Name: In VivoKultivierung-wie Murine Astrozyten über das schnelle, einfache und kostengünstige AWESAM-Protokoll (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Lernen Sie das AWESAM-Protokoll zur schnellen, einfachen und kostengünstigen Kultivierung muriner Astrozyten mit in-vivo-ähnlichen Eigenschaften. Diese Methode ermöglicht Studien zur Calcium-Signalgebung und Astrozytenbiologie.

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Wir anerkennen die Finanzierung durch den Europäischen Forschungsrat (RP7/260916), die Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DE1951 und SFB889).

Alle hier beschriebenen Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien für den deutschen Tierschutz durchgeführt.
Hinweis: Die Timeline und die Hauptschritte des Protokolls sind in Abbildung 1dargestellt.
1. Vorbereitungen
<ol><li>
Bereiten Sie die folgenden Lösungen.
	<ol>
<li>Vorbereiten der DMEM + Kultivierung polygonale MD Astrozyten: DMEM mit 10 % FCS, 100 U Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin.</li>
		<li>Vorbereiten der Kultivierung stellate Astrozyten NB + H: Neurobasal Medium mit 5 ng/mL HBEGF, 1 x B-27 Ergänzung, 1 X Glutamin ergänzen, 100 U Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin. Hinweis: Aliquote höherer Konzentrationen von HBEGF erstellt und gespeichert werden können bei-20 ° C auf das Medium bei Bedarf hinzugefügt werden.</li>
		<li>Bereiten Sie die Dissektion Medium (10 mM HEPES in HBSS).</li>
		<li>Bereiten Sie Aliquote von 6-7 mL 0,05 % Trypsin-EDTA und 6-7 mL 0,25 % Trypsin-EDTA in 15 mL-Tuben. Diese können bei-20 ° C gelagert und in einem 37 ° C Wasserbad aufgetaut.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Am Tag vor Beginn des Protokolls Mantel 10 cm Gewebekultur-behandelten Gerichte mit 5 mL je 0,04 % Polyethylenimine (PEI).</li>
	<li>Am nächsten Tag die PEI zu entfernen und den Abwasch mit destilliertem, entionisiertem Wasser zweimal. Jede Platte 12 mL DMEM + hinzu und Pre-equilibrate im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für mindestens 30 min vor der galvanischen Zellen.</li>
	<li>Vorbereiten der Dissektion Bereich: In einer Laminar-Flow Dissektion Kapuze, legen Sie zwei 10 cm Petrischalen mit Dissektion Medium auf Eis gefüllt. Für jeden Bereich des Gehirns werden isoliert (z.B.Kortex, Hippocampus), bereiten Sie eine 15-Röhre mit 14 mL Dissektion Medium gefüllt und halten Sie auf dem Eis. Sprühen Sie Dissektion Werkzeuge (feine Schere, Dumont #3 und #5 Zangen) mit 70 % Ethanol und Platz neben Dissektion Mikroskop in der Kapuze.</li>
</ol>(2) Ratte oder Maus Gehirn Dissektion
Hinweis: Beide Mäuse und Ratten eingesetzt werden. Tiere, die älter als P8 kann auch verwendet werden (wir testeten bis P12), aber die Hirnhaut entfernen wird zunehmend schwieriger geworden. Darüber hinaus werden sich die Zellausbeute und Gesundheit abnehmen, da Gehirnzellen von älteren Tieren gebildet haben, komplizierte Prozesse und Verbindungen, die im Gewebe Dissoziation, führt zu erhöhte Zelltod brechen können. Kortikale Vorbereitungen werden hier beschrieben, aber andere Hirnregionen können auch verwendet werden.
<ol><li>Legen Sie 0,05 % Trypsin-EDTA in einem 37 ° C Wasserbad.</li>
	<li>Einschläfern von Tieren (trächtigen Ratten für E19 Welpen oder P0-P8 Tiere) durch langsames anheben CO2 -Konzentration und die Gehirne zu isolieren. Die folgenden Schritte erfordern sterilen Technik.</li>
	<li>
Arbeiten mit embryonalem Gewebe entfernen Sie zunächst die Embryonen aus der Gebärmutter und die embryonalen Säcke zu öffnen, dann sofort die Köpfe mit einer Schere abgeschnitten. Wenn alle Köpfe abgeschnitten sind, in vorgekühlte Dissektion Medium übertragen.
	<ol>
