Name: Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Erfahren Sie ein Hochdurchsatz-Screening zur Identifizierung proteinbasierter Vererbung in Saccharomyces cerevisiae. Diese Methode ermöglicht die unvoreingenommene Untersuchung vieler Proteine auf dauerhafte phänotypische Merkmale.

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Wir danken Sohini Chakrabortee, Sandra Jones, David Garcia, Bhupinder Bhullar, Amelia Chang, Richard She und Susan Lindquist für ihre Unterstützung bei der Entwicklung der Assays in diesem Papier sowie die Gutachter für ihre nachdenklichen Kommentaren verwendet.

<ol><li>Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions%2C+protein+homeostasis%2C+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity.</a> Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).</li>
<li>Byers, J. S., Jarosz, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pernicious+pathogens+or+expedient+elements+of+inheritance%3A+the+significance+of+yeast+prions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions.</a> PLoS Pathog. 10 (4), 1003992(2014).</li>
<li>Jarosz, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-kingdom+chemical+communication+drives+a+heritable%2C+mutually+beneficial+prion-based+transformation+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism.</a> Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).</li>
<li>True, H. L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion+provides+a+mechanism+for+genetic+variation+and+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity.</a> Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).</li>
<li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+prion%2C+Mod5%2C+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146 (3), 448-461 (2011).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+polymerization+underlies+signal+transduction+in+antiviral+immune+defense+and+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation.</a> Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).</li>
<li>Majumdar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+amyloid-like+oligomers+of+Drosophila+Orb2+in+the+persistence+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory.</a> Cell. 148 (3), 515-529 (2012).</li>
<li>Khan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloidogenic+Oligomerization+Transforms+Drosophila+Orb2+from+a+Translation+Repressor+to+an+Activator%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator.</a> Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).</li>
<li>Fioriti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Persistence+of+Hippocampal-Based+Memory+Requires+Protein+Synthesis+Mediated+by+the+Prion-like+Protein+CPEB3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3.</a> Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).</li>
<li>Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+affect+the+appearance+of+other+prions%3A+the+story+of+%5BPIN%28%2B%29%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)].</a> Cell. 106 (2), 171-182 (2001).</li>
<li>Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+survey+identifies+prions+and+illuminates+sequence+features+of+prionogenic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins.</a> Cell. 137 (1), 146-158 (2009).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+chaperone+protein+Hsp104+in+propagation+of+the+yeast+prion-like+factor+%5Bpsi%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+].</a> Science. 268 (5212), 880-884 (1995).</li>
<li>Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Support+for+the+prion+hypothesis+for+inheritance+of+a+phenotypic+trait+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast.</a> Science. 273 (5275), 622-626 (1996).</li>
<li>Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BURE3%5D+as+an+altered+URE2+protein%3A+evidence+for+a+prion+analog+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">[URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 264 (5158), 566-569 (1994).</li>
<li>Sondheimer, N., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rnq1%3A+an+epigenetic+modifier+of+protein+function+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast.</a> Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).</li>
<li>Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amyloid-forming+peptide+from+the+yeast+prion+Sup35+reveals+a+dehydrated+beta-sheet+structure+for+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).</li>
<li>Glover, J. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9182769">Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae.</a> Cell. 89 (5), 811-819 (1997).</li>
<li>King, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-inducing+domain+2-114+of+yeast+Sup35+protein+transforms+in+vitro+into+amyloid-like+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104+catalyzes+formation+and+elimination+of+self-replicating+Sup35+prion+conformers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers.</a> Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).</li>
<li>Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elimination+of+the+yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+by+guanidine+hydrochloride+is+the+result+of+Hsp104+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation.</a> Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).</li>
<li>Caudron, F., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+super-assembly+of+Whi3+encodes+memory+of+deceptive+encounters+by+single+cells+during+yeast+courtship%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship.</a> Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).</li>
<li>Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16793280">How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta].</a> Methods. 39 (1), 3-8 (2006).</li>
<li>Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+SUP35+gene+induces+de-novo+appearance+of+psi-like+factors+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).</li>
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<li>Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLAAC%3A+a+web+and+command-line+application+to+identify+proteins+with+prion-like+amino+acid+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition.</a> Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. (17), (2008).</li>
<li>Rogoza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Mendelian+determinant+%5BISP%2B%5D+in+yeast+is+a+nuclear-residing+prion+form+of+the+global+transcriptional+regulator+Sfp1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).</li>
<li>Shorter, J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+adaptive+conduits+of+memory+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Prions as adaptive conduits of memory and inheritance.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).</li>
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<li>Tanaka, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protein+transformation+protocol+for+introducing+prions+into+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).</li>
<li>Roberts, B. T., Wickner, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+activity%3A+a+prion+that+propagates+by+covalent+autoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation.</a> Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).</li>
<li>Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistability+in+the+lactose+utilization+network+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli.</a> Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die erste Hefe Prionen wurden durch ihre ungewöhnliche Phänotypen und verwirrenden Muster der Vererbung identifiziert. Die Merkmale der diese Prionen wurden dann verwendet, um Algorithmen und Berechnungswerkzeuge zum Bildschirm für zusätzliche Prionproteine zu bauen. Die hier beschriebene Methode dagegen ist experimentell und stützt sich auf vorübergehende Überexpression erstelle ich eine dauerhafte Veränderung-eine stabile Zustand in Konformation Protein kodiert. Wenn die Effizienz der "Aussaat" Prion Montage durch Über...

