Membran-Nanoröhrchen ziehen aus riesigen Unilamellar Vesikel
7. Dezember 2017
Viele Proteine in der Zelle spüren und Krümmung der Membran zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zur Membran Nanoröhrchen aus Lipid Vesicles, die Interaktion von Proteinen oder jede Krümmung-aktive Molekül mit gebogenen Membranen in VitroStudie ziehen.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode zum Ziehen von Nanoröhren ist es, die Wechselwirkungen zwischen bestimmten Proteinen von Interesse und stark gekrümmten Membranen quantitativ zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Biologie von Zellmembranen zu beantworten, wie z. B. Endozytose und intrazellulärer Transport. Diese Technik ermöglicht es uns, direkt zu quantifizieren, wie Proteine an gekrümmte Membranen binden und diese wechselseitig verformen.
Ursprünglich wurde diese Methode verwendet, um die grundlegenden mechanischen Eigenschaften von Lipidmembranen zu messen. In jüngster Zeit wurde es eingesetzt, um wichtige Mechanismen in der Interaktion von Proteinmembranen, insbesondere von proteinformenden Membranen, aufzuklären. Beginnen Sie damit, die riesigen unilamellären Vesikel direkt von den Platindrähten der Elektroformationskammer zu sammeln.
Um die Versuchskammer zu konstruieren, legen Sie zwei rechteckige Glasabdeckungen im Abstand von einem Millimeter auf eine metallische Unterlage, wobei an den langen Rändern Öffnungen vorhanden sind, die groß genug sind, damit eine Mikropipettenspitze aus Glas zumindest bis zur Mitte der Kammer reichen kann. Füllen Sie sowohl die Versuchskammer als auch eine Mikropipette aus Glas mit fünf Milligramm pro Milliliter einer hochreinen Beta-Kasein-Lösung, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen. Während die Kammer passiviert wird, montieren Sie sie auf ein Lichtmikroskop, das zentriert über dem Objektiv angeordnet ist, und führen Sie die Spitze der Aspirationsmikropipette durch die Öffnung entlang der langen Kante, bis sich die Spitze über dem Objektiv befindet.
Stellen Sie den Füllstand des Wassertanks so ein, dass der Aspirationsdruck nahe Null liegt, und füllen Sie eine Injektionsmikropipette mit dem in experimentellen Puffer gelösten Molekül in der entsprechenden experimentellen Konzentration. Montieren Sie die Injektionsmikropipette in einem Mikromanipulator und führen Sie die Mikropipette durch die andere Seite der Versuchskammer ein. Am Ende der Inkubation nehmen Sie die Beta-Kaseinlösung aus der Kammer und spülen Sie die Kammer mehrmals mit experimentellem Puffer aus.
Geben Sie dann einige Mikroliter Vesikellösung in die Kammer, gefolgt von einigen Mikrolitern Streptavidin-beschichteten Kügelchen, bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mal 10 bis zur negativen Beadsrate von 3 % pro Volumen oder weniger. Nachdem sich die Vesikel und Kügelchen am Boden der Kammer abgesetzt haben, lassen Sie den experimentellen Puffer etwa 15 Minuten lang verdampfen, woraufhin sich die Vesikel unter einem Lichtmikroskop sichtbar wellen sollten. Wenn die Vesikel entsprechend schlaff sind, aspirieren Sie einzelne Vesikel in die Mikropipette, bis die Längen der Membranen innerhalb der Pipette gleich oder größer als der Pipettenradius sind.
Wenn eine Aspirationszunge in der richtigen Größe identifiziert wurde, verschließen Sie die offenen Ränder der Kammer mit Mineralöl. Um die Nullstellung des Aspirationsdrucks einzustellen, positionieren Sie das Ende der Aspirationspipette in der Nähe einer Perle und stellen Sie die Höhe des Wassertanks so ein, dass die Perle weder angesaugt noch von der Pipette weggeblasen wird. Die Einstellung der Höhe des Wassers ist entscheidend, um die Membranspannung des Vesikels zu kontrollieren, das von der Mikropipette abgesaugt wird.
Aspirieren Sie ein Vesikel und bewegen Sie die Mikropipette nach oben und unscharf, ohne die Mikropipette zu beschädigen. Fangen Sie mit einer optischen Pinzette eine Perle etwa 20 Mikrometer vom Boden der Kammer entfernt ein. Bringen Sie das Vesikel wieder in den Fokus, weg von der Perle und ausgerichtet mit der optischen Falle, und zeichnen Sie die Bewegung der Perle ein bis zwei Minuten lang auf, um die Gleichgewichtsposition zu messen.
