, wählen Sie "Apoptose" (blaues Rechteck bei Abbildung 4). 
	HINWEIS: Obwohl die Software das Ereignis als "Apoptose" bezeichnet, können andere Mechanismen für den Zelltod verantwortlich sein.</li>
	<li>Wenn die Zelle das Beobachtungsfeld verlässt oder sich mit benachbarten Zellen vermischt, was eine Verfolgung ausschließt, wählen Sie "verloren" (grünes Rechteck bei Abbildung 4).</li>
	<li>Um die Verfolgung zu stoppen und später fortzusetzen, klicken Sie auf "interrupt" (violettes Rechteck bei Abbildung 4). 
	HINWEIS: Im Fenster des Zelleneditors wird während der Verfolgung ein Baum generiert. Um den Herkunftsbaum zu speichern, wählen Sie Datei > > aktuellen Baum speichern (im Fenster Zelleneditor).</li>
	<li>Um die Verfolgung einer anderen Zelle zu starten, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Zelle oder wählen Sie die Zelle mit der linken Maustaste aus und klicken Sie auf Tracking > Tracking starten.</li>
	<li>Um den Film mit den Tracking-Daten zu exportieren, sollte sich die Software nicht im "Tracking-Modus" befinden. Um den Tracking-Modus zu deaktivieren, führen Sie Schritt 6.10 aus. Wählen Sie im Fenster "Film" die Option "> Film exportieren" aus. Richten Sie das Format, den Bereich der Frames, die Anzahl der Frames pro Sekunde und die Bitrate ein. Klicken Sie auf "Export starten".</li>
</ol>
7. Quantifizierungen
HINWEIS: Mit den Videomikroskopiedaten können mehrere Messungen durchgeführt werden46. Hier beschreiben wir drei Möglichkeiten, die später im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" beispielhaft dargestellt werden.
<ol>
	<li>Quantifizieren Sie das Zellüberleben für jede Zelllinie, indem Sie die Anzahl der zu verschiedenen Zeitpunkten lebenden Zellen durch die Gesamtzahl der Zellen dividieren, die vor Erreichen dieser Zeitpunkte innerhalb einzelner Klone erzeugt wurden37.</li>
	<li>Quantifizieren Sie den Anteil des symmetrischen Vorläufers (SP, beide Tochterzellen vermehren sich weiter), des asymmetrischen (A, eine Tochterzelle vermehrt sich weiter und die andere wird postmitotisch) oder des symmetrischen Terminals (ST, beide Tochterzellen werden postmitotisch)15,38.</li>
	<li>Messen Sie die Länge des Zellzyklus, indem Sie die Zeitspanne der proliferierenden Zellen zwischen ihrer Entstehung und Teilung berechnen15.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Echtzeit-Beobachtung der primären Hirnrinde Zellen ermöglicht die Analyse der Zellproliferation, Zellteilung, Zellzyklus Länge, Zelldifferenzierung und Zelle überleben3,14,15,37. Noch wichtiger ist, ermöglicht es das Studium der einzelligen Abstammungen, führt zur Identifizierung von den Zwischenphasen während der Progression von NSCs auf Neuronen3erlassen. Schließlich i...

