Name: Membran-Nanoröhrchen ziehen aus riesigen Unilamellar Vesikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Erfahren Sie die Nanoröhrchen-Ziehmethodik zur quantitativen Untersuchung von Protein-Membran-Wechselwirkungen an stark gekrümmten Membranen. Diese Technik ermöglicht die Messung mechanischer Eigenschaften von Lipidmembranen und liefert Einblicke in Endozytose sowie intrazellulären Transport.

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Die Autoren danken Benoit Sorre, Damien Cuvelier, Pierre Nassoy, François Quemeneur und Gil Toombes für ihre wesentliche Beiträge zur Nanotube-Methode in der Gruppe zu etablieren. Die P.B-Gruppe gehört das CNRS-Konsortium CellTiss, Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038) und Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). F. C. Tsai wurde von EMBO langfristige Fellowship (ALTF 1527-2014) und Marie Curie Aktionen (H2020-MSCA-IF-2014, Projekt Membran-Ezrin-Aktin) finanziert. M.S. ist Junior Fellow Simons Society of Fellows.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Methode des Ziehens Röhren aus GUVs gibt umfassende Informationen über das Membranprotein System, wie es nicht nur die Mittel ist, um die grundlegenden mechanischen Eigenschaften der Membran zu messen, aber es hilft, die Aufschluss über die Kopplung zwischen Proteinen und Membran Krümmung. Wie in der Einleitung erwähnt, andere Techniken existieren, um die Wirkungen der Membran-geschwungene Proteine messen durch Inkubation der Proteine mit Sub-Mikrometer-Liposomen angebunden an eine passivierte Oberfläche<sup class="x...