Reduzieren Sie den Druck in der Mikropipette so weit wie möglich, ohne das Vesikel zu verlieren, um die Membranspannung zu verringern, und bringen Sie das Vesikel etwa eine Sekunde lang vorsichtig mit der Perle in Kontakt, um die Streptavidin-Biotin-Bindungen herzustellen. Ziehen Sie dann mit einem Piezoaktor das Vesikel vorsichtig zurück, um eine Nanoröhre zu erzeugen. Erhöhen Sie den Aspirationsdruck, um die Aspirationszunge nachzubilden, und richten Sie den Schlauch innerhalb der Achse der Aspirationspipette aus.
Bringen Sie die Röhre und das Vesikel vollständig in den Fokus und zeichnen Sie die Bewegung der Perle mit einer Erfassungsgeschwindigkeit von 30 Hertz und die Höhe des Wassertanks in Bezug auf die Nullposition für einige Minuten unter Hellfeldmikroskopie auf. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, zeichnen Sie die Bewegung der Raupe bei unterschiedlichen Aspirationsdrücken und Membranspannungen erneut auf. Um Proteine oder Moleküle von Interesse zu injizieren, bringen Sie die Injektionsmikropipette in die Nähe des Nanoröhrchens, achten Sie darauf, dass die Kugel in der optischen Falle nicht gestört wird, und injizieren Sie die Proteine vorsichtig mit einem bis zwei Pascal Druck.
Nachdem sich die Proteinbindung äquilibriert hat, wiederholen Sie die schrittweisen Messungen in Gegenwart der hinzugefügten Proteine, wie für die nackte Membran gezeigt. Kraft- und Radiusmessungen an Nanoröhren, die aus 100%igen DOPC-Vesikeln gezogen werden, sind unabhängig, da die Kraft aus der Verschiebung der Perle in der optischen Falle und der Radius aus der Fluoreszenzintensität gemessen wird, was zwei Möglichkeiten zur Berechnung der Biegesteifigkeit der Membran bietet. Die relative Anreicherung von BAR- oder Kaliumkanalproteinen auf Membranröhrchen über den darunter liegenden Vesikeln deutet darauf hin, dass die Proteine mit größerer Wahrscheinlichkeit an gekrümmte Membranen binden.
Tatsächlich reduziert die Bindung des N-BAR-Proteins Endophilin A2 an die Membran die Kraft der Röhre allmählich auf Null, was auf die Bildung eines dreidimensionalen Gerüsts hinweist, das die Röhre stabil hält. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Techniken kombiniert werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. hochauflösende Mikroskopie zum Nachweis der Proteinorganisation auf Membranröhrchen oder Einzelpartikelverfolgung zur Messung der Proteinmobilität.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zum Ziehen von Membrannanoröhren aus Lipidvesikeln vor, um die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und gekrümmten Membranen in vitro zu untersuchen. Der Ansatz ermöglicht die Quantifizierung der Proteinbindung an diese Membranen sowie deren mechanische Eigenschaften und trägt zum Verständnis grundlegender Prozesse wie der Endozytose und des intrazellulären Transports bei.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Zellbiologie
- Membrandyamik
- Protein-Membran-Wechselwirkungen
Hintergrund
- Das Verständnis, wie Proteine die Membrankrümmung beeinflussen, ist entscheidend für zelluläre Prozesse.
- Die Untersuchung gekrümmter Membranen trägt dazu bei, die Mechanismen der Endozytose aufzuklären.
- Die Mechanik der Membran spielt eine wesentliche Rolle beim intrazellulären Transport.
Verwendete Methoden
- Nanoröhrenzug-Methode zur Untersuchung von Proteinwechselwirkungen mit gekrümmten Membranen.
- Riesige unilamellare Vesikel als Modellsysteme.
- Optische Pinzetten und Mikroskopie zur Messung von Membraneigenschaften.
Hauptergebnisse
- Quantifizierte, wie Proteine wie Endophilin A2 mit Membrannanoröhren interagieren und diese stabilisieren.
- Zeigte die mechanischen Eigenschaften von Lipidmembranen anhand verschiedener beobachteter Verhaltensweisen auf.
- Lieferte Einblicke in die bevorzugte Bindung von Proteinen an gekrümmte Membranen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie unterstreicht die Bedeutung der Membrankrümmung für Proteinwechselwirkungen.