Neurale Stammzellen (NSC) generieren Neuronen und Macroglial Zellen während der Entwicklung der Großhirnrinde. Am Anfang-Kortikogenese NSCs durchlaufen mehrere Runden der symmetrischen Zellteilung, und erweitern Sie den Stammvater Pool. Teilen Sie dann die NSCs asymmetrisch um Neuronen direkt oder indirekt über Zwischenprodukte1zu generieren. Nur bei wechseln Mitte - zu spät-Kortikogenese, Stammväter um Astrozyten und Oligodendrozyten2,3,4zu generieren. Die komplette Mechanismen, die Zell-Proliferation und Differenzierung sowie der Beitrag der Schicksal eingeschränkt Stammväter zur Generation der einzigartige Arten von Neuronen oder Macroglial Zellen steuern bleiben jedoch eine Angelegenheit der intensiven Debatte4,5,6. Das Potenzial der einzelnen kortikalen NSCs, Neuronen und Astrozyten, Oligodendrozyten generieren wurde ausgiebig studiert in Vitro und in Vivo mit einer Vielzahl von Techniken wie: live-imaging in einzellige Kulturen7,8,9,10,11,12,13; Live-imaging in hoher Dichte Kulturen Kulturen3,14,15; Live-imaging Slice Kulturen16,17,18; klonale Analyse mit viralen Vektor-vermittelte genetische Kennzeichnung in hoher Dichte Kulturen14,15,19,20,21; klonale Analyse in Vivo mit Retroviren22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; und klonale Analyse in Vivo mit transgenen Tieren34.
Jede dieser Techniken stellt vor- und Nachteile. Zum Beispiel ist in Vivo Linie Ablaufverfolgung anfällig für die ZUSAMMENGEFASSUNG und splitting Fehler3, führt zu widersprüchlichen Schlussfolgerungen über das Potenzial der einzelnen kortikalen Vorfahren. Darüber hinaus sowohl in Vitro und in Vivo Studien anhand der Kennzeichnung von Vorläuferzellen zu frühen Zeitpunkten und posterior Analyse der Zelle Linien kann durch das unerkannt Auftreten von Zelltod während Abstammung-Progression35beeinflusst werden. Daher darf ein geeignetes System, das Potenzial der einzelnen NSCs zu analysieren die Identifikation aller Zellen generiert sowie die entsprechenden Charakterisierung der Zelle Schicksale innerhalb der Linie. Kombination von primären Zellkulturen und live Imaging ermöglicht diese Einstellung. Mit einzelligen Kultur und Time-Lapse video-Mikroskopie, zeigten Tempel Et Al. den Schalter in der Abstammung der einzelnen Großhirnrinde Stammväter von Neurogenese, Gliogenesis11. Später benutzt sie das gleiche System um zu zeigen, dass verschiedene Arten von Neuronen aus einer einzigen kortikalen Stammvater12generiert werden. Dieses System stellt jedoch eine wichtige Einschränkung: nur 1 % der kortikalen Vorfahren isoliert am frühen Kortikogenese Klone von 4 oder mehr Nachkommen9generieren. Nach der Zugabe von FGF2 erhöht die Frequenz der Zellen, die Erzeugung von 4 oder mehr Zellen auf ca. 8-10 %9. Dennoch ist diese Zahl zu klein, man bedenkt, dass praktisch alle kortikalen Stammväter proliferative in diesem Stadium. Darüber hinaus können nicht die möglichen Auswirkungen der FGF2 auf Schicksal-Spezifikation36auszuschließen. Um diese Einschränkungen zu umgehen, verwendet wir High-Density-Zellkulturen, die unterstützen die Verbreitung beider ventrikuläre (Pax6-Ausdruck) und subventricular (Tbr2-Ausdruck) kortikale Stammväter15. Darüber hinaus hat die Echtzeit-Beobachtung dieser Kulturen gezeigt, dass einige Funktionen der NSC Abstammung Progression unter diesen Bedingungen, wie z. B. Art der Zellteilung, Verlängerung des Zellzyklus, Potenzial einzelner Zellen, Neuronen und Glia, unter anderem zu generieren3,15reproduziert werden. Vor kurzem haben wir auch dieses System verwendet, um zu zeigen, dass das Überleben der Zellen von unreifen Großhirnrinde Neuronen in Mäusen37CREB-Signalisierung beeinflusst werden. So glauben wir, dass Time-Lapse Video-Mikroskopie des primären murinen Großhirnrinde Zellen in hoher Dichte angebaut ist ein leistungsstarkes und zugänglichen Tool, zellulären und molekularen Mechanismen der Zellzyklus Progression, Zellteilung, Überleben der Zellen und Zellen Schicksal Spezifikation zu studieren. Letzteres kann erreicht werden mit transgenen Tieren, so dass die Identifizierung von spezifischen Zelle Schicksale auf Echtzeit38,39,40 oder die Verwendung von Post-imaging Immunocytochemistry3,38,41,42.
Hier bieten wir eine Schritt für Schritt Protokoll zur primären Hirnrinde Zellkultur Unterstützung der Verbreitung von NSCs und die nachfolgende Generation von Neuronen und Macroglial Zellen vorbereiten. Wir diskutieren auch die Verwendung von Retroviren vermittelte Transfektion, Genexpression einzelner Zellen zu manipulieren, die identifiziert und Ebene der Einzeller mit Time-Lapse video Mikroskopie nachverfolgt werden können. Dieses Protokoll kann zur primären Hirnrinde Zellen isoliert vom Anfang bis zum Ende des Kortikogenese bei Nagetieren zu studieren können, ein paar Anpassungen jedoch nach der Stufe14. NSCs, die isoliert von anderen Quellen können auch mit Time-Lapse video Mikroskopie 2D Kulturen studiert werden, aber das geeignete Kultivierung System festgelegt werden, durch den Vergleich der Zelle Verhalten in Vitro und in Vivo38,43.