Biologische Systeme erleben häufig vorübergehende Schwankungen in Protein Hülle und Fülle. Es bleibt unklar, ob diese einen bleibenden Eindruck bei der Gestaltung des Phänotyps eines Organismus oder zukünftiger Generationen haben. Die bekanntesten Fälle von diesem Biologie beinhalten eine seltene Klasse von Proteinen, Prionen, die die Entstehung von vererbbaren Merkmale ohne Änderung des Genoms zu fahren. Stattdessen übermitteln diese proTeinaceous und inFectious Partikel Phänotypen über selbsterhaltend Änderungen an Protein Konformation1,2. Diese Art der Vererbung wurde als Ursache für die ungewöhnliche Erbschaft-Muster einer verheerenden Neurodegenerative Krankheit entdeckt. Studien in Organismen von Pilzen bis hin zu Säugetieren3,4,5,6,7,8,9,10 haben da ergab jedoch, dass Prion-Elementen Anpassungswert verleihen können. Dennoch wurden Prionen als einen faszinierenden, aber selten biologische Kuriosität angesehen.
Diese vorherrschende Meinung ist teilweise statt, weil die Charakterisierung von Protein-basierten Vererbung von einer kleinen Gruppe von Beispielen lange eingeschränkt wurde. Die jüngsten Bemühungen der systematischen Screening haben dieses Bild erheblich ausgeweitet, durch die Identifizierung mehrere neue Bona Fide Prionen11 und fast zwei Dutzend Protein Domänen12 mit einer Kapazität von Prion-wie Konformationsänderungen Brennstoffumstellung. Da jedoch diese Ansätze in der Regel auf starke Aminosäure-Sequenz Vorurteile konzentriert haben, Austauschen der Prionen, die entdeckt wurden die biochemischen Eigenschaften der Gründung Hefe Prionen [PSI+]13,14, [URE3]15und [RNQ+]11,16. Dazu gehören: (1) modulare Domains, sind reich an lange Polymeren erstreckt sich von Asparagin (N) und Glutamin (Q), (2) Montage in ein Amyloid [PRION+] Konformation17,18,19, und 3) vollständige Abhängigkeit von Disaggregase Hsp104-Funktion für die treuen Vermehrung von Mutter zu Tochter13,20,21. In der Tat viele Bona Fide Prionen, einschließlich [GAR+], [Het-s] und sogar das original Prion (PrP-Sc), würde unter solchen strengen Kriterien verfehlt werden. Vielleicht noch wichtiger ist, wäre sie nicht in der Lage, neuartige Mechanismen von Protein-basierten Vererbung22zu erfassen. So kann die wahre biologische breite solcher Phänomene weitaus häufiger in der Natur als bisher angenommen sein.
Um diese Frage zu untersuchen, wurde eine Hochdurchsatz-Proteom-weite Strategie eingesetzt. Ein Markenzeichen für alle Prionen, einschließlich PrPSc, [GAR+], und [Het-s], ist, dass die transiente Überexpression der kausalen Proteine stark erhöht die Rate der Prion Erwerb15,23,24,25,26. Wir nutzten diese Funktion, um systematisch Fragen, über die gesamte Hefe ORFeome, wenn stabile Protein-basierten, epigenetische Zustände durch Induktion vorübergehend die Überexpression von einzelnen Proteinen initiiert werden könnten. Es ist bekannt, dass das Protein-Überexpression Phänotypen27verändern kann. Prionproteine sind jedoch ungewöhnlich, weil ihre temporäre Überproduktion eine Änderung im Phänotyp produziert, die für viele Hunderte von Generationen nach der anfänglichen Überexpression vererbbar ist. Bisher haben wir dieses Feature sowie die ungewöhnliche Erbschaft-Muster von Protein-basierten genetischen Elementen, Dutzende von Proteinen dar, die in der Lage, haben Neuverkabelung phänotypische Landschaften ohne Veränderung der Genom-28sind. Obwohl einige identifiziert wurden Proteine vormals Prionen, die meisten waren nicht, unterstreicht die Kraft dieses Ansatzes um neue Formen der Protein-basierten Erbe zu entdecken.