- Die vorgestellte Methode kann die Forschung zu zellulären Prozessen und der Membranbiologie voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse von Protein-Membran-Krümmungswechselwirkungen und liefert mechanistische Einblicke in Endozytose- und intrazelluläre Transportwege. Durch die Messung der Proteinbindung an stark gekrümmte Membranen sowie deren mechanische Effekte unterstützt sie die Zielvalidierung und verringert das Risiko in der frühen Entdeckung membranassoziiierter Therapeutika. Der Ansatz liefert eine vorhersagbare Sicherheit bezüglich der Proteinfunktion, indem molekulare Wechselwirkungen mit Phänotypen der Membranumgestaltung verknüpft werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die Bindung von Proteinen an gekrümmte Membranen und deren gegenseitige Verformung quantifiziert wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung durch direkte Messung der proteininduzierten Membranstabilisierung, beispielsweise durch Reduktion der Kraft auf null durch Endophilin A2.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem Proteine identifiziert werden, die bevorzugt an stark gekrümmte Membranen binden, was auf eine mechanistische Relevanz für die Vesikelbildung hinweist.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte Protein-Membran-Systeme für die nachgeschaltete Untersuchung vor, indem gleichzeitige Messungen der Membrankrümmung, -spannung und der Proteinoberflächendichte ermöglicht werden.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt Kraft- und Radiusmessungen aus der Verschiebung der optischen Falle und der Fluoreszenzintensität und liefert so zwei unabhängige Messgrößen für die Berechnung der Biegesteifigkeit.
- Reproduzierbarkeit: Standardisiert die Kontrolle der Membranspannung mittels Mikropipettenaspiration und Nullpositionskalibrierung, wodurch eine konsistente Nanoröhrenbildung über verschiedene Experimente hinweg gewährleistet ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert gekrümmte zelluläre Strukturen wie endozytotische Engstellen und verknüpft Protein-Membran-Wechselwirkungen mit Transportwegen, die bei neurodegenerativen und Stoffwechselerkrankungen eine Rolle spielen.
- Translationaler Kontinuität: Verknüpft in-vitro-Befunde mit zellulären Kontexten, indem Nachuntersuchungen mittels hochauflösender Mikroskopie und Einzelpartikel-Tracking ermöglicht werden, um die Organisation und Mobilität von Proteinen auf Nanoröhren zu bewerten.
- Risikoadjustierte Fortschrittsbewertung Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem quantifiziert wird, wie Proteine die Membranmechanik verändern, und verringert so die Unsicherheit bei der mechanistischen Risikominimierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Auf der Ebene der Entdeckungsbioanalytik angesiedelt, unterstützt diese Methode die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Wegen, bevor man zur Leitstrukturfestlegung und präklinischen Validierung übergeht.
- Entdeckungsbiochemie: Untersucht, wie spezifische Proteine Membran-Krümmung wahrnehmen oder verursachen, und klärt deren Rolle bei der Endozytose und dem intrazellulären Transport.
- Screening: Bietet assaysbereite Systeme mit standardisierter Krümmung und Spannung, die eine zuverlässige Evaluierung von Verbindungen oder Proteinen ermöglichen.
- Analytik: Liefert Messgrößen für Kraft, Radius und Fluoreszenzintensität, die die Biegesteifigkeit der Membran und die Anreicherung von Proteinen auf Nanoröhren quantifizieren.
- Translationale Forschung: Ermöglicht den Bezug zur präklinischen Forschung, indem sie die Korrelation zwischen in-vitro-Protein-Membran-Bindung sowie zellulärer Lokalisation und Dynamik erlaubt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung unterschiedlicher Proteine von Interesse über mehrere Projekte hinweg und reduziert redundante Methodenentwicklung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten bei Protein-Membran-Wechselwirkungen verringert werden.
- Operationaler Wert: Stellt Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Vesikelpräparation, Spannungskontrolle und zweimodige Messung der Nanoröhreneigenschaften.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem frühzeitige Go/No-Go-Entscheidungen auf der Grundlage quantitativer Daten zur Protein-Krümmungsbindung ermöglicht werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung membranassoziiierter Targets, indem Bindungsverhalten mit funktioneller Membranumgestaltung verknüpft wird.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikromanipulation, optischen Pinzetten und Fluoreszenzmikroskopie für das Ziehen von Nanoröhren und das Einspritzen von Proteinen.
- Basiert auf spezialisierten Messgeräten wie Mikropipetten-Aspiratoren, Piezo-Aktuatoren und konfokalen Systemen zur gleichzeitigen Messung von Zugspannung, Krümmung und Proteindichte.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bei Pufferbedingungen, der Herstellung von Vesikeln und den Strategien zur Markierung von Proteinen voraus, um die Vergleichbarkeit der Daten sicherzustellen.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Methode auf unterschiedliche Lipidzusammensetzungen oder Proteinsysteme ausgeweitet wird, insbesondere im Hinblick auf die Effizienz der Biotin-Streptavidin-Bindung.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die Notwendigkeit eines hochreinen Beta-Casens für die Passivierung der Messkammer sowie die sorgfältige Vermeidung von Blasen beim Befüllen der Mikropipetten, um die Integrität der Messungen zu gewährleisten.