Viele zelluläre Prozesse, wie z. B. Endozytose, Menschenhandel, die Bildung von Filopodien, Infektion, etc., werden durch eine dramatische Veränderung in der Form von Zellmembranen1,2begleitet. In der Zelle beteiligen sich eine Reihe von Proteinen in diesen Prozessen durch Bindung an die Membran und verändern ihre Form. Die bemerkenswertesten Beispiele sind Mitglieder der Bin/gekrümmte/Rvs (BAR)-Proteinfamilie, enthält ein Merkmal intrinsisch geschwungene BAR Domäne3,4,5,6,7. In der Regel interagieren sie mit der Membran durch die Einhaltung der BAR-Domäne an die Oberfläche und in vielen Fällen auch flach amphipathische Helices in der Bilayer einfügen. Form, Größe und Ladung des Geschäftsfeldes BAR zusammen mit der Anzahl der amphipathische Helices bestimmt: (1) die Richtung der Krümmung der Membran (d. h., ob sie Invaginations oder Vorsprünge induziert werden), und (2) das Ausmaß der Membran Krümmung5,8. Der Hinweis hier positive Krümmung der konvexen Seite die gebogene Membran, d.h., die Ausbuchtung in Richtung der wechselwirkenden Teilchen, und negative sonst bezeichnet. Darüber hinaus quantitative Studien der BAR Proteine ergaben, dass ihre Wirkung auf die Membran hängt von einer Reihe von physikalischen Parametern: Dichte von Proteinen, Membran-Spannung und Membran-Form (flach im Vergleich zu röhrenförmigen im Vergleich zu sphärischen Oberfläche Form)7. Abhängig von diesen Parametern BAR Proteine können: (1) dienen als Sensoren der Membran Krümmung, (2) beugen Membranen oder (3) induzieren Membran Spaltung7.
Aufgrund der Vielzahl der Beteiligten bei der Neugestaltung der Membran in die Zelle, studieren die quantitativen Aspekte der Phänomene, wie z. B. Endozytose Komponenten, ist in Vivo extrem schwierig. In-vitro- Rekonstitution der minimalen Komponenten imitiert gekrümmte Membranen in der Zelle ermöglicht ein mechanistischen Verständnis wie Membran-geschwungene Proteine zu betreiben. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll um eine Membran Nanoröhrchen in Vitro mit Mikromanipulation, konfokale Mikroskopie und optische Pinzette wieder zusammenzusetzen. Der Ansatz kann verwendet werden, in einer quantitativen Weise zu untersuchen, wie Proteine, Lipide oder kleine Moleküle mit gebogenen Membranen interagieren. Lipid GUVs dienen als Modelle für eine Zellmembran, deren Krümmung im Vergleich zur Größe der interagierenden Membran-geschwungene Moleküle vernachlässigbar. Sie sind bereit, mit der Electroformation Methode9 in dem die Bläschen gebildet werden, durch ein Lipid-Film feuchtigkeitsspendende und Schwellung es in GUVs unter einem Wechselstrom (AC)10. Am häufigsten verwendeten Substrate auf die GUVs angebaut werden sind entweder halbleitenden Platten beschichtet mit Indium-Zinn-Oxid (ITO) oder Platin (Pt-Drähte)11Drähte. In dieser Arbeit werden GUVs auf Pt-Drähte angebaut, wie diese Methode viel besser als die Alternative bei der Herstellung GUVs in Anwesenheit von Salzen in den Puffer12Arbeiten gezeigt hat. Obwohl das Electroformation-Protokoll ausreichend detailliert, es zu reproduzieren hier beschrieben ist, verweisen wir den Leser auf früheren Artikeln, in denen ähnliche und andere Verfahren zur Herstellung von GUVs im Detail13,14beschrieben wurden. In unseren Händen hat Electroformation auf Pt-Drähte erfolgreich GUVs aus einer Mischung von synthetischen Lipiden oder natürliche Lipid Extrakte in einem Puffer mit ~ 100 mM NaCl erbracht. Darüber hinaus war es auch möglich, Proteine innen GUVs während des Wachstums zu Kapseln. Abbildung 1Azeigt eine Beispiel-Electroformation-Kammer; Es besteht aus zwei ca. 10 cm lange Pt-Drähte eingefügt in eine Halterung hergestellt aus Polytetrafluorethylen (PTFE), die auf beiden Seiten mit Glasdeckgläser versiegelt werden kann ~ 1-2 cm auseinander (Abb. 1A).