<li>Sobald die Köpfe in das Medium eingetaucht sind, öffnen Sie die Haut und Schädel (beide sind sehr weich bei Jungtieren) mit Zange und Prise aus dem Kleinhirn. Hebeln Sie vorsichtig den Rest des Gehirns, und aus dem Schädel. Hinweis: Zwei bis vier E19 Embryonen liefern genügend Gewebe für mindestens acht 10 cm Gerichte der kortikalen Astrozyten, die am Tag der Dissektion auf 500.000 Zellen pro Schale vergoldet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für Neugeborene oder älteren Welpen die Köpfe mit einer Schere abgeschnitten und die Gehirne von medial schneiden Sie die Haut in einer geraden Linie von der Rückseite des Kopfes bis zur Spitze der Nase zu isolieren. Ziehen Sie die Haut beiseite und sorgfältig geschnitten, der Schädel links und rechts und heben der Schädel Knochen. Das Kleinhirn abgeschnitten, und den Rest des Gehirns aus dem Schädel heraus hebeln. Hinweis: Zwei bis drei P0-P8 Welpen liefern genügend Gewebe für mindestens acht 10 cm Gerichte der kortikalen Astrozyten, die am Tag der Dissektion auf 500.000 Zellen pro Schale vergoldet.</li>
	<li>Die zugrunde liegende Struktur des Zwischenhirns trennen Sie Kortex. Legen Sie die Zange innerhalb der längs-Riss zwischen den Hemisphären, fahren Sie die Zange zwischen Kortex und Mittelhirn Strukturen der südlichen Hemisphäre (senkrecht zur längs-Riss) jede Hemisphäre frei zu klemmen.</li>
	<li>Mit der Pinzette, entfernen Sie alle Hirnhaut aus jeder Hemisphäre (und den Hippocampus), dann trennen Sie die Hippocampi. Wenn hippocampale Astrozyten erforderlich sind, verschieben Sie jedes Hippocampus in eine 15 mL-Tube mit 14 mL Dissektion Medium auf Eis gefüllt.</li>
	<li>Entfernen Sie weitere Bereiche von jeder Hemisphäre Kortex, wenn bestimmte Regionen erforderlich (z.B.frontalen Kortex) sind. Schneiden Sie alle kortikalen Gewebe verwendet werden, für die Erzeugung von Astrozyten in Stücke, die nicht größer als 1 mm3. Sammeln Sie alle Stücke von kortikalen Gewebe in einer separaten 15-mL-Tube mit Dissektion Medium auf Eis gefüllt.</li>
</ol>(3) Gewebe Verdauung und Dissoziation
<ol><li>Sobald alle Gewebe Stücke gesammelt sind, warten Sie, bis sie an der Unterseite des Rohres zu Regeln, dann aspirieren Sie soviel Mittel wie möglich.</li>
	<li>Fügen Sie 2-3 mL 0,05 % Trypsin-EDTA mit einer serologischen Pipette, und inkubieren Sie die Rohre im Wasserbad 37 ° C für 20 min. Hinweis: Lassen Sie alle Trypsin-EDTA aus der Pipette rasch zu mischen die Gewebe-Stücke und lassen Sie sich wieder.</li>
	<li>Aspirieren Sie sorgfältig die Trypsin-EDTA, so dass Gewebe Stücke in als wenig Flüssigkeit wie möglich, am unteren Ende der Röhre.</li>
	<li>Fügen Sie 5 mL Medium vorgekühlt Dissektion der verbleibenden Trypsin-EDTA abwaschen. Pipette auf die Seite des oberen Teils des Rohres zu erreichen der Gewebe Stücke mischen.</li>
	<li>Aspirieren der Dissektion Medium, und Gewebe Stücke in als wenig Flüssigkeit wie möglich zu verlassen. Wiederholen Sie diese Waschschritt mit vorgekühlten Dissektion Medium noch zweimal.</li>
	<li>Fügen Sie nach dem letzten Waschschritt 1 mL DMEM + (auf Zimmertemperatur erwärmt) mit 1.000 µL Pipettenspitze und das Gewebe durch Pipettieren genannte oben und unten ohne Luftblasen einzuführen. Hinweis: Es ist wichtig, zu vermeiden, Herstellung von Bläschen, da dies, den pH-Wert der Lösung ändern kann, auf die Astrozyten sehr empfindlich sind.</li>
	<li>Ein 100 µm Zelle Sieb in der Eröffnung einen 50-mL-Tube und Vornässen des Filters mit 4,5 mL vorgekühlte DMEM +.</li>
	<li>Pipette 1 mL der dissoziierten Gewebe Suspension auf die Zelle Sieb und fügen Sie eine weitere 4,5 mL vorgekühlt DMEM + die Zellen durch die Zelle Sieb zu waschen.</li>
</ol>(4) Zelle Überzug für Astrozyten Bereicherung durch Passagierung
<ol><li>Zählen Sie die Zellen, z. B.durch Verdünnen 10 µL Zellsuspension mit 10 µL Trypan blau und Pipettieren der Mischung auf eine Hemocytometer.</li>
	<li>Platte 500.000 Zellen in 12 mL DMEM + pro 10 cm Schale. Hinweis: DMEM + ist nützlich für astrocytic Wachstum, mehr noch als für Neuronen oder Mikroglia. Beim Schütteln sind die körperlichen Kräfte auf Glasdeckgläser im Brunnen viel stärker als die in der 10-cm-Gerichte (ohne Deckgläsern) handeln. Wenn Zellen auf 24-Well Platten erschüttert sind, sie zu ungesunden oder sterben. Nur Platte Astrozyten auf 24-Well-Platten nach dem schütteln.</li>
	<li>Halten Sie Zellkulturen im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für sieben Tage.</li>
