Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae

Das übergeordnete Ziel dieser Hochdurchsatz-Hefe-Phänotypisierung ist es, nach Proteinen zu suchen, die ein dauerhaftes phänotypisches Gedächtnis der übergebenen Expression als Proxy für die proteinbasierte Vererbung verhindern. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Hefe-Prionen-Technologie zu beantworten, wie z. B. wie viele Proteine es illegal vererben kann, dieses Typs. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie viele Proteine und Signalwege unvoreingenommen untersuchen können.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die entsprechenden Hefezellen in einer 96-Well-Platte bei 30 Grad Celsius züchten, wie im Textprotokoll beschrieben. Überprüfen Sie die Kulturen visuell, um sicherzustellen, dass die Kulturen gesättigt sind, die Zellen sollten mit dem Auge am Boden jeder Vertiefung sichtbar sein. Verwenden Sie einen Liquid-Handling-Roboter, um 384-Well-Platten vorzubereiten, die 45 Mikroliter des entsprechenden Mediums pro Well enthalten.

Geben Sie zunächst Scal-URA in die Vertiefungen einer 384-Well-Platte. Geben Sie dann Scal-URA plus den interessierenden Stressor in die Vertiefungen einer zweiten Platte, 20 Millimolar Manganchlorid wird in diesem Experiment als Stressor verwendet. Drittens: Geben Sie SD-URA, das keine Plasmidexpression induziert, plus Manganchlorid in eine andere Platte.

Senken Sie die 96-Well-Platte mit den Kulturen auf den Liquid-Handling-Roboter ab und inokulieren Sie ein bis vier Arrays von einem Mikroliter aus jeder Vertiefung der 96-Well-Platte in vier separate Vertiefungen jeder 384-Well-Platte, die mit einem anderen Medium gefüllt sind. Legen Sie die Platten mit den Zellen sofort bei Raumtemperatur und atmosphärischem Kohlendioxid auf einen Mikroplatten-Stapler. Stellen Sie das Protokoll auf eine 72-stündige Endlosschleife ein und messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern mit dem Mikroplatten-Reader.

Nach den Wachstumsmessungen wird ein Mikroliter pro Vertiefung der SCal-URA-induzierten Kulturen, die eine Proteinüberexpression aufwiesen, auf neue 384-Well-Platten übertragen, die 45 Mikroliter pro Vertiefung ST-URA-Medium enthalten, das keine Proteinexpression des Plasmids zulässt. Parallel dazu führen Sie analoge Inokulationen eines zweiten Satzes von 384-Well-Platten durch, die 45 Mikroliter ST-URA pro Well aus den Kulturen enthalten, die in ST-URA in Gegenwart des Stressors gezüchtet wurden. Stellen Sie die Platten in eine befeuchtete Kammer und lassen Sie die Platten 48 Stunden lang bei 30 Grad Celsius bis zur Sättigung wachsen.

Verwenden Sie die Platten nach 48 Stunden, um einen Mikroliter pro Vertiefung in 384-Well-Platten mit 45 Mikrolitern ST-URA pro Vertiefung erneut zu inokulieren. Führen Sie dann eine separate erneute Inokulation von einem Mikroliter pro Vertiefung von derselben Quellplatte in eine separate 384-Well-Platte mit 45 Mikrolitern ST-URA pro Vertiefung mit dem Stressor durch. Platzieren Sie die Platten mit den Zellen des Microstackers sofort bei Raumtemperatur und atmosphärischem Kohlendioxid und stellen Sie das Protokoll auf eine 48-stündige Endlosschleife ein, bei der die optische Dichte bei 600 Nanometern mit einem Mikroplatten-Reader gemessen wird.

Wenn die Wachstumsmessungen abgeschlossen sind, verwenden Sie die Plattenlesesoftware, um die Zeit im Vergleich zur optischen Dichte bei Messungen im Bereich von 600 Nanometern als XY-Tabelle zu exportieren. Gruppieren Sie die Spalten der optischen Dichtemessungen für jedes biologische Replikat und berechnen Sie den Mittelwert. Erstellen Sie ein XY-Diagramm der Zeit im Vergleich zur optischen Dichte bei 600 Nanometern, um Wachstumskurven zu erstellen.