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg"> Abbildung 1: Versuchsaufbau. (A) die GUV Electroformation Kammer mit elektrischen Anschlüssen an Pt-Drähte befestigt. (B) links: das experimentelle System das Mikroskop zeigt, die experimentelle Kammer über das Ziel und zwei Mikropipetten (links und rechts) die Mikromanipulatoren zugeordnet und eingefügt in die experimentelle Kammer für das Rohr zu ziehen und Protein Injektion. Rechts: eine Nahansicht der experimentellen Kammer über dem Ziel zeigen die Spitzen der Aspiration und die Injektion Mikropipetten eingefügt montiert. (C) eine Spritze ist ausgestattet mit einem dünnen Dispenser in einer Mikropipette an seinem hinteren Ende eingefügt. Der Boden ist eine Nahansicht des Spenders in die Mikropipette mit der blau gepunkteten Linie umreißt die Mikropipette. Dieses System wird verwendet, um die Mikropipette mit Kasein auf die Glasoberfläche passiviert und füllen mit Mineralöl bei Bedarf wieder zu füllen. (D) ein System zur µL Mengen der Proteinlösung Aspirieren. Die Nadel ist verbunden, um eine Spritze und Schläuche, die mit der Injektion Mikropipette verbunden ist. Die Mikropipette Spitze sorgfältig eingetaucht in die Proteinlösung und abgesaugt, also um die Mikropipette Spitze gefüllt. Die Mikropipette wird dann wieder gefüllt mit Mineralöl mit dem System gezeigt im Bedienfeld "C. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
Ein Membran-Nanoröhrchen, im Umkreis von 7 nm bis mehrere hundert nm, kann aus einer GUV durch eine externe Kraft gezogen werden. Diese Methode wurde ursprünglich entwickelt, um die elastischen Eigenschaften von Zellmembranen und Vesikel, wie z. B. die Biege Steifigkeit15,16messen. In jüngsten Arbeiten wurde die Methode erweitert, um die Wechselwirkung von Proteinen mit gebogenen Membranen zu studieren, von den Proteinen in der Nähe der gezogenen Nanotube7,17microinjecting. Andere Methoden haben für das Studium geschwungenen Membran Proteine entwickelt worden. In einer Methode sind Proteine mit unterschiedlich großen Liposomen angebunden an eine passivierte Oberfläche inkubiert. Konfokale Mikroskopie wird verwendet, um die Proteinbindung als Funktion der Liposomen Durchmesser messen die Krümmung-induzierte Sortierung18,19angeben können. In einer anderen Methode werden Proteine in der Nähe einer Mikro-aspirierten GUV, Messen Sie ihre Fähigkeit, spontan Tubuli20,21induzieren injiziert. In diesem Protokoll beschriebene Methode eignet sich eindeutig studieren geschwungenen Membran Proteine beteiligt Endozytose, begegnen die meisten Proteine in der Regel vorgeformte Membran Nanoröhren verbinden die Fracht-haltigen Membran Einstülpen mit der zugrunde liegenden flachen Plasmamembran. Darüber hinaus ist bei dieser Methode wird im Gegensatz zu in der Probe mit gefesselte kleine Liposomen Membran Nanotube kontinuierlich an die Membran verbunden; Daher ist es im mechanischen Gleichgewicht mit der GUV, eine Situation erwartet in Vivo. Daher grundlegende Membran Physik gilt, und wir können eine Vielzahl von mechanischen Eigenschaften ableiten, aus unseren Messungen22,23,24.
Für eine vollständige Implementierung dieser Methode beinhaltet die notwendige Ausrüstung ein confocal Mikroskop, optische Pinzette und ein oder zwei Mikropipetten mit einem Wassertank (Abbildung 1 b) verbunden. Durch die Kombination aller drei, ist es möglich, gleichzeitig messen Membran Spannung, Membran Krümmung, Flächendichte von Proteinen, und Kraft25Rohr. Mikropipette Aspiration ist wichtig und es ist einfach aufgebaut, indem man ein Glas Mikropipette in eine Halterung mit einem Wassertank, der über hydrostatischen Druck die Aspiration Druck26 steuertverbunden. Die Mikropipette und der Halter sind mit einem Mikromanipulator und idealerweise in eine Richtung ein Piezo-Aktor für präzise Bewegung gesteuert. Ein Nanoröhrchen zu ziehen, ist Microaspirated GUV kurz auf ein Mikron mittelständische Korn dann zog Weg schaffen ein Nanotube aufgeklebt. In dieser Implementierung ist die Perle von optischen Pinzette gehalten, konstruiert werden kann, indem Sie die folgenden veröffentlichten Protokoll27. Es ist möglich, auf unterschiedliche Weise der optischen Pinzette und Pull-Nanoröhren verzichten zwar auf Kosten der genaue Kraftmessungen. Wenn es zu schwierig, eine optische Falle zu bauen oder Kraftmessungen sind nicht zwingend notwendig, wie will man einfach nur die Vorliebe von Proteinen für gekrümmte Membranen überprüfen kann ein Rohr mit einer Perle an der Spitze einer zweiten Mikropipette28aspiriert gezogen werden. Es ist auch möglich, ziehen Röhrchen mit Gravitationskraft29 oder30,31zu fließen. Darüber hinaus ist auch konfokalen Mikroskopie nicht wesentlich; Es ist jedoch so bevorzugt die Flächendichte von Proteinen zu messen. Es ermöglicht auch die Messung des Nanotube-Radius von Fluoreszenzintensität von Lipiden in der Röhre, also unabhängig von der Membran Kraft und Spannung. Ableitens Rohr-Radius von Fluoreszenz ist besonders wichtig, wenn die Beziehung zwischen diesen Größen von etablierten Gleichungen aufgrund des Vorhandenseins der Membran eingehalten Proteine25abweicht. Wichtig ist, kann nicht einer optischen Falle sowohl der konfokalen Mikroskopie zu verzichten, da es nicht möglich, die Krümmung des Rohres zu messen.
