Name: Eine Anleitung zur Produktion, Kristallisation und Strukturaufklärung von menschlichen IKK1/α (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Erfahren Sie die Produktion, Kristallisation und Strukturaufklärung von humanem IKK1/α für die Signaltransduktionsforschung. Diese Methode ermöglicht rationales Drug Design und liefert wertvolle Einblicke in die Immunsignaling.

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Wir bedanken uns bei die Mitarbeiter an die Beamlines 19ID, 24ID-Chek und 13ID bei Advanced Photon Source, Lemont, Illinois, für die Unterstützung während der Datenerfassung auf verschiedenen Kristalle. Wir sind dankbar, Dmitry Lyumkis, Salk Institute für das Abrufen von uns der niedrige Auflösung-Cryo-EM-Karte in frühen Stadien der EM Karte/Modellbau, die verwendet wurde, um das ursprüngliche IKK1 molekulare Ersatz Suche Modell zu bauen. Die Forschung führt zu diesen Ergebnissen wird finanziell vom NIH-Stipendien, AI064326, CA141722 und GM071862, GG. SP ist zurzeit Wellcome Trust DBT Indien Intermediate Fellow.

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<li>Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+p100+processing+by+NF-kappaB-inducing+kinase+involves+docking+IkappaB+kinase+alpha+%28IKKalpha%29+to+p100+and+IKKalpha-mediated+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation.</a> The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).</li>
<li>Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB-inducing+kinase+regulates+the+processing+of+NF-kappaB2+p100%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100.</a> Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).</li>
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Die Autoren erklären keine finanziellen Interessenkonflikte oder andere Interessenkonflikte.

Produktion, Kristallisation und Struktur Lösung zweier verwandter IKK-Proteine Wir wollten die Röntgen-Kristallstruktur des IKK1/α mit dem Begriff feststellen, dass es eine relativ einfache Übung, die aufgrund unserer Erfahrungen mit IKK2/β Proteinproduktion, Kristallisation und Strukturaufklärung wäre. Allerdings waren wir sehr überrascht, dass diese zwei verwandte Proteine über die Leichtigkeit der Kristallisation sehr unterschiedlich Verhalten. Trotz der Bemühungen von mehreren hochkarätigen Labors...