	<li>Am 6. Tag bereiten Sie am Vortag schütteln und Passagierung Zellen, die Kultur PEI-beschichteten Platten wie in Schritt 5 beschrieben.</li>
</ol>5. Passagierung Zellen
<ol><li>
Am Vortag Passagierung, Mantel Zellplatten Kultur mit 0,04 % PEI.
	<ol>
<li>Verwenden Sie für Immunocytochemistry, virale Transduktion oder Plasmid Transfektion 24 wohlen oder 6-Well-Platten (jeweils eine sterilisierte 12 mm oder 25 mm Glas Deckglas, beziehungsweise).</li>
		<li>Sterilisieren Sie der Glasdeckgläser durch Inkubation in 70 % igem Ethanol für mindestens 1 h, dann waschen Sie dreimal in destilliertem, entionisiertem Wasser vor dem Einlegen der Deckgläsern in den Brunnen zu.</li>
		<li>Fügen Sie mindestens 70 µL 0,04 % PEI pro 12 mm Deckglas in 24-Well-Platten und 600 µL 0,04 % PEI pro 25 mm Deckglas in 6-Well Platten.</li>
		<li>Für Western-Blot oder RNA-Seq-Analyse können die 10 cm Gerichte bereits enthalten die Zellen nach der Dissektion weiterhin verwendet werden. Gerichte müssen nur geschüttelt werden, dann die Zellen sind mit 1 X PBS gewaschen und mit NB + H behandelt (nicht auf neue Gerichte übertragen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Am Tag in Vitro (DIV) 7 nach der Präparation die 10-cm-Gerichte mit Zellen in DMEM + auf einem Labor-Shaker im Inkubator und schütteln Sie die Gerichte bei 110 u/min für 6 h.</li>
	<li>Das PEI aus beschichteten Deckgläsern mit destilliertem, entionisiertem Wasser zweimal abwaschen. Die Platten (500 µL pro Bohrloch für 24-Well-Platten und 2 mL pro Bohrloch für 6-Well Platten) NB + H Medium hinzufügen. Pre-equilibrate die Platten im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 während die 10 cm Teller Zittern oder für mindestens 30 Minuten.</li>
	<li>20-30 Minuten vor dem Ende des 6 h schütteln, Vorwärmen 1 X PBS, DMEM + NB + H und 0,25 % Trypsin-EDTA auf 37 ° C im Wasserbad.</li>
	<li>Nach 6 h schütteln, den Shaker Kultur Gerichte ausziehen und sofort ersetzen das Medium (das erschüttert aus Nervenzellen und Oligodendrozyten Mikroglia enthält) mit 10 mL vorgewärmt 1 X PBS pro Schale. Hinweis: Es ist wichtig, sofort das alte Medium freistehende Zellen zur Vermeidung von nicht-astrocytic Zellen wieder anbringen Aspirieren.</li>
	<li>Entfernen der PBS und 3 mL vorgewärmten Trypsin-EDTA pro Schale. Inkubieren Sie jedes Gericht für 4 min. im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2. Hinweis: Wenn Vorbereitung von Proben für Western-Blot oder RNA-Seq fügen Sie keine Trypsin-EDTA. Stattdessen vorgewärmt ersetzen die PBS mit 12 mL NB + H, nach denen Kulturen wieder in den Inkubator platziert werden können.</li>
	<li>Fügen Sie 5 mL vorgewärmten DMEM + bis 3 mL Trypsin-EDTA in jedem Gericht, die Zellen von der Schüssel mit einer serologischen Pipette 5 mL pipette und sammeln die Zellsuspension in ein 50 mL-Tube. Hinweis: Pipette direkt aus dem Boden der Schale - sollte der Boden der Schale deutlicher als die Zellen lösen. Verwenden Sie nur Serum-haltigen Medium (anstelle von DMEM +), da Serum Trypsin inaktiviert.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension 3.220 x g bei 20 ° C für 4 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL vorgewärmt NB + H.</li>
</ol>6. Zelle Überzug für endgültige Astrozyten Kulturen
<ol><li>Zählen der Zellen.</li>
	<li>Platte, 20.000 Zellen pro Bohrloch in 6-Well-Platten (in 2 mL NB + H Medium pro Well) oder 5.000 pro Bohrloch in 24-Well-Platten (in 500 µL NB + H Medium pro Well).</li>
	<li>Bewahren Sie die Zellkulturen im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 bis Weiterbehandlung oder Analyse.</li>
	<li>Tauschen Sie halbe Medium einmal pro Woche. Hinweis: In nährstoffarme Umgebungen, Astrozyten stoppen wuchern aber alle restlichen Mikroglia wird sich vermehren (obwohl nach unserer Erfahrung keine Mikroglia in AWESAM Kulturen erschienen). Austausch von halbe Medium einmal wöchentlich Bereicherung jeder potenziell verbleibenden Mikroglia-8 verhindert, und die Monokulturen für mindestens drei Wochen gesund bleiben.</li>
</ol>