Die Methode wie beschrieben in diesem Protokoll wurde verwendet, um zu studieren, die Krümmung-induzierte Sortierung von verschiedenen peripheren Membranproteinen auf Nanoröhren, vor allem diejenigen aus der BAR Familie25,32,33,34 . Es wurde auch gezeigt, dass die konisch geformten transmembranen Kaliumkanal KvAP auf bereichert ist als BAR-Proteine35Nanoröhren in gleicher Weise gebogen. Durch die Optimierung der Methode um Proteine innen GUVs Kapseln, ist die Interaktion von Proteinen mit negativer Krümmung vor kurzem als gut36untersucht worden. Darüber hinaus wurde diese Methode, die Bildung von Protein Gerüste25,37 aufzuklären und den Mechanismus der Spaltung der Membran durch entweder Linie Spannung38, Protein Dynamin39, oder BAR zu studieren verwendet Proteine-40,-41. Neben Proteinen können kleine Moleküle oder Ionen auch Krümmung auslösen. Mit dieser Methode wurden Calcium-Ionen induzieren positive Krümmung unter salzfreie Bedingungen42gezeigt. Interessanterweise hat auch gezeigt, dass die Lipide Krümmung sortieren, obwohl nur für Kompositionen unterziehen können, die in der Nähe ein demixing Punkt43,44. Zusammenfassend lässt sich sagen die Methode kann verwendet werden, von Forschern interessiert untersucht wie entweder fester Membran-Komponenten (z. B., Lipide oder transmembranen Proteine) oder peripher Moleküle binden (entweder innen oder außen GUVs) interagieren mit zylindrisch gebogenen Membranen aus mechanischen und quantitativen Gesichtspunkten. Es richtet sich auch an Interessenten, die bei der Messung der mechanischen Eigenschaften der Membran selbst22,23,45.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin (DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>Beispiellipid, das in den Daten für Abbildung 3 verwendet wurde</td></tr>: <tr><td>1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[biotinyl(Polyethylenglykol)-2000], [DSPE-PEG(2000)-biotin]</td><td>Avanti</td><td>880129</td><td>biotinyliertes Lipid</td></tr><tr><td>BODIPY-TR-C5-Ceramid</td><td>Molekulare Sonden (ThermoFisher)</td><td>D7540</td><td>fluoreszierendes Lipid</td></tr><tr><td>BODIPY- FLC5-hexadecanoylphosphatidylcholin (HPC*)</td><td>Molekulare Sonden (ThermoFisher)</td><td></td><td>fluoreszierendes Lipid zur Kalibrierung der Proteindichte</td></tr><tr><td>Ei L-&alpha;-phosphatidylcholin (eggPC)</td><td>Avanti</td><td>840051</td><td>zur Kalibrierung der Röhrchenradiuskonstante</td></tr><tr><td>&beta;-Kasein aus Rindermilch (>99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td>zur Passivierung der Mikropipette und der Experimentierkammer</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>D(+) Glukose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Loser</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Pt-Drähte, 0,5 mm Durchmesser, 99,99% rein</td><td>Goodfellow Deutschland</td><td>PT005139</td><td>für den GUV-Elektroformungsfunktionsgenerator</td></tr><tr><td></td><td></td><td>n/a</td><td>zur Stromerzeugung für den GUV-Elektroformungskitt-Dichtstoff</td></tr><tr><td></td><td>Vitrex (von CML France)</td><td>CRIT 140013</td><td>zur Abdichtung des Elektroformungskammerbad-Ultraschallators</td></tr><tr><td></td><td></td><td>verwendet n/a</td><td>nützlich für die Reinigung der Elektroformungskammer, aber nicht entscheidend</td></tr><tr><td>Nikon TE2000 inverses Mikroskop, eC1 konfokales System (Nikon), mit zwei Laserlinien (&lambda; = 488 nm und 543 nm); optische Pinzette, induziert durch einen 5 W Ytterbiumfaser-Dauerstrichlaser (&lambda; > 1070 nm; IPG GmBH Deutschland)</td><td></td><td></td><td>ein Beispiel für ein konfokales Mikroskopiesystem, ausgestattet mit optischen Pinzetten</td></tr>, <tr><td>Mikromanipulatoren</td><td></td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatkapillaren (mit Innen- und Außenradien von 0,78 mm bzw. 1 mm)</td><td>Harvard-Gerät</td><td>30-0036</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2100</td><td></td></tr><tr><td>microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-800</td><td></td></tr><tr><td>piezoelektrischer Aktuator</td><td>Physik Instrumente</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol Streptavidin beschichtete Kügelchen (Durchmesser 3,2 &μ; m)</td><td>Spherotech</td><td>SVP-30-5</td><td></td></tr></tbody></table>