<table><tbody><tr><td>Guanidinhydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>Cat#G3272-25G</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>Manganchlorid</td><td>Sigma</td><td>Cat#M8054-100G</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>5-Fluororotinsäure</td><td>Sigma</td><td>Cat#F5013-50MG</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>BY4741 MATa (his3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 LYS2 met15&Delta; 0 ura3&Delta; 0)</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>Hefestamm</td></tr><tr><td>BY4741 MAT&alpha; (sein3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 lys2&Delta; 0 MET15 ura3&Delta; 0)</td><td>Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998</td><td>N/A</td><td>Hefestamm</td></tr><tr><td>Hsp70 (K69M)&nbsp;</td><td>Jarosz et al., 2014b</td><td>N/A</td><td>Plasmid</td></tr><tr><td>FLEXGene-Bibliothek</td><td>Hu et al., 2007</td><td>N/A</td><td>Plasmid-Bibliothek</td></tr><tr><td>Dextrose (Glukose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-3</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Sigma</td><td>R0250-25G</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Galaktose Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP656-500</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>CSM</td><td>Sunrise Science</td><td>1001-100</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>CSM-URA</td><td>Sunrise Science</td><td>1004-100</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>CSM-LYS</td><td>Sunrise Science</td><td>1032-100</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>CSM-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1019-100</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>CSM-LYS-MET</td><td>Sunrise Science</td><td>1035-100</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Research Products International</td><td>P20240-5000</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Bacto-Pepton</td><td>BD</td><td>211677</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-2</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Hefe Stickstoffbase ohne Aminosäuren</td><td>BD</td><td>291920</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Agar</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49172</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Adeninsulfat</td><td>Sigma</td><td>A3159-25G</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Kaliumacetat</td><td>Sigma</td><td>P1190-500G</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Histidin</td><td>Sigma</td><td>H8000-100G</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Leucin</td><td>Sigma</td><td>L8000-25G</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>Lysin</td><td>Sigma</td><td>L5501-25G</td><td>Medienkomponente</td></tr><tr><td>RNase I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0601</td><td>Enzym</td></tr><tr><td>biotinyliertes DNase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1906</td><td>Enzym</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T (Hefelytisches Enzym)</td><td>Sunrise Science</td><td>N0766555</td><td>Enzym</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Stapler</td><td>BioTek</td><td>BioStack3</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Platte Füller</td><td>BiotTek</td><td>EL406</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Liquid-Handling-Roboter</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek FX</td><td>Equipment</td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-screening für die protein-basierten vererbung in s. cerevisiae

