In-vitro- Charakterisierung der elektrophysiologischen Eigenschaften des Kolon afferenten Fasern in Ratten

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Methodik für die elektrophysiologische Aufzeichnung von sensorischen Nerven des Kolorektums in vitro zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im In-vitro-Stiftfeld zu beantworten, wie z. B. den Beitrag der Empfindlichkeit der äußeren peripheren Effergene zur Korrektur der Hyperalgesie. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Unterscheidung des Kolorektums auf die gleiche Weise ermöglicht, wie die Halsschlagaderunterscheidung in vivo, bei Tieren oder bei Patienten durchgeführt wird.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Lokalisierung der Ganglien und das Präparieren der Nerven relativ schwierig sind. Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie die Bauchhöhle einer tief anästhesierten Ratte frei, indem Sie mit einem Skalpell einen Mittellinienschnitt an der Bauchdecke durchführen. Ziehen Sie anschließend das Mesenterium und andere Gewebe beiseite, um das Kolorektum freizulegen.

Legen Sie das Tier dann unter das Präpariermikroskop. Lokalisieren Sie durch vorsichtige Dissektion das linke Beckenganglion und identifizieren Sie die Beckennerven und die damit verbundenen lumbalen Splanchnikusnerven. Schneiden Sie anschließend diese Nerven einige Millimeter vom Beckenganglion entfernt ab.

Die Lokalisierung des Beckenganglions und das Präparieren von Nerven ist der kritischste und schwierigste Schritt dieses Verfahrens. Schneiden Sie als Nächstes den Symphysenknochen ab, um das Rektum freizulegen. Entfernen Sie das Gewebe über dem Dickdarm und achten Sie darauf, das Beckenganglion intakt zu lassen.

Nachdem Sie die Ratte durch intravenöse Injektion einer Überdosis Pentobarbital geopfert haben, durchschneiden Sie den Dickdarm etwa drei Zentimeter über dem Beckenganglion und entfernen Sie das Kolorektum mit einer Pinzette vom Tier. Übertragen Sie anschließend das Kolorektum in eine Petrischale, die mit vorgekühlter Krebslösung gefüllt ist. Entfernen Sie den Kot, indem Sie den Dickdarm vorsichtig spülen.

Entfernen Sie anschließend vorsichtig die verbleibende Harnblase und andere Gewebe, ohne das Beckenganglion zu beeinträchtigen. Bei diesem Verfahren wird der Dickdarm in eine Aufzeichnungskammer gelegt und das Gewebe kontinuierlich mit karbogenierter Krebslösung überschwemmt. Als nächstes kanülieren Sie das Kolorektum sowohl am oralen als auch am analen Ende, beginnen Sie dann mit der intraluminalen Infusion des Dickdarms mit Kochsalzlösung in oraler bis analer Richtung, lokalisieren Sie danach das große Beckenganglion unter dem Präpariermikroskop und verwenden Sie Insektenstifte, um das Ganglion freizulegen.

Suchen Sie nach vorsichtiger Sektion einen feinen Ast des Nervs, der vom Ganglion ausgeht und in Richtung Dickdarm verläuft, und schneiden Sie dann den Nerv in der Nähe des Ganglions durch. Schalten Sie vor dem nächsten Schritt das Heizbad ein und halten Sie die Krebslösung bei 34 Grad Celsius. Untersuchen Sie nun eine vorgezogene Glaspipette unter dem Präpariermikroskop.

Brechen Sie die Spitze der Elektrode mit einer Pinzette auf, so dass sie eine Größe hat, die mit dem Durchmesser des aufzunehmenden Nervs kompatibel ist. Lehnen Sie danach die Spitze ab, indem Sie sie in der Nähe eines helleren Flares platzieren. Neu in dieser Methode kann es auch schwierig sein, die Spitze der Elektrode so abzuschrägen, dass sie mit der Größe des Nervs kompatibel ist.

Legen Sie anschließend die abgeschrägte Elektrode in den Elektrodenhalter und schließen Sie dann eine 10-Milliliter-Spritze an den seitlichen Anschluss des Halters an, um einen Unter- oder Überdruck auf die Elektrode auszuüben. Verbinden Sie danach die Halterung mit der Kopfstufe des Bioverstärkers und montieren Sie die Kopfstufe auf einen Manipulator. Bewegen Sie anschließend die Elektrode in das Gewebebad und füllen Sie die Elektrode mit der Krebslösung, indem Sie sie leicht ansaugen, bis sie den Silberdraht des Halters berührt.

Platzieren Sie dann die Elektrodenspitze in der Nähe des abgeschnittenen Endes des Nervs und üben Sie Unterdruck aus, um den Nerv in die Elektrode zu saugen. Üben Sie dann mehr Unterdruck aus, so dass etwa ein Millimeter des Nervs in die Elektrode gezogen wird und einen dichten Verschluss bildet. Schalten Sie nun den Bioverstärker ein und stellen Sie den Filter auf 300 bis dreitausend Hertz ein.

Überwachen Sie das Signal auf dem Oszilloskop und zeichnen Sie das Nervensignal und das intraluminale Drucksignal in der Spike-Datenverarbeitungssoftware auf. Als nächstes wenden Sie eine Rampendehnung des Dickdarms an, indem Sie den Drei-Wege-Hahn an der Auslasskanüle schließen, während Sie kontinuierlich intraluminal infundieren. Überwachen Sie den intraluminalen Druck, bis er 60 Millimeter Quecksilbersäule erreicht, und öffnen Sie dann den Drei-Wege-Hahn an der Ablasskanüle.

Wiederholen Sie diesen Vorgang in regelmäßigen Abständen von fünfzehn Minuten und wenden Sie Medikamente extra oder intraluminal an, um die chemische Empfindlichkeit der afferenten Nerven zu testen. Hier ist die schematische Darstellung des Versuchsaufbaus für die ex vivo Tubenkolorektumpräparation mit einer repräsentativen Aufnahme von einem Nerv distal zum Beckenganglion. In den Präparaten von normalen Ratten weisen die afferenten Nervus colonus typischerweise ein geringes Maß an regelmäßiger spontaner Aktivität auf.

Die Rampendehnung des Dickdarms führt zu einer allmählichen Erhöhung der Brenngeschwindigkeit. Die mechanosensorische Eigenschaft jedes Nervs wird durch die Darstellung der intraluminalen druckafferenten Nervenreaktionskurve dargestellt. Alternativ kann die Aufzeichnung von einem Ast der Beckennerven proximal des Beckenganglion erfolgen.

Das Profil der mechanosensorischen Aktivität der proximalen Beckennerven ähnelt in der Regel dem des Nervus distal des Beckenganglions. Die Hauptkomponentenanalyse der Wellenformen der Aktionspotentiale aus der Multiunit-Aufzeichnung kann durchgeführt werden, um die Aktivität einer einzelnen Einheit zu unterscheiden. Hier sind die überlagerten Wellenformen von zwei einzelnen Beckenafferenen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die Anatomie der großen Beckenganglien und der anderen Nerven haben und in der Lage sein, die Ganglien zu lokalisieren, um die Nerven zu präparieren und die afferente Aktivität aufzuzeichnen. Ein Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es den Vergleich der elektrophysiologischen Eigenschaften und der pharmakologischen Profile des Beckennervs und des Nervus splanchnicus afferent ermöglichen kann.