membran-nanoröhrchen ziehen aus riesigen unilamellar vesikel

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Die Umgestaltung der Zellmembran ist ein integraler Bestandteil der viele zelluläre Phänomene, z. B. Endozytose, Menschenhandel, die Bildung von Filopodien, etc.. Viele verschiedene Proteine assoziieren mit gebogenen Membranen aufgrund ihrer Fähigkeit, Sinn oder Membran Krümmung zu induzieren. Diese Prozesse beinhalten in der Regel eine Vielzahl von Proteinen macht sie zu komplex, um quantitativ in der Zelle zu studieren. Wir beschreiben ein Protokoll, um eine gebogene Membran in Vitro, rekonstruieren imitiert eine gebogene Zellstruktur, wie der endocytic Hals. Ein giant Unilamellar Vesicle (GUV) dient als ein Modell der Zellmembran, dessen Innendruck und Oberflächenspannung mit Mikropipette Aspiration gesteuert werden. Anwendung einer Zugkraft von Punkt auf der optischen Pinzette GUV erstellt ein Nanotube starken Kurven auf eine flache Membran verbunden. Diese Methode ist traditionell verwendet, um die grundlegenden mechanischen Eigenschaften der Lipidmembranen, wie biegen Steifigkeit zu messen. In den letzten Jahren wurde es erweitert um Interaktion von Proteinen mit Membran-Krümmung und die Art und Weise, die Sie die Form und die Mechanik der Membranen beeinflussen, zu studieren. Ein System verbindet Mikromanipulation, Mikroinjektion, optische Pinzette und konfokalen Mikroskopie ermöglicht Messung der Krümmung der Membran Membran Spannung und die Flächendichte von Proteinen, gleichzeitig. Aus diesen Messungen können viele wichtige mechanische und morphologische Eigenschaften von Protein-Membran-System abgeleitet werden. Darüber hinaus legen wir ein Protokoll GUVs im Beisein von physiologischen Salzkonzentration und eine Methode zur Quantifizierung der Flächendichte von Proteinen auf der Membran von Fluoreszenz-Intensität von markierte Proteine und Lipide zu schaffen.

Das Rohr ziehen Experiment kann wichtige mechanische Informationen über die Membran geben. Bei fehlender Proteine oder andere Moleküle, die paar mit Krümmung der Membran, die Membran zu erzwingen und Rohr-Radius kann mit Membran Spannung bezogen werden, durch die Anwendung der Canham Helfrich Hamiltonian zog Gleichung zu einem Schlauch aus GUV50,51 
<img alt="Equation 3"...

Viele Proteine in der Zelle spüren und Krümmung der Membran zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zur Membran Nanoröhrchen aus Lipid Vesicles, die Interaktion von Proteinen oder jede Krümmung-aktive Molekül mit gebogenen Membranen in VitroStudie ziehen.

