Confocal Imaging von Neuropeptid Y-pHluorin: eine Technik, um Insulin Granulat Exozytose in intakten murinen und menschliche Inseln visualisieren

Das übergeordnete Ziel dieses Assays besteht darin, die exozytotische Freisetzung von Insulin-Granula in Echtzeit in intakten Pankreasinseln mittels konfokaler Mikroskopie sichtbar zu machen. Diese Methode wird wichtige Fragen im Bereich der Diabetesforschung beantworten. Zum Beispiel: Was reguliert die Insulin-Exozytose?

Das ist entscheidend, weil die Granula-Fusion das wichtigste Ereignis im Leben einer Beta-Zelle darstellt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir intakte Inseln verwenden können und Fusionsevents in Zellen innerhalb ihres nativen Milieus beobachten können. Madina Mahkmutova, eine Doktorandin aus unserem Labor, wird die Technik demonstrieren.

Beginnen Sie, nachdem die Pankreasinseln eingetroffen sind, damit, diese in 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen zu überführen und die Inseln-Suspension bei 1.000 Umdrehungen pro Minute fünf Minuten lang zu zentrifugieren. Die Inseln sammeln sich am Boden des Röhrchens. Überführen Sie die Inseln in zwei Milliliter CMRL-Kulturmedium in 35-Millimeter-Petri-Schalen mit nicht gewebe-kulturgeeigneter Oberfläche und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor eine virale Infektion erfolgt. Nach ihrer Isolierung werden etwa äquivalente Mengen an Maus-Pankreasinseln in zwei Milliliter CMRL-Kulturmedium resuspendiert und in 35-Millimeter-Petri-Schalen mit nicht gewebe-kulturgeeigneter Oberfläche überführt.

Inkubieren Sie das Gewebe 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bevor die virale Infektion durchgeführt wird. Um die virale Infektion durchzuführen, geben Sie fünf bis 10 Mikroliter Stammlösung des Virus zu jeder 35-Millimeter-Petri-Schale, die humane oder murine Inseln in zwei Millilitern CMRL-Kulturmedium enthält. Nach einer 24-stündigen Kultivierung der Inseln saugt man das Medium ab und ersetzt es durch zwei Milliliter CMRL-Kulturmedium ohne Virus.

Kultivieren Sie die Inseln vier bis sechs Tage lang und wechseln Sie das Medium alle drei Tage. Bereiten Sie die extrazelluläre Lösung vor, indem Sie die hier aufgeführten Reagenzien kombinieren und anschließend den Puffer filtrationssterilisieren. Stellen Sie das Basalglucose-Medium mit einer endgültigen Glucosekonzentration von drei Millimolar her, indem Sie 75 Mikroliter einer zwei Molaren Glucose-Stammlösung zu 50 Millilitern extrazellulärer Lösung hinzufügen.

Dann zur Herstellung eines hyperglykämischen Mediums mit einer endgültigen Glukosekonzentration von 16 Millimolar 400 Mikroliter einer zwei-molaren Glukose-Stammlösung zu 50 Millilitern extrazellulärer Lösung hinzufügen. Weitere Stimuli sowie die extrazelluläre Lösung, die drei Millimolar Glukose enthalten, verdünnen. Vor Beginn eines Experiments Deckgläser mit 30 Mikrolitern einer Lösung von einem Milligramm pro Milliliter Poly-D-Lysin vorbehandeln und eine Stunde inkubieren.

Anschließend spülen Sie die Deckgläser gründlich mit Wasser ab. Mindestens eine Stunde vor dem Experiment überführen Sie eine Gruppe von Inseln in eine 35-Millimeter-Petrischale, die extrazelluläre Lösung mit drei Millimolar Glukose enthält. Bewahren Sie die verbleibenden Inseln bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid auf.

30 Minuten vor Beginn des Experiments befestigen Sie den Deckglaser an der Bildgebungskammer, indem Sie ihn mit Silikonfett abdichten. Danach fixieren Sie die Bildgebungskammer auf der Bildgebungsplattform. Anschließend überführen Sie mit einer Pipette 20 bis 30 Inseln in den mit Poly-D-Lysin behandelten Bereich des Deckgläsers und lassen die Inseln 20 Minuten lang an der Oberfläche anhaften.

Dieser Schritt ist entscheidend für den Erfolg des Experiments, und wir sammeln etwa 20 bis 30 Inseln in weniger als 10 Mikrolitern Puffer und warten 20 Minuten. Es ist wichtig, dass der Deckel nicht vollständig austrocknet, um Schäden an den Inseln zu vermeiden. Während die Inseln an dem Deckel haften, bereiten Sie das Perfusionsystem vor, indem Sie es gründlich mit Wasser spülen.

Anschließend jede Lösung gemäß dieser Tabelle in einen separaten Kanal geben. Alle Blasen aus dem System entfernen, indem jeder Kanal einzeln geöffnet und die Lösung einige Minuten lang fließen gelassen wird. Sicherstellen, dass der Durchfluss gleichmäßig ist und die Schläuche nicht lecken.