<ol><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li>
<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF+affects+astrocyte+morphology%2C+proliferation%2C+differentiation%2C+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li>
<li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li>
<li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2%2B+signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Krencik, R., Zhang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li>
<li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+regulation+of+calcium+oscillation+in+astrocytes+by+growth+factors+and+pro-inflammatory+cytokines+via+the+mitogen-activated+protein+kinase+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade.</a> J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).</li>
<li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cells+in+astroglial+cultures%3A+a+cautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4, 26(2007).</li>
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<li>Royo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li>
<li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes%3A+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, Pt 17 4271-4300 (2011).</li>
<li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2%28-%2F-%29+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li>
<li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
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<li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Vier Schritte innerhalb des Protokolls sind von entscheidender Bedeutung: 1) Vorbereitung der HBEGF-Konzentration auf genau 5 ng/mL, da kleine Erhöhungen der Konzentration zu unreif Kulturen, z. B.führen können 10 ng/mL HBEGF de differenzieren Astrozyten4; (2) Vermeidung von Luftblasen in den Lösungen, die Gewebe oder Zellen, die den pH-Wert verändern und behindern Astrozyten Gesundheit enthalten; (3) Pre-ausgleichende Medien, der optimale pH-Wert und Temperatur für den Anbau von gesunder...