Transkriptionelle Aktivitäten der NF-κB-Familie von dimeres Transkriptionsfaktoren sind erforderlich für verschiedene Zellfunktionen Entzündung und Immunität bis hin zu überleben und sterben. Diese Aktivitäten werden in Zellen und einem Verlust der Verordnung führt zu verschiedenen pathologischen Bedingungen, einschließlich der Autoimmun-Krankheiten und Krebs1,2,3streng kontrolliert. In Ermangelung eines Reizes sind die Aktivitäten der NF-κB gehemmt durch IκBα (Inhibitor - κB) Proteine4gehalten. Die Phosphorylierung des spezifischen Ser Rückstände auf IκBα Proteine markiert diese für Ubiquitination und anschließende proteasomalen Abbau oder selektive Verarbeitung5. Zwei hochgradig homologe Ser/Thr-Kinasen, IKK2/β und IKK1/α, fungieren als zentrale Regulatoren des NF-κB-Aktivitäten durch die Durchführung diese Phosphorylierung Veranstaltungen6,7.
Wechselwirkungen zwischen einem Ligand und Rezeptor transduces ein Signal durch eine Reihe von Mediatoren führt zur Aktivierung von NF-κB-Faktoren. Der NF-κB-Signalisierung-Prozess kann grob in zwei unterschiedliche Wege – kanonischen und nicht-kanonischen (alternative)8aufgeteilt werden. Die Aktivität der IKK2/β regelt in erster Linie die NF-κB Signalisierung der kanonischen Weges, der für entzündliche und angeborene Immunantwort9unerlässlich. Ein besonderes Merkmal dieser Weg ist eine schnelle und kurzlebigen Aktivierung von IKK2/β10 innerhalb einer komplexen bisher biochemisch Fußgelenkes IKK – vermutet, bestehend aus IKK1 und IKK2 sowie eine regulatorische Komponente, NEMO (NF-κB wesentliche Modulator )11,12,13. Zwischen den zwei katalytische IKK Untereinheiten des IKK-komplexes, IKK2 ist in erster Linie verantwortlich14 für die Phosphorylierung von spezifischen Rückständen von prototypischen IκBs (α, β- und γ-) verpflichtet, NF-κB, und auch eine atypische IκBα Protein NF-κB1/p105 ist ein Vorläufer des NF-κB p50 Untereinheit5. Phosphorylierung induzierten Ubiquitination und proteasomalen Abbau von IκBα (oder Verarbeitung von p105) führt zur Freisetzung und Aktivierung eines bestimmten Satzes von NF-κB Dimere15. Aberrante NF-κB-Aktivität durch MIS geregelte Funktion des IKK2 ist bei vielen Krebsarten, wie Autoimmun-Krankheiten2,3,16beobachtet worden.
Im Gegensatz zu IKK2/β reguliert die Aktivität von IKK1/α NF-κB Signalisierung des nicht-kanonischen Weges, die wesentlich für die Entwicklung und Immunität. IKK1 phosphorylates bestimmte Rückstände des NF-κB2/p100 auf Segment C-terminalen IκBδ, führt zu deren Verarbeitung und die Generierung von p52. Die Bildung von transcriptionally aktiv P52:RelB Heterodimer initiiert eine langsame und nachhaltige Antwort auf Entwicklungsstörungen Signale7,17,18,19,20. Interessanterweise ist die Generation der zentralen NF-κB Faktor p52 dieses Pfades ein weiterer Faktor, NF-κB induzierende Kinase (NIK)21,22, aber nicht auf IKK2 oder NEMO kritisch abhängig. Ruhende Zellen bleibt das Niveau der NIK aufgrund seiner konstanten Proteasom-abhängige Abbau23,24,25. Nach Stimulation der Zellen durch "nicht-kanonischen" Liganden und in bestimmten malignen Zellen NIK wird stabilisiert, um zu rekrutieren und aktivieren IKK1 / α-Kinase die Tätigkeit der NIK und IKK1 sind wesentlich für die effiziente Verarbeitung der p100 zu p527. IKK1 und NIK phosphorylieren drei Serine (Ser866, 870 bis 872) des NF-κB2/p100 auf seinem C-terminalen IκBδ Segment führt zu deren Verarbeitung und die Generierung von p52. Aberrante Aktivierung der nicht-kanonischen Weg hat in vielen Malignome einschließlich Multiples Myelom26,27,28verwickelt.
Einige höchst effiziente und spezifische Hemmstoffe für IKK2/β sind bekannt, obwohl keines bisher erwies haben sich als um ein wirksames Medikament zu sein. Im Gegensatz dazu sind IKK1/α-spezifische Inhibitoren spärlich. Dies kann stammen teilweise aus unser Mangel an strukturelle und biochemische Informationen über IKK1/α, das unser Verständnis der mechanistischen Grundlagen der Aktivierung von NF-κB von IKK1 in den Zellen und rationalen Wirkstoffdesign einschränkt. Die Röntgen-Strukturen der IKK2/β hat uns Einblicke in den Aktivierungsmechanismus von IKK2/β-29; Diese Strukturen könnten zeigen jedoch nicht wie andere vorgelagerte Reize auslösen Aktivierung des IKK1/α oder IKK2/β, verschiedene Gruppen von NF-κB Aktivitäten 30,31zu regulieren. Die mechanistische Grundlage zugrunde liegenden unterschiedlichen Signalfunktion von IKK1/α zu verstehen und eine Plattform für rationale Wirkstoffdesign etablieren, konzentrierten wir uns auf die Struktur von IKK1/α.