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

Die Codierung von biologischen Informationen, der für künftige Generationen zugänglich ist wird in der Regel über Änderungen an der DNA-Sequenz erreicht. Langlebige Vererbung in Protein Konformation (anstatt Sequenz) codiert wurde lange als Paradigma-Verschiebung, aber selten gesehen. Am besten charakterisiert Beispiele solcher epigenetische Elemente sind Prionen, die selbstorganisierende Verhalten besitzen, die die vererbbare Manifestation des neuen Phänotypen fahren können. Viele archetypische Prionen zeigt eine auffallende N/Q-reichen Sequenz Voreingenommenheit und montieren in eine Amyloid Falten. Diese Besonderheiten haben darüber informiert, dass die meisten Screening-Bemühungen um neue Prionproteine zu identifizieren. Mindestens drei bekannten Prionen (einschließlich der Gründung Prions, PrPSc) jedoch nicht diese biochemischen Eigenschaften Hafen. Deshalb haben wir eine alternative Methode, um die Reichweite der Protein-basierten Vererbung anhand einer Eigenschaft der Masse Sonde entwickelt: die transiente Überexpression von Prionproteinen erhöht die Frequenz bei dem erwerben sie eine selbst-Template-Konformation. Dieses Dokument beschreibt ein Verfahren zur Analyse der Fähigkeit der Hefe ORFeome, Protein-basierten Vererbung zu entlocken. Bei dieser Strategie wir zuvor gefunden, &gt; 1 % Hefe Proteine könnte die Entstehung biologischer Merkmale, die langlebig, stabil, und häufiger als genetische Mutation entstanden Kraftstoff. Dieser Ansatz kann in hohem Durchsatz über gesamte ORFeomes oder als gezielte Screening Paradigma für spezifische genetische Netzwerke oder Reize aus der Umwelt eingesetzt werden. Ebenso wie vorwärts genetischer Bildschirme zahlreiche Entwicklungs- und Signalisierung Wege definieren, bieten diese Techniken eine Methode um den Einfluss von Protein-basierten Vererbung in biologischen Prozessen zu untersuchen.

Es ist bekannt, dass eine Proteinüberexpression zelluläre Phänotypen dramatisch verändern kann27. Tatsächlich wurden bei einem initialen Screening-Ansatz mittels nur zehn Stressfaktoren hunderte neuer Phänotypen reproduzierbar durch die Überexpression von Klonen aus dem Hefe-ORFeom identifiziert. Die oben beschriebenen Assays ermöglichen jedoch die Beurteilung, ob Zellen nach dieser Überexpression langfristig stabile Phänotypen beibehalten. Ein Protein, das einen s...

Dieses Protokoll beschreibt eine Hochdurchsatz-Methodik, funktionell für die Protein-basierten Vererbung in S. CerevisiaeBildschirm.

Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Das übergeordnete Ziel dieses Hochdurchsatz-Yeast-Phenotypings besteht darin, Proteine zu identifizieren, die eine dauerhafte phänotypische Erinnerung an eine vorübergehende Überexpression hervorrufen, als Proxy für proteinbasierte Vererbung. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Hefeprionen zu beantworten, beispielsweise, wie viele Proteine eine derartige Vererbung auslösen können. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass viele Proteine und Signalwege unvoreingenommen untersucht werden können.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die entsprechenden Hefezellen in einer 96-Loch-Platte bei 30 Grad Celsius kultivieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Überprüfen Sie die Kulturen visuell, um sicherzustellen, dass sie gesättigt sind; die Zellen sollten mit bloßem Auge am Boden jedes Wells sichtbar sein. Verwenden Sie ein Flüssigkeits-Handling-Robotersystem, um 384-Loch-Platten vorzubereiten, die je Loch 45 µL des geeigneten Mediums enthalten.Zunächst pipettieren Sie Scal-URA in die Vertiefungen einer 384er-Platte. Danach geben Sie Scal-URA zusammen mit dem gewünschten Stressor in die Vertiefungen einer zweiten Platte; in diesem Experiment wird 20 Millimo

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

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Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae

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