Astrozyten beeinflussen die Funktion des Gehirns durch trophischen Unterstützung, Durchblutung, synaptische Signalisierung und Plastizität und interzelluläre Kommunikation - sind die Mechanismen, die drehen sich um die dünnen astrocytic Prozesse. Die hier beschriebene AWESAM-Protokoll ermöglicht das Studium dieser Prozesse ohne Einmischung von Neuronen und anderen Gliazellen, die nützlich z.B.ist, weil der Ausdruck vieler Proteine und sogar Ca2 + Signalisierung über verschiedene Gehirnzelle überlappen Typen. Weiter, diese Methode überwindet Grenzen der bisher verfügbaren Techniken. Unser Protokoll sieht insbesondere in Vivo-wie Morphologie (stellate Astrozyten mit dünnen Prozesse) und Genexpression in eine schnelle, einfache und billige Weise.
Zellmorphologie, Genexpression und viele andere regulatorische Prozesse sind direkt durch die Umgebung beeinflusst. In der Kulturschale bezieht sich auf Faktoren von umgebenden Zellen, sondern auch das Medium, in dem die Zellen gezüchtet werden, veröffentlicht. Astrozyten HBEGF wurde zuvor berichtet, dass ein Ganglion Morphologie1 induzieren sondern wurde auch festgestellt, dass um Astrozyten2de-zu unterscheiden. Niedrigere Konzentrationen von HBEGF dienten jedoch später zur Erzeugung von mehr in-Vivo-wie Astrozyten über RNA Sequenzierung in zwei verschiedene Protokolle3,4identifiziert. Darüber hinaus ändert sich Astrozyten Morphologie mit mittlerer Zusammensetzung, unabhängig von dem Protokoll Nr.4: Neurobasal Medium mit einer niedrigen Konzentration von HBEGF ist optimal für den Anbau von Ganglion Astrozyten, während andere mittlere Kompositionen (z.B. Serum-haltigen DMEM) produzieren polygonale Zellen (auch in Astrozyten frisch durch Immunopanning isoliert).
Das AWESAM-Protokoll überwindet Nachteile der bisherigen Techniken für den Anbau von Astrozyten Monokulturen4. Bisherige Techniken für den Anbau von Monokulturen Astrozyten haben folgende Nachteile: polygonale Morphologie, die untypisch für Ganglion Astrozyten in Vivo (MD-Methode)5; die Länge und die Kosten des Protokolls (Vorbereitung Astrozyten von induzierten pluripotenten Stammzellen dauert drei Monate und erfordert viele Reagenzien, einschließlich teuer Wachstumsfaktoren)6; die geringen Mengen an Material (Immunopanning Methode)3; und die de-Differenzierung der Astrozyten und Anforderung einer 3D Matrix (Puschmann Et Al) 1 , 2. im Gegensatz dazu bietet das AWESAM-Protokoll: in Vivo-wie Morphologie (stellate Astrozyten mit dünnen Prozesse); eine schnelle, einfache und billige Methode; große Mengen an Material; und die in-Vivo-wie Genexpression im Vergleich mit Immunopanned und MD Astrozyten. Darüber hinaus kann 2D Kultur für die Untersuchung von Ca2 + Signal- und recycling in dünnen Prozesse und Ereignisse in der Nähe der Membran Vesikel (z.B.TIRF-Mikroskopie ist nicht möglich in 3D Kulturen).
Die MD-Methode wurde seit seiner Veröffentlichung im Jahr 19805, bietet eine einfache und schnelle Technik für polygonale Astrozyten Monokulturen ausgiebig verwendet. Kurz gesagt, die MD-Methode bringt wachsenden gemischten Gehirnzellen in fetalen Kälberserum (FCS)-mit DMEM, gefolgt von schütteln Schritte, die für Astrozyten (wie alle anderen Arten von der Schale lösen Gehirnzelle) bereichern und weiter im gleichen Medium Kultur. DMEM ergänzt mit FCS dient vielen anderen Zelltypen, Fibroblasten und Adipozyten bis hin zu verschiedenen Krebszelllinien, die teilen die polygonale Morphologie von MD Astrozyten in Kultur ausgestellt. Bis zu den frühen 2000er Jahren7, war wenig Gedanken gewesen Medien zugeschnitten auf Astrozyten gegeben, insbesondere zugunsten ihrer typischen stellate Morphologie in Vivogefunden. Ein Protokoll veröffentlicht im Jahr 2011 wird solche stellate Morphologie erreicht: die Immunopanning-Methode aufgerufen, es beschäftigt serumfreien Medium für die Kultivierung von Astrozyten3optimiert. Mit dieser Methode sind frisch isolierte Gehirnzellen ausgesetzt eine Reihe von Gerichten beschichtet mit Antikörpern, die auf Zelle typspezifische Zelle Oberflächenproteine für Astrozyten zu bereichern. Trotz mehr in-Vivo-wie Morphologie und Ausdruck Profil Immunopanned Astrozyten, die Mehrheit der in-vitro- Studien noch auf die MD Astrozyten Methode verlassen. Die MD-Methode ist einfach und schnell, während die Immunopanning-Methode komplexe und zeitaufwendige Schritte am ersten Tag der Kultur umfasst (z. B. Enzym Verdauung längere, sorgfältige Schichtung der Lösungen von unterschiedlicher Dichte, Immunopanning, und Zentrifugation Schritten - alles vor der Beschichtung). Die AWESAM-Methode bietet jedoch mithilfe von spezielleren Medium sowohl die Geschwindigkeit der MD-Methode und die in-Vivo-wie Morphologie des Immunopanning-Protokolls.
Insgesamt das AWESAM-Protokoll eignet sich für ein Studium mehr in Vivo-wie Astrozyten in 2D Monokulturen von Neuronen und anderen Glia (wie bisher charakterisierten4 von Immunostainings, Immunoblots und RNA Sequenzierung) isoliert. Es ermöglicht die Untersuchung von dünnen astrocytic Prozessen und bietet guten Zugang zur Visualisierung von spontanen Ca2 + Signalisierung und Veranstaltungen in der Nähe der Membran (z.B.durch TIRF-Mikroskopie abgebildet).