<table><tbody><tr><td>Cellfectin/Cellfectin II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362100</td><td>Cellfectin wird nicht mehr hergestellt und durch Cellfectin II</td></tr><tr><td>Sf900 III ersetzt Insektenzellmedium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>SF9-Zellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12659017</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IKK1-Antikörper</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56704</td><td>Zuvor verkauft von Imgenex</td></tr><tr><td>anti-PentaHis Antikörper</td><td>Qiagen</td><td>34460</td><td></td></tr><tr><td>PVDF-Membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Nitrocellulose können auch verwendet werden</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Assay Reagenz</td><td>BioRad</td><td>500001</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Konzentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024</td><td></td></tr><tr><td>Compound A</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calbiochem IKK-Inhibitor XII</td><td>Calbiochem</td><td>401491</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporin</td><td>SIGMA</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>MLN120B</td><td>Millenium</td><td>Geschenkartikel</td><td></td></tr><tr><td>AMPPNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647</td><td></td></tr><tr><td>Dextransulfat</td><td>SIGMA</td><td>51227, 42867, 31404,</td><td></td></tr> <tr><td>Dextransulfat</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62101</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>SIGMA</td><td>93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172</td><td>Einige von ihnen sind neu Kat # im SIGMA Katalog. Was wir hatten, war ursprünglich von Fluka, das unterschiedliche Kat # hatte.</td></tr><tr><td>Kristallisationssiebe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen I und II (Crystal Screen HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-130</td><td></td></tr><tr><td>Index HT</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-134</td><td></td></tr><tr><td>PEG/Ion und PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>PEGRX 1 und PEGRx 2 (PEGRx HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-086</td><td></td></tr><tr><td>SaltRx 1 und SaltRx 2 (SaltRx HT)</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-136</td><td></td></tr><tr><td>Kristall-Montierungen</td><td>Hampton Research</td><td>HR8-188, 190, 192, 194</td><td></td></tr><tr><td>Synchrotron</td><td>Die Advanced Photon Source (APS) im U.S. Department of Energy s Argonne National Laboratory</td><td>Beamline 19 ID</td><td>Die fortschrittliche Photonenquelle (APS) im U.S. Department of Energy' Das Argonne National Laboratory stellt ultrahelle, hochenergetische ringerzeugte Röntgenstrahlen für die Forschung in fast allen wissenschaftlichen Disziplinen zur Verfügung.</td></tr></tbody></table>

eine anleitung zur produktion, kristallisation und strukturaufklärung von menschlichen ikk1/α

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

Eine Klasse von extrazellulären Reize erfordert die Aktivierung von IKK1/α induzieren eine NF-κB-Untereinheit, p52, durch Verarbeitung von seinen Vorläufer-p100-Generation. P52 Funktionen als Homodimer oder Heterodimer mit einem anderen NF-κB-Untereinheit, RelB. Diese Dimere Regeln wiederum den Ausdruck von Hunderten von Genen beteiligt sind Entzündungen, Zelle überleben und Zellzyklus. IKK1/α bleibt in erster Linie als ternäre Komplex IKK2/β und NEMO zugeordnet. Ein kleiner Pool es wird jedoch auch als eine niedermolekulare complex(es) beobachtet. Es ist unbekannt, ob die p100-Verarbeitung-Aktivität durch Aktivierung der IKK1/α innerhalb der größeren oder kleineren komplexen Pool ausgelöst wird. Konstitutive Aktivität von IKK1/α wurde in verschiedenen Krebsarten und entzündlichen Erkrankungen erkannt. Um den Mechanismus der Aktivierung von IKK1/α zu verstehen, und seine Verwendung als Medikament Ziel, ausgedrückt wir rekombinanten IKK1/α in anderen Host-Systemen, wie E. Coli, Insekt und Säugerzellen. Uns gelungen, mit dem Ausdruck lösliche IKK1/α in Baculovirus Insektenzellen, mg-Mengen an hoch reines Protein zu erhalten, in Anwesenheit von Inhibitoren kristallisieren und Bestimmung der Röntgen-Kristallstruktur infiziert. Hier beschreiben wir die einzelnen Schritte um das rekombinante Protein, die Kristallisation und seine x-ray Kristall Strukturbestimmung zu produzieren.

