Name: Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Erfahren Sie ein Hochdurchsatz-Screening zur Identifizierung proteinbasierter Vererbung in Saccharomyces cerevisiae. Diese Methode ermöglicht die unvoreingenommene Untersuchung vieler Proteine auf dauerhafte phänotypische Merkmale.

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Wir danken Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She und Susan Lindquist für ihre Unterstützung bei der Entwicklung der Assays in diesem Papier sowie die Gutachter für ihre nachdenklichen Kommentaren verwendet.

<ol><li>Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions%2C+protein+homeostasis%2C+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity.</a> Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).</li>
<li>Byers, J. S., Jarosz, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pernicious+pathogens+or+expedient+elements+of+inheritance%3A+the+significance+of+yeast+prions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions.</a> PLoS Pathog. 10 (4), 1003992(2014).</li>
<li>Jarosz, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-kingdom+chemical+communication+drives+a+heritable%2C+mutually+beneficial+prion-based+transformation+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism.</a> Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).</li>
<li>True, H. L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion+provides+a+mechanism+for+genetic+variation+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity.</a> Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).</li>
<li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion%2C+Mod5%2C+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146 (3), 448-461 (2011).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+polymerization+underlies+signal+transduction+in+antiviral+immune+defense+and+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation.</a> Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).</li>
<li>Majumdar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+amyloid-like+oligomers+of+Drosophila+Orb2+in+the+persistence+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory.</a> Cell. 148 (3), 515-529 (2012).</li>
<li>Khan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloidogenic+Oligomerization+Transforms+Drosophila+Orb2+from+a+Translation+Repressor+to+an+Activator%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator.</a> Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).</li>
<li>Fioriti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Persistence+of+Hippocampal-Based+Memory+Requires+Protein+Synthesis+Mediated+by+the+Prion-like+Protein+CPEB3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3.</a> Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).</li>
<li>Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+affect+the+appearance+of+other+prions%3A+the+story+of+%5BPIN%28%2B%29%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)].</a> Cell. 106 (2), 171-182 (2001).</li>
<li>Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+identifies+prions+and+illuminates+sequence+features+of+prionogenic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins.</a> Cell. 137 (1), 146-158 (2009).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+chaperone+protein+Hsp104+in+propagation+of+the+yeast+prion-like+factor+%5Bpsi%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+].</a> Science. 268 (5212), 880-884 (1995).</li>
<li>Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Support+for+the+prion+hypothesis+for+inheritance+of+a+phenotypic+trait+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast.</a> Science. 273 (5275), 622-626 (1996).</li>
<li>Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BURE3%5D+as+an+altered+URE2+protein%3A+evidence+for+a+prion+analog+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">[URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 264 (5158), 566-569 (1994).</li>
<li>Sondheimer, N., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rnq1%3A+an+epigenetic+modifier+of+protein+function+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast.</a> Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).</li>
<li>Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amyloid-forming+peptide+from+the+yeast+prion+Sup35+reveals+a+dehydrated+beta-sheet+structure+for+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).</li>
<li>Glover, J. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9182769">Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae.</a> Cell. 89 (5), 811-819 (1997).</li>
<li>King, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-inducing+domain+2-114+of+yeast+Sup35+protein+transforms+in+vitro+into+amyloid-like+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104+catalyzes+formation+and+elimination+of+self-replicating+Sup35+prion+conformers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers.</a> Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).</li>
<li>Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+the+yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+by+guanidine+hydrochloride+is+the+result+of+Hsp104+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation.</a> Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).</li>
<li>Caudron, F., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+super-assembly+of+Whi3+encodes+memory+of+deceptive+encounters+by+single+cells+during+yeast+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship.</a> Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).</li>