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>warm in 37 & ordm; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>warm in 37 & ordm; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>B-27 Ergänzung</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50X Lager</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100X Lager</td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>50 Lager; Penicillin: 5000 U/ml; Streptomycin: 5000 &Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>ohne L-Glutamin</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>HBEGF</td><td>Sigma</td><td>4643</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td>1X</td></tr><tr><td>100 &mu; m Nylon-Zellsieb</td><td>BD</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hera Cell 240i Zellkultur-Inkubator</td><td></td></tr><tr><td>Laborschüttler</td><td>Heidolph</td><td>Rotamax 120&nbsp;</td><td>Verwendung im Zellkultur-Inkubator</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivokultivierung-wie murine astrozyten über das schnelle, einfache und kostengünstige awesam-protokoll

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Die AWESAM (ein low- eAsy sTellate einStrocyte methode Kosten) Protokoll beinhaltet einen schnelle, einfachen und kostengünstigen Weg, um große Mengen von in-Vivo-wie Maus und Ratte Astrozyten Monokulturen : Die Gehirnzellen können aus verschiedenen Gehirnregionen isoliert werden, und nach einer Woche der Zellkultur sind nicht astrocytic Zellen indem die Kultur Gerichte auf einem Boston-Shaker für 6 h im Inkubator abgeschüttelt. Die restlichen Astrozyten sind dann in neue Platten mit einem Astrozyten-spezifischen Medium (NB + H bezeichnet) passagiert. NB + H enthält geringe Konzentrationen des Heparin-Binding EGF-Like Growth Factor (HBEGF), die anstelle von Serum in Medium verwendet wird. Nach einem Wachstum in NB + H, haben AWESAM Astrozyten ein Ganglion Morphologie und Funktion feinen Prozesse. Darüber hinaus haben diese Astrozyten mehr in-Vivo-wie gen-Expression als Astrozyten von zuvor veröffentlichten Methoden generiert. Ca2 + Bildgebung, Vesikel Dynamik und andere Veranstaltungen in der Nähe der Membran können somit in der feinen astrocytic Prozesse in Vitro, z. B.mit live Zelle konfokale oder TIRF-Mikroskopie untersucht werden. AWESAM Astrozyten zeigen vor allem auch spontan Ca2 + Signalisierung Astrozyten in Vivoähnlich.

Astrozyten, die gemeinsam mit Neuronen kultiviert und angebaut in NB + Medium erscheinen Ganglion nach 2 Wochen der Kultur (Abbildung 2). Neben NB + Medium sind Co kultivierten Astrozyten auch unbekannte Neuron-abgeleitete Faktoren ausgesetzt, die wahrscheinlich um ihr Überleben und Ihre Morphologie beitragen. Im Gegensatz dazu erscheinen MD Astrozyten in DMEM + als Monokulturen angebaut (nach anderen Zelltypen vor Passage abschütteln) polygonalen nach 2 Woch...

Die hier beschriebene AWESAM-Protokoll ist optimal für die Kultivierung von murinen Astrozyten isoliert von anderen Gehirnzellen in eine schnelle, einfache und kostengünstige Weise. AWESAM Astrozyten weisen spontane Ca2 + -Signalisierung, Morphologie und gen Expressionsprofile Astrozyten in Vivoähnlich.

In VivoKultivierung-wie Murine Astrozyten über das schnelle, einfache und kostengünstige AWESAM-Protokoll