Klonierung und Expression von verschiedenen Konstrukte der IKK1/α Voller Länge, die, den menschliche IKK1/α in das Baculovirus Ausdruck Vektor pFastBacHTa innerhalb seiner EcoRI und NotI Restriktionsschnittstellen zu einer N-terminalen Hexa-Histidin geklont wurde, gekennzeichnet IKK1. Der Tag könnte von TEV Protease Verdauung entfernt werden. Da IKK1/α in voller Länge flexible Regionen an beiden Enden enthält und flexible Regionen in der Regel ein Protein erschweren zu...

IκBα Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) ist ein Ser/Thr-Proteinkinase, die in einer Vielzahl von zellulären Aktivitäten in erster Linie durch Aktivierung von NF-κB Transkriptionsfaktoren beteiligt ist. Hier beschreiben wir die wichtigsten Schritte für die Produktion und Kristall Strukturbestimmung dieses Proteins notwendig.

Eine Anleitung zur Produktion, Kristallisation und Strukturaufklärung von menschlichen IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Ziel dieses Verfahrens ist es, Orientierungshilfen für die Herstellung, Kristallisation und strukturelle Bestimmung des menschlichen IKK1-alpha zu geben, um die mechanistische Grundlage seiner Signalfunktion zu verstehen und Plattformen für rationales Arzneimitteldesign zu schaffen. Diese Methode sollte Forschern helfen, die Struktur von IKK1 zu bestimmen, die Antworten auf wichtige Fragen im Bereich der Immunsignalisierung liefern würde. Diese Technik beschreibt einen schlanken Weg zur Gewinnung von Kristallen von IKK-Proteinen, die eher feuerfest zur Kristallisation sind, und um verschiedene kritische Informationen zur Überwindung von Engpässen bei der Bestimmung der Strukturen zu liefern.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil die Erzeugung von Milligramm Mengen an löslichem, wohlerzogenem Protein seine Expression in Insektenzellen erfordert und die Kristallisation nur unter einem sehr engen Fenster von Bedingungen erfolgen kann. Das molekulare Ersatzverfahren, das bei der Bestimmung der Struktur von IKK1 verwendet wird, kann auch sehr schwierig sein, insbesondere aufgrund der schlechten Ablenkeigenschaften der Kristalle, nicht

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Biochemistry

Biochemie

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Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken

Wir beschreiben Protokolle zur Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO durch Röntgenkristallographie. Die Methoden umfassen Proteinexpression, Reinigung und Charakterisierung sowie Strategien zur erfolgreichen Kristalloptimierung und Strukturbestimmung des Proteins in seiner ungebundenen Form.

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO

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Ableitung von Proteinkristallen mit I3C mit Random Microseed Matrix Screening

Dieser Beitrag beschreibt, wie man die Proteinkristallisation auf Crystal-on-Crystal-Geräten einrichtet und wie man eine automatisierte serielle Datenerfassung bei Raumtemperatur mit der On-Chip-Kristallisationsplattform durchführt.

On-Chip-Kristallisation und großflächige serielle Beugung bei Raumtemperatur

Erfahren Sie die Produktion, Kristallisation und Strukturaufklärung von humanem IKK1/α für die Signaltransduktionsforschung. Diese Methode ermöglicht rationales Drug Design und liefert wertvolle Einblicke in die Immunsignaling.

Eine Anleitung zur Produktion, Kristallisation und Strukturaufklärung von menschlichen IKK1/α

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