<li>Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16793280">How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta].</a> Methods. 39 (1), 3-8 (2006).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+SUP35+gene+induces+de-novo+appearance+of+psi-like+factors+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).</li>
<li>Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heritable+switch+in+carbon+source+utilization+driven+by+an+unusual+yeast+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion.</a> Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).</li>
<li>Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+product+of+the+het-s+heterokaryon+incompatibility+gene+of+the+fungus+Podospora+anserina+behaves+as+a+prion+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).</li>
<li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).</li>
<li>Chakrabortee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsically+Disordered+Proteins+Drive+Emergence+and+Inheritance+of+Biological+Traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits.</a> Cell. 167 (2), 369-381 (2016).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaching+a+complete+repository+of+sequence-verified+protein-encoding+clones+for+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae.</a> Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).</li>
<li>Swain, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+time+derivatives+including+cell+growth+rates+using+Gaussian+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes.</a> Nat Commun. 7, 13766(2016).</li>
<li>Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+prion-like+element+converts+wild+fungi+from+metabolic+specialists+to+generalists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists.</a> Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
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<li>Formosa, T., Nittis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressors+of+the+temperature+sensitivity+of+DNA+polymerase+alpha+mutations+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).</li>
<li>Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+proteome+turnover+analyses+of+the+Yeasts+S.+cerevisiae+and+S.+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe.</a> Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).</li>
<li>Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLAAC%3A+a+web+and+command-line+application+to+identify+proteins+with+prion-like+amino+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition.</a> Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>Rogoza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Mendelian+determinant+%5BISP%2B%5D+in+yeast+is+a+nuclear-residing+prion+form+of+the+global+transcriptional+regulator+Sfp1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+adaptive+conduits+of+memory+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Prions as adaptive conduits of memory and inheritance.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).</li>
<li>Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+variations+in+an+infectious+protein+determine+prion+strain+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences.</a> Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).</li>
<li>Tanaka, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protein+transformation+protocol+for+introducing+prions+into+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).</li>
<li>Roberts, B. T., Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+activity%3A+a+prion+that+propagates+by+covalent+autoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation.</a> Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).</li>
<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistability+in+the+lactose+utilization+network+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli.</a> Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die erste Hefe Prionen wurden durch ihre ungewöhnliche Phänotypen und verwirrenden Muster der Vererbung identifiziert. Die Merkmale der diese Prionen wurden dann verwendet, um Algorithmen und Berechnungswerkzeuge zum Bildschirm für zusätzliche Prionproteine zu bauen. Die hier beschriebene Methode dagegen ist experimentell und stützt sich auf vorübergehende Überexpression erstelle ich eine dauerhafte Veränderung-eine stabile Zustand in Konformation Protein kodiert. Wenn die Effizienz der "Aussaat" Prion Montage durch Über...

Biologische Systeme erleben häufig vorübergehende Schwankungen in Protein Hülle und Fülle. Es bleibt unklar, ob diese einen bleibenden Eindruck bei der Gestaltung des Phänotyps eines Organismus oder zukünftiger Generationen haben. Die bekanntesten Fälle von diesem Biologie beinhalten eine seltene Klasse von Proteinen, Prionen, die die Entstehung von vererbbaren Merkmale ohne Änderung des Genoms zu fahren. Stattdessen übermitteln diese proTeinaceous und inFectious Partikel Phänotypen über selbsterhaltend Änderungen an Protein Konformation1,2. Diese Art der Vererbung wurde als Ursache für die ungewöhnliche Erbschaft-Muster einer verheerenden Neurodegenerative Krankheit entdeckt. Studien in Organismen von Pilzen bis hin zu Säugetieren3,4,5,6,7,8,9,10 haben da ergab jedoch, dass Prion-Elementen Anpassungswert verleihen können. Dennoch wurden Prionen als einen faszinierenden, aber selten biologische Kuriosität angesehen.