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mit einer einfachen, schnellen und kostengünstigen Methode Astrozyten-Monokulturen herzustellen, die in vivo-ähnliche Eigenschaften aufweisen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Astrogliobiologie zu beantworten, beispielsweise nach der Ökonomie der physikalischen Freisetzung oder Aufnahme durch Astrozyten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die resultierenden Zellen Astrozyten in vivo hinsichtlich Morphologie, mRNA- und Proteinausprägung sowie interzellulärer Kalziumschwankungen stark ähneln.Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie den Präparationsbereich vor, indem Sie zwei mit Dissektionsmedium gefüllte 10-cm-Petri-Schalen auf Eis in einer laminaren Luftströmungs-Präparationshaube platzieren. Für jedes zu isolierende Hirnareal bereiten Sie ein 15-mL-Röhrchen mit 14 mL Dissektionsmedium vor und stellen es auf Eis. Danach besprühen Sie die Dissektionsinstrumente mit 70 % Ethanol und legen sie neben das Präparationsmikroskop in die Haube.Wenn Sie mit embryonalem Gewebe arbeiten, entfernen Sie zuerst die Embryonen aus dem Uterus und öffnen Sie die embryonalen Hülle. Schneiden Sie sofort die Köpfe mit einer Schere ab. Sobald alle Köpfe abgetrennt sind, überführen Sie sie in vorab gekühltes Dissektionsmedium.Sobald die Köpfe in das Medium eingetaucht sind, öffnen Sie mit einer Pinzette Haut und Schädel und trennen Sie das Kleinhirn ab. Hebeln Sie dann vorsichtig den Rest des Gehirns aus dem Schädel heraus. Danach trennen Sie den Cortex von der darunterliegenden Struktur des Mittelhirns ab.Platzieren Sie die Pinzette in der Längsspalte zwischen den Hemisphären und führen Sie sie zwischen die Großhirnrinde und die Mittelhirnstrukturen der einen Hemisphäre ein, um jede Hemisphäre abzuklemmen. Entfernen Sie anschließend sämtliche Hirnhäute von jeder Hemisphäre und trennen Sie die Hippocampi voneinander ab. Falls Hippocampus-Astrozyten benötigt werden, überführen Sie jeden Hippocampus in ein 15-mL-Gefäß, das mit 14 mL Dissektionsmedium auf Eis gefüllt ist.Danach jegliches kortikale Gewebe, das zur Erzeugung von Astrozyten verwendet werden soll, in Stücke schneiden, die nicht größer als ein Kubikmilliliter sind. Anschließend alle Gewebestücke in einem separaten 15-mL-Röhrchen mit Dissektionsmedium auf Eis sammeln. Sobald alle Gewebestücke gesammelt sind, warten, bis sie sich am Boden des Röhrchens abgesetzt haben.Danach so viel Medium wie möglich abpipettieren. Anschließend 2–3 mL 0,05 %iger Trypsin-EDTA zugeben und die Proben zwanzig Minuten lang in einem 37 °C warmen Wasserbad inkubieren. Danach das Trypsin-EDTA vorsichtig abpipettieren, wobei die Gewebestücke mit einer minimalen Flüssigkeitsmenge am Röhrchenboden zurückbleiben.Fügen Sie anschließend 5 mL vorgekühltes Dissektionsmedium hinzu, um das verbleibende Tripsin-EDTA abzuwaschen, und pipettieren Sie die Mischung an die Seite des oberen Rohrs, um eine Vermischung der Gewebestücke zu erreichen. Danach saugen Sie das Dissektionsmedium ab und lassen die Gewebestücke mit so wenig Flüssigkeit wie möglich zurück. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal mit vorgekühltem Dissektionsmedium.Nach dem letzten Waschschritt 1 mL D-Mem Plus bei Raumtemperatur hinzufügen und das Gewebe durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren, ohne Blasen zu erzeugen, triturierten. Astrozyten sind sehr empfindlich gegenüber pH-Wert-Änderungen, daher ist es wichtig, die Bildung von Blasen zu vermeiden, da diese den pH-Wert der Lösung verändern könnten. Als Nächstes einen 100-Mikron-Zellsieb in die Öffnung eines 50-mL-Röhrchens stellen und das Filtermaterial mit 4,5 mL vorab gekühltem D-Mem Plus vorbenetzen.Pipettieren Sie 1 mL der dissoziierten Gewebesuspension auf den Zellfilter und geben Sie weitere 4,5 mL vorgekühltes D-Mem Plus hinzu, um die Zellen hindurchzuwaschen. Am siebten Tag in vitro nach der Dissektion stellen Sie die 10-cm-Platten mit Zellen in D-Mem Plus auf einen Schüttler im Inkubator und schütteln die Platten 6 Stunden lang mit 110 U/min. 20 bis 30 Minuten vor dem Ende der sechsstündigen Schüttelphase erwärmen Sie 1× PBS, D-Mem Plus, NB+H und 0,25 % Trypsin-EDTA im Wasserbad auf 37 Grad.Nach 6 Stunden Schütteln die Kulturschalen vom Schüttler nehmen und das Medium sofort durch 10 mL vorgewärmtes 1× PBS pro Schale ersetzen. Anschließend das entfernte PBS abgießen und 3 mL vorgewärmtes Trypsin-EDTA pro Schale hinzufügen. Danach die Proben vier Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.Wenn Proben für einen Western Blot oder eine RNA-Sequenzierung vorbereitet werden, darf kein Tripsen-EDTA hinzugefügt werden. Stattdessen das PBS durch 12 mL vorgewärmtes NB+H ersetzen, wodurch die Kulturen anschließend wieder in den Inkubator gestellt werden können. Danach 5 mL vorgewärmtes D-Mem Plus zu 3 mL Tripsen-EDTA in jeder Petrischale hinzufügen.Die Zellen mit einer Pipette von der Schale ablösen und die Zellsuspension in einem 50-mL-Röhrchen sammeln. Anschließend die Zellsuspension bei 3220 × g und 20 °C für 4 Minuten zentrifugieren. Danach das Überstand entfernen und das Zellpellet in 1 mL vorgewärmtem NB+H erneut suspendieren.Diese Bilder zeigen, dass G-camp-transduzierte Astrozyten spontane Kalziumionenereignisse in den gesamten Astrozyten-Netzwerken aufweisen, einschließlich in den dünnen Fortsätzen. Hier breitet sich eine Kalziumionenwelle von links nach rechts durch mehrere Astrozyten in den Aufnahmen zu verschiedenen Zeitpunkten aus, wobei helle Farben Bereiche mit hohen Kalziumionenkonzentrationen darstellen und schwarze Bereiche extrazelluläre Regionen repräsentieren. In diesem Diagramm sind die zeitlichen Änderungen der Kalziumionenkonzentration in den farbkodierten Bereichen dargestellt, die als G-camp-Fluoreszenzintensitätsverläufe gezeigt werden und veranschaulichen, wie sich eine Kalziumionensignalwelle über mehrere Astrozyten ausbreitet.Wenn man diese Technik beherrscht, kann sie in einer Stunde und fünfzehn Minuten durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Live-Cell-Imaging in Kombination mit Transfektion oder viralen Transduktionsexperimenten durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise, welche Ereignisse in Astrozytenmembranen stattfinden. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man in vivo ähnliche astrozytäre Kulturen auf einfache, schnelle und kostengünstige Weise herstellt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Das Video zeigt eine Technik zur Kultivierung primärer Astrozyten aus der Rattenrinde. Die Hirnrinde wird mechanisch dissoziiert, um eine homogene Gliazellsuspension zu erhalten, die dann auf Polypeptid-beschichteten Platten plattiert wird, um die selektive Proliferation von Astrozyten zu fördern. Anschließend werden die Astrozyten enzymatisch von den Platten dissoziiert und auf frische Medien überführt, was die Kultivierung reiner Astrozyten ermöglicht.