<table><tbody><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>14175129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR International Ltd.</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Sigma</td><td>792632</td> Anti-MAP2, <td></td></tr><tr><td>Maus</td><td>Sigma</td><td>M4403</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP Huhn</td><td>Aves</td><td>0511FP12</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus Alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Huhn Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tTt</td><td>ETH Zürich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellbeobachtermikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>The Tracking Tool (tTt) Software</td><td></td><td>https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html Download-Link</td><td></td></tr></tbody></table>

bildgebung des primären hirnrinde zellen unter verwendung einer 2d kultursystem zu leben

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Während der Großhirnrinde Entwicklung durchlaufen Vorläuferzellen mehrere Runden von symmetrischen und asymmetrischen Zellteilungen, neue Vorfahren oder postmitotischen Neuronen zu generieren. Später wechseln Sie einige Stammväter in ein Gliogenic Schicksal, Hinzufügen der Astrozyten und Oligodendrozyt Bevölkerung. Mit Time-Lapse Video-Mikroskopie von primären Hirnrinde Zellkulturen, ist es möglich, die zellulären und molekularen Mechanismen, die Kontrolle der Zellteilung und Zellzyklus-Parameter der Vorläuferzellen zu studieren. In ähnlicher Weise kann das Schicksal der postmitotischen Zellen mit fluoreszierenden Reporter zellspezifische Proteine oder Post-imaging Immunocytochemistry untersucht werden. Noch wichtiger ist, können alle diese Funktionen Ebene der einzelligen, ermöglicht die Identifizierung von Vorfahren verpflichtet die Generation von bestimmten Zelltypen analysiert werden. Manipulation der gen-Expression kann auch mit viral-vermittelte Transfektion, ermöglicht die Untersuchung der Zelle-autonome und Zelle-nichtautonomen Phänomene durchgeführt werden. Schließlich ermöglicht die Verwendung von fluoreszierenden Fusionsproteine die Studie von symmetrischen und asymmetrischen Verteilung der ausgewählten Proteine während der Teilung und die Korrelation mit dem Schicksal der Tochterzellen. Hier beschreiben wir die Time-Lapse Video-Mikroskopie-Methode, um Bild primären Hirnrinde murinen Zellen für bis zu mehreren Tagen und die Art der Zellteilung, Zellzyklus Länge und Schicksal der neu erzeugten Zellen zu analysieren. Wir beschreiben auch eine einfache Methode um transfizieren Vorläuferzellen, die Gene von Interesse zu manipulieren oder einfach beschriften Zellen mit Reporter Proteine angewendet werden können.

Primärkulturen von Zellen der Großhirnrinde, isoliert aus Embryonen am Tag E14, enthalten sowohl Vorläufer- als auch neuronale Zellen. Während der Bildaufnahmezeit durchlaufen die Vorläuferzellen mehrere Runden der Zellteilung, wodurch die Anzahl der Zellen zunimmt (Abbildung 5 und Videodatei 1).
Die retrovirale Transfektion weniger Vorläuferzellen ermöglicht die Identifizierung von...

Live Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur zelluläre Verhaltensweisen in Echtzeit zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Time-Lapse Video-Mikroskopie des primären Hirnrinde Zellen, die eine detaillierte Untersuchung der Phasen verordnet während der Linie Weiterentwicklung von primäre neurale Stammzellen zu differenzierten Neuronen und Glia ermöglichen.

Bildgebung des primären Hirnrinde Zellen unter Verwendung einer 2D Kultursystem zu leben