Membran-Nanoröhrchen ziehen aus riesigen Unilamellar Vesikel

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode zum Ziehen von Nanoröhren ist es, die Wechselwirkungen zwischen bestimmten Proteinen von Interesse und stark gekrümmten Membranen quantitativ zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Biologie von Zellmembranen zu beantworten, wie z. B. Endozytose und intrazellulärer Transport. Diese Technik ermöglicht es uns, direkt zu quantifizieren, wie Proteine an gekrümmte Membranen binden und diese wechselseitig verformen.Ursprünglich wurde diese Methode verwendet, um die grundlegenden mechanischen Eigenschaften von Lipidmembranen zu messen. In jüngster Zeit wurde es eingesetzt, um wichtige Mechanismen in der Interaktion von Proteinmembranen, insbesondere von proteinformenden Membranen, aufzuklären. Beginnen Sie damit, die riesigen unilamellären Vesikel direkt von den Platindrähten der Elektroformationskammer zu sammeln.Um die Versuchskammer zu konstruieren, legen Sie zwei rechteckige Glasabdeckungen im Abstand von einem Millimeter auf eine metallische Unterlage, wobei an den langen Rändern Öffnungen vorhanden sind, die groß genug sind, damit eine Mikropipettenspitze aus Glas zumindest bis zur Mitte der Kammer reichen kann. Füllen Sie sowohl die Versuchskammer als auch eine Mikropipette aus Glas mit fünf Milligramm pro Milliliter einer hochreinen Beta-Kasein-Lösung, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen. Während die Kammer passiviert wird, montieren Sie sie auf ein Lichtmikroskop, das zentriert über dem Objektiv angeordnet ist, und führen Sie die Spitze der Aspirationsmikropipette durch die Öffnung entlang der langen Kante, bis sich die Spitze über dem Objektiv befindet.Stellen Sie den Füllstand des Wassertanks so ein, dass der Aspirationsdruck nahe Null liegt, und füllen Sie eine Injektionsmikropipette mit dem in experimentellen Puffer gelösten Molekül in der entsprechenden experimentellen Konzentration. Montieren Sie die Injektionsmikropipette in einem Mikromanipulator und führen Sie die Mikropipette durch die andere Seite der Versuchskammer ein. Am Ende der Inkubation nehmen Sie die Beta-Kaseinlösung aus der Kammer und spülen Sie die Kammer mehrmals mit experimentellem Puffer aus.Geben Sie dann einige Mikroliter Vesikellösung in die Kammer, gefolgt von einigen Mikrolitern Streptavidin-beschichteten Kügelchen, bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mal 10 bis zur negativen Beadsrate von 3 % pro Volumen oder weniger. Nachdem sich die Vesikel und Kügelchen am Boden der Kammer abgesetzt haben, lassen Sie den experimentellen Puffer etwa 15 Minuten lang verdampfen, woraufhin sich die Vesikel unter einem Lichtmikroskop sichtbar wellen sollten. Wenn die Vesikel entsprechend schlaff sind, aspirieren Sie einzelne Vesikel in die Mikropipette, bis die Längen der Membranen innerhalb der Pipette gleich oder größer als der Pipettenradius sind.Wenn eine Aspirationszunge in der richtigen Größe identifiziert wurde, verschließen Sie die offenen Ränder der Kammer mit Mineralöl. Um die Nullstellung des Aspirationsdrucks einzustellen, positionieren Sie das Ende der Aspirationspipette in der Nähe einer Perle und stellen Sie die Höhe des Wassertanks so ein, dass die Perle weder angesaugt noch von der Pipette weggeblasen wird. Die Einstellung der Höhe des Wassers ist entscheidend, um die Membranspannung des Vesikels zu kontrollieren, das von der Mikropipette abgesaugt wird.Aspirieren Sie ein Vesikel und bewegen Sie die Mikropipette nach oben und unscharf, ohne die Mikropipette zu beschädigen. Fangen Sie mit einer optischen Pinzette eine Perle etwa 20 Mikrometer vom Boden der Kammer entfernt ein. Bringen Sie das Vesikel wieder in den Fokus, weg von der Perle und ausgerichtet mit der optischen Falle, und zeichnen Sie die Bewegung der Perle ein bis zwei Minuten lang auf, um die Gleichgewichtsposition zu messen.Reduzieren Sie den Druck in der Mikropipette so weit wie möglich, ohne das Vesikel zu verlieren, um die Membranspannung zu verringern, und bringen Sie das Vesikel etwa eine Sekunde lang vorsichtig mit der Perle in Kontakt, um die Streptavidin-Biotin-Bindungen herzustellen. Ziehen Sie dann mit einem Piezoaktor das Vesikel vorsichtig zurück, um eine Nanoröhre zu erzeugen. Erhöhen Sie den Aspirationsdruck, um die Aspirationszunge nachzubilden, und richten Sie den Schlauch innerhalb der Achse der Aspirationspipette aus.Bringen Sie die Röhre und das Vesikel vollständig in den Fokus und zeichnen Sie die Bewegung der Perle mit einer Erfassungsgeschwindigkeit von 30 Hertz und die Höhe des Wassertanks in Bezug auf die Nullposition für einige Minuten unter Hellfeldmikroskopie auf. Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, zeichnen Sie die Bewegung der Raupe bei unterschiedlichen Aspirationsdrücken und Membranspannungen erneut auf. Um Proteine oder Moleküle von Interesse zu injizieren, bringen Sie die Injektionsmikropipette in die Nähe des Nanoröhrchens, achten Sie darauf, dass die Kugel in der optischen Falle nicht gestört wird, und injizieren Sie die Proteine vorsichtig mit einem bis zwei Pascal Druck.Nachdem sich die Proteinbindung äquilibriert hat, wiederholen Sie die schrittweisen Messungen in Gegenwart der hinzugefügten Proteine, wie für die nackte Membran gezeigt. Kraft- und Radiusmessungen an Nanoröhren, die aus 100%igen DOPC-Vesikeln gezogen werden, sind unabhängig, da die Kraft aus der Verschiebung der Perle in der optischen Falle und der Radius aus der Fluoreszenzintensität gemessen wird, was zwei Möglichkeiten zur Berechnung der Biegesteifigkeit der Membran bietet. Die relative Anreicherung von BAR- oder Kaliumkanalproteinen auf Membranröhrchen über den darunter liegenden Vesikeln deutet darauf hin, dass die Proteine mit größerer Wahrscheinlichkeit an gekrümmte Membranen binden.Tatsächlich reduziert die Bindung des N-BAR-Proteins Endophilin A2 an die Membran die Kraft der Röhre allmählich auf Null, was auf die Bildung eines dreidimensionalen Gerüsts hinweist, das die Röhre stabil hält. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Techniken kombiniert werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. hochauflösende Mikroskopie zum Nachweis der Proteinorganisation auf Membranröhrchen oder Einzelpartikelverfolgung zur Messung der Proteinmobilität.

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Forschung

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Biology

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