Diese vorherrschende Meinung ist teilweise statt, weil die Charakterisierung von Protein-basierten Vererbung von einer kleinen Gruppe von Beispielen lange eingeschränkt wurde. Die jüngsten Bemühungen der systematischen Screening haben dieses Bild erheblich ausgeweitet, durch die Identifizierung mehrere neue Bona Fide Prionen11 und fast zwei Dutzend Protein Domänen12 mit einer Kapazität von Prion-wie Konformationsänderungen Brennstoffumstellung. Da jedoch diese Ansätze in der Regel auf starke Aminosäure-Sequenz Vorurteile konzentriert haben, Austauschen der Prionen, die entdeckt wurden die biochemischen Eigenschaften der Gründung Hefe Prionen [PSI+]13,14, [URE3]15und [RNQ+]11,16. Dazu gehören: (1) modulare Domains, sind reich an lange Polymeren erstreckt sich von Asparagin (N) und Glutamin (Q), (2) Montage in ein Amyloid [PRION+] Konformation17,18,19, und 3) vollständige Abhängigkeit von Disaggregase Hsp104-Funktion für die treuen Vermehrung von Mutter zu Tochter13,20,21. In der Tat viele Bona Fide Prionen, einschließlich [GAR+], [Het-s] und sogar das original Prion (PrP-Sc), würde unter solchen strengen Kriterien verfehlt werden. Vielleicht noch wichtiger ist, wäre sie nicht in der Lage, neuartige Mechanismen von Protein-basierten Vererbung22zu erfassen. So kann die wahre biologische breite solcher Phänomene weitaus häufiger in der Natur als bisher angenommen sein.
Um diese Frage zu untersuchen, wurde eine Hochdurchsatz-Proteom-weite Strategie eingesetzt. Ein Markenzeichen für alle Prionen, einschließlich PrPSc, [GAR+], und [Het-s], ist, dass die transiente Überexpression der kausalen Proteine stark erhöht die Rate der Prion Erwerb15,23,24,25,26. Wir nutzten diese Funktion, um systematisch Fragen, über die gesamte Hefe ORFeome, wenn stabile Protein-basierten, epigenetische Zustände durch Induktion vorübergehend die Überexpression von einzelnen Proteinen initiiert werden könnten. Es ist bekannt, dass das Protein-Überexpression Phänotypen27verändern kann. Prionproteine sind jedoch ungewöhnlich, weil ihre temporäre Überproduktion eine Änderung im Phänotyp produziert, die für viele Hunderte von Generationen nach der anfänglichen Überexpression vererbbar ist. Bisher haben wir dieses Feature sowie die ungewöhnliche Erbschaft-Muster von Protein-basierten genetischen Elementen, Dutzende von Proteinen dar, die in der Lage, haben Neuverkabelung phänotypische Landschaften ohne Veränderung der Genom-28sind. Obwohl einige identifiziert wurden Proteine vormals Prionen, die meisten waren nicht, unterstreicht die Kraft dieses Ansatzes um neue Formen der Protein-basierten Erbe zu entdecken.

<table><tbody><tr><td>Guanidinhydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>Cat#G3272-25G</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>Manganchlorid</td><td>Sigma</td><td>Cat#M8054-100G</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>5-Fluororotinsäure</td><td>Sigma</td><td>Cat#F5013-50MG</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>BY4741 MATa (his3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 LYS2 met15&Delta; 0 ura3&Delta; 0)</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>Hefestamm</td></tr><tr><td>BY4741 MAT&alpha; (sein3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 lys2&Delta; 0 MET15 ura3&Delta; 0)</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>Hefestamm</td></tr><tr><td>Hsp70 (K69M)&nbsp;</td><td>Jarosz et al., 2014b</td><td>N/A</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>FLEXGene-Bibliothek</td><td>Hu et al., 2007</td><td>N/A</td><td>Plasmid-Bibliothek</td></tr><tr><td>Dextrose (Glukose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Sigma</td><td>R0250-25G</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Galaktose Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP656-500</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>CSM</td><td>Sunrise Science</td><td>1001-100</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>CSM-URA</td><td>Sunrise Science</td><td>1004-100</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>CSM-LYS</td><td>Sunrise Science</td><td>1032-100</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>CSM-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1019-100</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>CSM-LYS-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1035-100</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Research