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, Zellverhalten während der Linienentwicklung von neuronalen Stammzellen zu Neuronen oder glialen Zellen zu beobachten. Diese Methode kann dabei helfen, offene Fragen im Bereich der neurodevelopmentalen Forschung zu klären, beispielsweise zur Rolle symmetrischer und asymmetrischer Zellteilungen, zur Verlängerung der Zellzyklusdauer sowie zu Zellwachstumsraten. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Beobachtung von Zelllinien über längere Zeiträume hinweg ermöglicht.Dies ermöglicht die Beobachtung des Übergangs von Neurogenese zu Gliogenese innerhalb einer einzelnen Linie und einen direkten Vergleich von sublinearen neuronalen und glialen Vorläuferzellen. Entfernen Sie zunächst die Gehirne von 5 bis 10 e14-Embryonen in einer Petrischale mit kaltem Dissektionsmedium. Verwenden Sie eine Pinzette, um vorsichtig Haut und Schädel zu entfernen und die Gehirne zu isolieren.Arbeiten Sie unter dem Stereomikroskop und entfernen Sie mit einer anatomischen Pinzette die Hirnhäute. Anschließend teilen Sie das Telencephalon in der Mitte, um die Hemisphären zu trennen. Um das dorsolaterale Telencephalon zu isolieren, schneiden Sie entlang der dorsomedialen Krümmung sowie entlang der Grenze zwischen Pallium und Subpallium.Überführen Sie die dorsolateralen Telencephala in ein 2-mL-Röhrchen mit Dissektionsmedium auf Eis, bis alle Gehirne disseziert sind. Nach der Mikrodissektion des dorsolateralen Telencephalons wird das Gewebe in ein 15-mL-Konischglas gegeben. Anschließend wird das Röhrchen mit dem gesammelten Gewebe in kaltem Dissektionsmedium fünf Minuten bei vier Grad Celsius und 340 × g zentrifugiert, um das Gewebe zu pelletieren.Nach dem Zentrifugieren entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und geben 1 mL 37 Grad Celsius warmes 0,05 %iges Trypsin-EDTA zur chemischen Verdauung hinzu. Inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation geben Sie 2 mL Proliferationsmedium zu, um die Trypsin-Aktivität zu hemmen.Als Nächstes die Spitze einer Glas-Pasteurpipette einige Sekunden lang über einen Gasbrenner oder Bunsenbrenner glühen, um die Öffnung leicht zu verengen. Mit FCS absaugen, um die Pipettenspitze zu beschichten. Anschließend die Zellen mechanisch mit der feuerpolierten und mit FCS beschichteten Pasteurpipette durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren dissoziieren, wobei darauf geachtet werden muss, keine Blasen zu erzeugen.Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und 340 × g. Entfernen Sie das Überstandsmittel mit einer Pipette und geben Sie dann ein Milliliter Proliferationsmedium hinzu, um die Zellen mit einer Pipette erneut in Suspension zu bringen. Entfernen Sie das PBS von der vorbehandelten Platte mit Poly-D-Lysin. Zeichnen Sie anschließend eine Markierung auf den Boden der Platte, die als Referenz zur Bestimmung des Nullpunkts dienen kann.Nach der erneuten Suspension der Zellen im Proliferationsmedium bereiten Sie eine 1:1-Verdünnung der Zellsuspension unter Verwendung einer 0,4 %igen Trypanblau-Lösung vor. Geben Sie die Probe auf Zählkammerobjektträger auf und zählen Sie die Anzahl der ungefärbten vitalen Zellen. Nicht-vitale Zellen erscheinen blau.Verdünnen Sie die Zellen in Proliferationsmedium, um 10^6 Zellen pro Milliliter zu erhalten. Geben Sie 500 µl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 24-Loch-Gewebekulturplatte und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid. Um retrovirale transduzierte Zellen abzubilden, stellen Sie die Gewebekulturplatte in eine Imaging-Kammer, die mit Temperatur- und Kohlendioxid-Reglern verbunden ist, um die Zellen unter konstanten Bedingungen von 37 °C und 5 % Kohlendioxid zu halten.Wählen Sie eine Position in der xy-Ebene als Nullpunkt aus und kalibrieren Sie diesen. Wählen Sie 10 bis 15 Positionen pro Vertiefung aus, die mit 10-facher Vergrößerung abgebildet werden sollen. Stellen Sie die Software so ein, dass alle fünf Minuten Phasenkontrastbilder und alle drei Stunden Fluoreszenzbilder aufgenommen werden, um die Phototoxizität zu verringern.