Bei Kulturen, die signifikante Wachstumsunterschiede als Reaktion auf einen gegebenen Stressor wählten, abhängig von der Überexpression des angestammten Proteins, nehmen Sie einen Mikroliter von jedem biologischen Replikat, verdünnen Sie es in 10 Millilitern Wasser und verteilen Sie dann 50 Mikroliter auf Platten, die 5-FOA enthalten. Anbau bei 30 Grad Celsius für drei Tage. Ergeben sich dadurch zu viele oder zu wenige Kolonien pro Platte, passen Sie den Verdünnungsfaktor entsprechend an.

100 bis 200 Völker pro Platte sind ideal. Entnehmen Sie acht bis 32 Einzelkolonien mit Autoklaven-Zahnstochern und stecken Sie sie auf 96-Well-Platten mit 150 Mikrolitern SDCSM pro Well. Stellen Sie die Platten in eine befeuchtete Kammer und wachsen Sie 48 bis 72 Stunden lang bei 30 Grad Celsius bis zur Sättigung.

Verwenden Sie diese Kulturen, um zwei neue Sätze von 96-Well-Platten mit 150 Mikrolitern SDCSM pro Well zu impfen, sowohl mit als auch ohne Stressor. Legen Sie die Platten auf einen Mikroplatten-Stapler und stellen Sie das Protokoll so ein, dass die optische Dichte bei 600 Nanometern in einer 48-Stunden-Endlosschleife gemessen wird. Analysieren Sie die Daten nach 48 Stunden wie zuvor gezeigt und bestätigen Sie, dass die zuvor beobachteten signifikanten Wachstumsunterschiede nach dem Plasmidverlust erhalten bleiben.

Die Zellen, die die induzierten Phänotypen aufrechterhalten, werden dann auf klassische Kennzeichen der proteinbasierten Vererbung getestet, wie sie im Textprotokoll beschrieben sind. Dieses proteinbasierte Vererbungsscreening zeigte, dass die vorübergehende Überexpression des offenen PSP1-Leserahmens eine Resistenz gegen Manganchlorid antreibt, die über Hunderte von Generationen in Zellen aufrechterhalten wurde, lange nachdem die Überexpression aufgehört hatte. Prionen-Vorhersagealgorithmen bewerteten das Endende von PSP1 als mäßig Prionen-ähnlich.

Im Gegensatz dazu sagten die Algorithmen praktisch keine signifikanten Prionen-ähnlichen Sequenzmerkmale von den meisten induzierenden Proteinen voraus, die auf dem Bildschirm gefunden wurden, wie diese repräsentative Analyse zeigt. Wachstumsmessungen von Stämmen und SDCSM mit Manganchlorid, normiert auf eine entsprechende naive PSP1-Minus-Kontrolle, zeigten, dass die Hemmung der HSP104-Disaggregas die PSP1-abhängige Manganchlorid-Resistenz nicht beeinträchtigt, während die Entfernung des HSP70-Chaperons und des PSP1-Gens diesen Phänotyp erblich eliminiert. Alle Sporen aus einzelnen Tetraden von Kreuzungen zwischen Stämmen, die den PSP1-abhängigen phänotypischen Zustand aufweisen, und naiven Stämmen weisen eine Manganchlorid-Resistenz auf, was auf eine nicht-mendelsche Vererbung des Phänotyps hinweist.

Ein Vergleich der Infektiosität für die Proteintransformation zwischen Mock-Lysaten und PSP1, das Lysate als übertragbares Material enthält, zeigte, dass über 53% der naiven Zellen, die mit ausgesätem PSP1 transformiert wurden, den entsprechenden Manganchlorid-Resistenz-Phänotyp erhielten. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in ein paar Wochen durchgeführt werden, einschließlich Inkubationsschritten, und die Vorbereitung der meisten Screening-Schritte kann in weniger als zwei Stunden pro Tag durchgeführt werden, selbst bei einer großen Anzahl von Platten. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, im Voraus genau zu planen, was Sie testen möchten, und den Umfang des Experiments im Auge zu behalten.

Das ist vor allem für Anfänger der Technik wichtig. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie sie im Textprotokoll beschrieben sind, durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob die im Screening beobachteten Phänotypen ein echtes, Prionen-ähnliches Vererbungsmuster aufweisen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Epigenetik, um die Breite der Prionenbiologie in der Sakralis-Service-CI zu erforschen.Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Hochdurchsatz-Screening für neue Formen der proteinbasierten Vererbung in Hefe entwerfen können, und zwar sowohl unvoreingenommen als auch zielgerichtet.

Vergessen Sie nicht, dass bestimmte chemische Stressoren wie DNA-schädigende Stoffe extrem gefährlich sein können und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Tragen persönlicher Schutzausrüstung.