Als Nächstes schließen Sie den einzelnen Inline-Lösungserhitzer an das Perfusionsabflussrohr an und stellen die Temperatur des austretenden Puffers auf 37 Grad Celsius ein. Bereiten Sie dann die Saugpumpe vor. Schließen Sie die Schläuche an, schalten Sie die Pumpe ein und stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit abgesaugt wird.

Platzieren Sie die Bildgebungsplattform mit den Inseln auf dem Mikroskopständer und schließen Sie sie an das Perfusionsystem und den Saugpumpen an. Füllen Sie dann die Bildgebungskammer vorsichtig mit der extrazellulären Lösung, die drei Millimolar Glukose enthält. Um die konfokale Bildgebung durchzuführen, lokalisieren Sie die Inseln im Mikroskopfeld mit niedriger Vergrößerung.

Wenn die Inseln scharfgestellt sind, wechseln Sie zu Objektiven mit höherer Vergrößerung. Öffnen Sie die Aufnahmesoftware und aktivieren Sie den integrierten Scanmodus. Wählen Sie die xyzt-Bildgebung und konfigurieren Sie anschließend die Aufnahmeeinstellungen, indem Sie den Argonlaser einschalten und auf 30 % einstellen sowie die 488-Nanometer-Laserlinie aktivieren und die Laserleistung für die Anregung von pHluorin auf etwa 50 % anpassen.

Sammeln Sie die Emission bei 505 bis 555 Nanometern, wobei Sie das EGFP-Emissionsspektrum als Leitfaden verwenden. Wählen Sie eine Auflösung von 512 mal 512 Pixeln. Beginnen Sie die Aufnahme, indem Sie die Live-Taste drücken, und passen Sie die Verstärkungseinstellungen an.

Stellen Sie das Anfangsende des Z-Stapels ein, indem Sie auf die Oberseite des Inselapparats fokussieren, „Begin“ auswählen, dann zur letzten Ebene wechseln, auf die noch fokussiert werden kann, und „n“ wählen. Wählen Sie eine Z-Stapel-Größe von fünf Mikrometern. Legen Sie das Zeitintervall für die Aufnahme jedes Z-Stapels nahe bei 1,5 bis 2 Sekunden fest und wählen Sie die Option „Aufnahme, bis gestoppt wird“, für eine kontinuierliche Bildaufnahme.

Drücken Sie dann die Starttaste, um die Bildaufnahme zu starten. Weitere Informationen zu Stimulationsprotokollen zur Induktion der Granula-Exozytose finden Sie im Textprotokoll. Mithilfe des integrierten Scanners werden konfokale Bilder des Inselapparats als Zeitrafferaufnahmen in weniger als zwei Sekunden aufgezeichnet.

Außerdem kann diese Technik mit Farbstoffen für die funktionelle Bildgebung kombiniert werden, beispielsweise mit Farbstoffen für das Membranpotential oder für freies zytosolisches Calcium. Um zu überprüfen, ob NP Y-pHluorin tatsächlich ein geeignetes Werkzeug zur Beobachtung der Dynamik von Insulin-Granula ist, wurden infizierte Inseln mit Antikörpern gegen GFP für NP Y-pHluorin sowie gegen die Inselhormone Insulin, Somatostatin oder Glucagon immungestrichen. Die meisten Zellen, die NP Y-pHluorin exprimierten, waren Beta-Zellen, da sie ebenfalls Insulin exprimierten.

Nur wenige Glucagon-positive Alpha-Zellen oder Somatostatin-positive Delta-Zellen waren mit GFP markiert. Wichtig ist, dass bei infizierten Zellen die NP-Y-Fusion mit Insulin koinzidierte. Diese Abbildung zeigt, dass pHluorin ein wirksamer pH-Sensor ist.

Da die Erhöhung des intrazellulären pH-Werts durch 50 Millimolar Ammoniumchlorid zu einem Anstieg der intrazellulären Fluoreszenz um mehr als 500 % führte, werden Granula, die NP Y-pHluorin enthalten, unter Bedingungen sichtbar, die die Insulin-Exozytose stimulieren, wie beispielsweise die Membran-Depolarisation mit Kaliumchlorid, wenn der pH-Wert im Granulum durch Fusion mit der Plasmamembran und dem Öffnen des Fusionspores ansteigt. Mithilfe der konfokalen Zeitrafferaufnahmen von mit NP Y-pHluorin infizierten Inseln können einzelne sekretorische Ereignisse in Beta-Zellen innerhalb intakter Inseln visualisiert werden.

Sie treten als Reaktion auf eine direkte Membrandepolarisation mit Kaliumchlorid oder mehreren anderen physiologischen Reizen auf. Bei der basalen extrazellulären Glukosekonzentration wird kaum sekretorische Aktivität beobachtet. Allerdings wird die Granulafusion mit der Plasmamembran als Reaktion auf eine Stimulation mit hoher Glukose ausgelöst.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Immunhistochemie angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, warum die Granelfusion in bestimmten Bereichen der Zelle stattfindet. Nach ihrer Entwicklung wurde diese Technik verwendet, um das zeitliche Muster der Insulingranelsekretion in Beta-Zell-Populationen von menschlichen Inseln zu untersuchen.