Überprüfen und justieren Sie die Fokussierung in den ersten drei Stunden des Experiments, da sie sich während der Temperaturangleichung verändern kann. Nach sieben Tagen beenden Sie die Datenaufnahme und fahren Sie mit der immunzytochemischen Nachbehandlung nach der Bildgebung fort. Starten Sie die Software zur Zellverfolgung und wählen Sie einen Benutzernamen.Klicken Sie auf „Wählen Sie Ihren Benutzernamen“ und fortfahren. Durchsuchen und wählen Sie den tTt-Arbeitsordner aus, um Stammbäume, Statistiken und exportierte Bilder zu speichern. Wählen Sie anschließend das Experiment aus, das analysiert und geladen werden soll.Wenn die Bilder zuvor mit dem tTt-Konverter konvertiert wurden, klicken Sie auf den Protokolldatei-Konverter und geben Sie die Anzahl der Sekunden zwischen zwei aufeinanderfolgenden Zeitpunkten im Fenster des Protokolldatei-Konverters an. Klicken Sie auf „Protokolldateien für gesamtes Experiment konvertieren“. Wählen Sie die gewünschten Bilder manuell aus und laden Sie sie, oder verwenden Sie die im Programm angezeigte Option.Datei auswählen, öffnen, neue Kolonie. Klicken Sie auf „Tracking“ und anschließend auf „Tracking starten“, um die Aufzeichnung an einer gewählten Position zu beginnen. Ein Videofenster wird angezeigt.Wählen Sie die Zelle mithilfe des Verfolgungskreises aus und drücken Sie die Null-Taste. Die Software wechselt zum nächsten Bild. Positionieren Sie weiterhin den Verfolgungskreis um die zu verfolgende Zelle mithilfe der Maus und klicken Sie in jedem Bild auf Null, um eine Spurmarkierung an der Zelle hinzuzufügen.Verwenden Sie die Tasten eins und drei, um zum vorherigen oder nächsten Bildschirm zu wechseln. Um eine Spur zu löschen, klicken Sie einfach auf die entsprechende Position und drücken Sie die Null. Wenn sich die Zelle geteilt hat, wählen Sie die Verfolgung, den Grund für die Unterbrechung, die Teilung aus und setzen Sie die Verfolgung einer Tochterzelle fort, indem Sie eine der Zellen im Zell-Editor-Fenster auswählen, dann wählen Sie Verfolgung, Start der Verfolgung.Um die zweite Tochterzelle zu verfolgen, wählen Sie sie im Zell-Editor aus und drücken Sie F2. Wenn die Zelle während der Videomikroskopie gestorben ist, wählen Sie Apoptose aus. Wenn die Zelle das Beobachtungsfeld verlässt oder sich mit benachbarten Zellen vermischt, sodass eine Verfolgung nicht mehr möglich ist, wählen Sie verloren aus. Um die Verfolgung vorübergehend zu unterbrechen und zu einem späteren Zeitpunkt fortzusetzen, klicken Sie auf unterbrechen.Im Fenster des Zell-Editors wird während der Verfolgung ein Baum generiert. Um den Linienbaum zu speichern, wählen Sie im Fenster des Zell-Editors Datei, Speichern, Aktueller Baum. Um den Film mit den Verfolgungsdaten zu exportieren, schalten Sie den Verfolgungsmodus aus und wählen im Filmfenster Film exportieren.Legen Sie den Formatbereich der Einzelbilder, die Anzahl der Einzelbilder pro Sekunde und die Bitrate fest. Klicken Sie auf „Export starten“. Die folgenden Mikrofotografien zeigen Phasenkontrast in GFP-Fluoreszenzbildern einer primären Zellkultur des Großhirnrinden.Die GFP-Expression fehlt während der ersten Stunden der Bildgebung. Die Anzahl der GFP-exprimierenden Zellen nimmt im Zeitverlauf zu, und die Intensität der GFP-Fluoreszenz steigt an, wie durch den gelben Pfeil in diesen Bildern angezeigt. Diese Aufnahme mit höherer Vergrößerung des markierten Bereichs des vorherigen Bildes zeigt die GFP-exprimierenden Zellen im Detail.Diese Phasenkontrastaufnahmen zeigen ein Beispiel der Zellteilung. Hier ist zu sehen, wie sich die Vorläuferzelle rundet, gefolgt von einer Einschnürung der Zellmembran und schließlich dem Abschluss der Mitose. Dies ist ein Beispiel für einen einzelnen Zelllinienstamm. Farbige Pfeile zeigen verschiedene Arten der Zellteilung: Die symmetrische proliferative Teilung ist durch den gelben Pfeil dargestellt. Die asymmetrische Teilung wird durch den blauen Pfeil angezeigt. Die symmetrische terminale Teilung ist durch den roten Pfeil gekennzeichnet, und ein X kennzeichnet den Zelltod.Die Zahlen geben die Dauer des Zellzyklus der Vorläuferzellen an. Diese Technik kann in ein bis zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellverhalten während der Zelllinienentwicklung von Stammzellen zu Neuronen oder glialen Zellen darstellen kann.

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

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