Products International</td><td>P20240-5000</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Bacto-Pepton</td><td>BD</td><td>211677</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-2</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Hefe Stickstoffbase ohne Aminosäuren</td><td>BD</td><td>291920</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Agar</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49172</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Adeninsulfat</td><td>Sigma</td><td>A3159-25G</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Kaliumacetat</td><td>Sigma</td><td>P1190-500G</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Histidin</td><td>Sigma</td><td>H8000-100G</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Leucin</td><td>Sigma</td><td>L8000-25G</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Lysin</td><td>Sigma</td><td>L5501-25G</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>RNase I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0601</td><td>Enzym</td></tr><tr><td>biotinyliertes DNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1906</td><td>Enzym</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T (Hefelytisches Enzym)</td><td>Sunrise Science</td><td>N0766555</td><td>Enzym</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Stapler</td><td>BioTek</td><td>BioStack3</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Platte Füller</td><td>BiotTek</td><td>EL406</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Liquid-Handling-Roboter</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek FX</td><td>Equipment</td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-screening für die protein-basierten vererbung in s. cerevisiae

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

Die Codierung von biologischen Informationen, der für künftige Generationen zugänglich ist wird in der Regel über Änderungen an der DNA-Sequenz erreicht. Langlebige Vererbung in Protein Konformation (anstatt Sequenz) codiert wurde lange als Paradigma-Verschiebung, aber selten gesehen. Am besten charakterisiert Beispiele solcher epigenetische Elemente sind Prionen, die selbstorganisierende Verhalten besitzen, die die vererbbare Manifestation des neuen Phänotypen fahren können. Viele archetypische Prionen zeigt eine auffallende N/Q-reichen Sequenz Voreingenommenheit und montieren in eine Amyloid Falten. Diese Besonderheiten haben darüber informiert, dass die meisten Screening-Bemühungen um neue Prionproteine zu identifizieren. Mindestens drei bekannten Prionen (einschließlich der Gründung Prions, PrPSc) jedoch nicht diese biochemischen Eigenschaften Hafen. Deshalb haben wir eine alternative Methode, um die Reichweite der Protein-basierten Vererbung anhand einer Eigenschaft der Masse Sonde entwickelt: die transiente Überexpression von Prionproteinen erhöht die Frequenz bei dem erwerben sie eine selbst-Template-Konformation. Dieses Dokument beschreibt ein Verfahren zur Analyse der Fähigkeit der Hefe ORFeome, Protein-basierten Vererbung zu entlocken. Bei dieser Strategie wir zuvor gefunden, &gt; 1 % Hefe Proteine könnte die Entstehung biologischer Merkmale, die langlebig, stabil, und häufiger als genetische Mutation entstanden Kraftstoff. Dieser Ansatz kann in hohem Durchsatz über gesamte ORFeomes oder als gezielte Screening Paradigma für spezifische genetische Netzwerke oder Reize aus der Umwelt eingesetzt werden. Ebenso wie vorwärts genetischer Bildschirme zahlreiche Entwicklungs- und Signalisierung Wege definieren, bieten diese Techniken eine Methode um den Einfluss von Protein-basierten Vererbung in biologischen Prozessen zu untersuchen.

Es ist bekannt, dass eine Proteinüberexpression zelluläre Phänotypen dramatisch verändern kann27. Tatsächlich wurden bei einem initialen Screening-Ansatz mittels nur zehn Stressfaktoren hunderte neuer Phänotypen reproduzierbar durch die Überexpression von Klonen aus dem Hefe-ORFeom identifiziert. Die oben beschriebenen Assays ermöglichen jedoch die Beurteilung, ob Zellen nach dieser Überexpression langfristig stabile Phänotypen beibehalten. Ein Protein, das einen s...

Dieses Protokoll beschreibt eine Hochdurchsatz-Methodik, funktionell für die Protein-basierten Vererbung in S. CerevisiaeBildschirm.

Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Das übergeordnete Ziel dieses Hochdurchsatz-Yeast-Phenotypings besteht darin, Proteine zu identifizieren, die eine dauerhafte phänotypische Erinnerung an eine vorübergehende Überexpression hervorrufen, als Proxy für proteinbasierte Vererbung. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Hefeprionen zu beantworten, beispielsweise, wie viele Proteine eine derartige Vererbung auslösen können. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass viele Proteine und Signalwege unvoreingenommen untersucht werden können.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die entsprechenden Hefezellen in einer 96-Loch-Platte bei 30 Grad Celsius kultivieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Überprüfen Sie die Kulturen visuell, um sicherzustellen, dass sie gesättigt sind; die Zellen sollten mit bloßem Auge am Boden jedes Wells sichtbar sein. Verwenden Sie ein Flüssigkeits-Handling-Robotersystem, um 384-Loch-Platten vorzubereiten, die je Loch 45 µL des geeigneten Mediums enthalten.Zunächst pipettieren Sie Scal-URA in die Vertiefungen einer 384er-Platte. Danach geben Sie Scal-URA zusammen mit dem gewünschten Stressor in die Vertiefungen einer zweiten Platte; in diesem Experiment wird 20 Millimolar Manganchlorid als Stressor verwendet. Drittens pipettieren Sie SD-URA, das keine Plasmidexpression induziert, zusammen mit Manganchlorid in eine weitere Platte.Senken Sie die 96-Loch-Platte mit den Kulturen auf den Flüssigkeitsmanipulator ab und impfen Sie ein bis vier Felder mit jeweils einem Mikroliter aus jedem Loch der 96-Loch-Platte in vier separate Löcher jeder 384-Loch-Platte, die mit unterschiedlichem Medium gefüllt sind. Stellen Sie die Platten mit den Zellen unmittelbar auf einen Mikroplattenstapler bei Raumtemperatur und atmosphärischem Kohlendioxid. Legen Sie das Protokoll für eine 72-stündige Dauerschleife fest und messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern mit dem Mikroplattenreader. Nach den Wachstumsmessungen eine Mikroliter pro Vertiefung der SCal-URA-induzierten Kulturen, in denen eine Proteinüberexpression stattfand, in neue 384-Vertiefungs-Platten überführen, die 45 Mikroliter pro Vertiefung ST-URA-Medium enthalten, das keine Proteinexpression aus dem Plasmid zulässt. Parallel dazu analoge Inokulationen einer zweiten Reihe von 384-Vertiefungs-Platten mit 45 Mikrolitern pro Vertiefung ST-URA aus den Kulturen durchführen, die in ST-URA in Gegenwart des Stressors gezüchtet wurden. Die Platten in eine befeuchtete Kammer stellen und 48 Stunden bei 30 Grad Celsius bis zur Sättigung inkubieren.Nach 48 Stunden verwenden Sie die Platten, um je ein Mikroliter pro Vertiefung in 384-Well-Platten mit je 45 Mikrolitern pro Vertiefung ST-URA erneut zu beimpfen. Führen Sie anschließend eine separate Wiederbeimpfung von je einem Mikroliter pro Vertiefung aus derselben Quellplatte in eine separate 384-Well-Platte mit je 45 Mikrolitern pro Vertiefung ST-URA mit dem Stressor durch. Stellen Sie die Platten mit den Zellen unverzüglich in den Mikrostapler bei Raumtemperatur und atmosphärischem Kohlendioxid und legen Sie das Protokoll für eine 48-stündige Dauerschleife fest, wobei die optische Dichte bei 600 Nanometern mit einem Mikroplattenreader gemessen wird.Wenn die Wachstumsmessungen abgeschlossen sind, verwenden Sie die Plattenleseprogramm-Software, um die Zeit gegenüber der optischen Dichte bei 600 Nanometern als XY-Tabelle zu exportieren. Gruppieren Sie die Spalten der optischen Dichtemessungen für jeden biologischen Replikat zusammen und berechnen Sie den Mittelwert. Erstellen Sie ein XY-Diagramm von Zeit versus optischer Dichte bei 600 Nanometern, um Wachstumskurven zu generieren.Für Kulturen, die signifikante Wachstumsunterschiede als Reaktion auf einen bestimmten Stressor zeigten, abhängig von der Überexpression des ursprünglichen Proteins, entnehmen Sie ein Mikroliter von jedem biologischen Replikat, verdünnen es in 10 Milliliter Wasser und impfen dann 50 Mikroliter auf Platten mit 5-FOA aus. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius für drei Tage. Falls dies zu viele oder zu wenige Kolonien pro Platte ergibt, passen Sie den Verdünnungsfaktor entsprechend an.100 bis 200 Kolonien pro Platte sind ideal. Wählen Sie acht bis 32 Einzelkolonien mit autoklavierten Zahnstochern aus und übertragen Sie sie auf 96-Well-Platten, die pro Mulde 150 Mikroliter SDCSM enthalten. Stellen Sie die Platten in eine befeuchtete Kammer und inkubieren Sie sie 48 bis 72 Stunden bei 30 Grad Celsius bis zur Sättigung.Verwenden Sie diese Kulturen, um zwei neue Sätze von 96-Well-Platten zu beimpfen, die jeweils 150 µL SDCSM pro Well enthalten, sowohl mit als auch ohne den Stressor. Stellen Sie die Platten auf einen Mikroplattenstapler und legen Sie das Protokoll so fest, dass die optische Dichte bei 600 nm über eine 48-stündige Dauermessung aufgezeichnet wird. Analysieren Sie nach 48 Stunden die Daten wie zuvor gezeigt und bestätigen Sie, dass die zuvor beobachteten signifikanten Wachstumsunterschiede nach dem Plasmidverlust erhalten bleiben.Die Zellen, die die induzierten Phänotypen aufrechterhalten, werden anschließend auf klassische Merkmale der proteinbasierten Vererbung getestet, wie im Textprotokoll beschrieben. Dieser Screen für proteinbasierte Vererbung zeigte, dass die vorübergehende Überexpression des offenen Leserahmens von PSP1 eine Resistenz gegenüber Manganchlorid hervorruft, die über Hunderte von Generationen in den Zellen erhalten bleibt, lange nachdem die Überexpression eingestellt wurde. Prionvorhersagealgorithmen stuften das endständige Ende von PSP1 als mäßig prionähnlich ein.Im Gegensatz dazu sagten die Algorithmen für die meisten auf dem Screen gewonnenen induzierenden Proteine praktisch keine signifikanten Prion-ähnlichen Sequenzmerkmale voraus, wie durch diese repräsentative Analyse gezeigt wird. Wachstumsmessungen von Stämmen und SDCSM mit Mangan(II)-chlorid, normiert auf eine entsprechende naive PSP1-minus-Kontrolle, zeigten, dass die Hemmung der HSP104-Disaggregase die PSP1-abhängige Resistenz gegenüber Mangan(II)-chlorid nicht beeinträchtigt, während der Verlust des HSP70-Chaperons und des PSP1-Gens diese Eigenschaft erblich eliminiert. Alle Sporen aus einzelnen Tetraden von Kreuzungen zwischen Stämmen, die den PSP1-abhängigen phänotypischen Zustand aufweisen, und naiven Stämmen, zeigen Resistenz gegenüber Mangan(II)-chlorid, was auf eine nicht-mendelsche Vererbung des Phänotyps hindeutet.Ein Vergleich der Infektiosität für die Proteinumwandlung zwischen Mock-Lysaten und Lysaten, die PSP1 enthalten, als übertragbarem Material zeigte, dass über 53 % der naiven Zellen, die mit gesätem PSP1 umgewandelt wurden, das entsprechende Phänotyp der Manganchlorid-Resistenz erwarben. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb einiger Wochen durchgeführt werden, einschließlich der Inkubationsschritte, und die Vorbereitung der meisten Screening-Schritte kann pro Tag weniger als zwei Stunden in Anspruch nehmen, selbst bei einer großen Anzahl von Platten. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich genau zu überlegen, was man vorab testen möchte, und die Größenordnung des Experiments im Auge zu behalten.Dies ist besonders wichtig für Anfänger der Technik. Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie diejenigen, die im textbasierten Protokoll beschrieben sind, durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob die im Screening beobachteten Phänotypen ein echtes, prionähnliches Erbmustermuster aufweisen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Epigenetik den Weg, die Vielfalt der Prionbiologie in Saccharomyces cerevisiae zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Hochdurchsatz-Screen für neue Formen der proteinbasierten Vererbung in Hefe sowohl unvoreingenommen als auch gezielt gestaltet.Vergessen Sie nicht, dass bestimmte chemische Stressfaktoren wie DNA-schädigende Agenzien äußerst gefährlich sein können und Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung, stets getroffen werden sollten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae

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