Generierung einer Primärkultur von Astrozyten aus dem Gehirn eines Rattenwelpen

Das Video zeigt eine einfache Methode, um murine Astrozyten isoliert von anderen Gehirnzellen zu kultivieren. Während der Kultivierung werden durch die Verwendung von Astrozyten-spezifischen Medien und die Hemmung der Adhärenz nicht-astrozytärer Zellen selektiv Astrozyten kultiviert. Diese kultivierten Astrozyten weisen eine sternförmige Morphologie mit feinen Fortsätzen auf.

Eine einfache Technik zur Isolierung und Kultivierung von murinen Astrozyten

Dieses Video zeigt die direkte Reprogrammierung von Astrozyten, die transformierende Faktoren in Neuronen exprimieren. Transformationsfaktoren lösen eine Kaskade von molekularen Ereignissen aus, die die Umwandlung von Astrozyten in Neuronen erleichtern. Der Prozess wird zusätzlich durch die Zufuhr von spezifischen Wirkstoffen und Nahrungsergänzungsmitteln über ein neuronales Differenzierungsmedium unterstützt.

Direkte neuronale Reprogrammierung von Maus-Astrozyten in Neuronen

Astrozyten wurden erkannt, vielseitige beteiligten Zellen in grundlegender biologischer Prozesse, die wichtig für die normale Entwicklung des Gehirns und Funktion, und das zentrale Nervensystem Reparatur sein. Hier präsentieren wir ein schnelles Verfahren zur reinen Maus Astrozytenkulturen erhalten, um die Biologie dieser wichtigen Klasse von zentralen Nervensystems Zellen zu untersuchen.

Isolation und Kultur von Maus Kortikale Astrozyten

Phänotypische Wildtyp-Astrozyten und neurale Stammzellen, die von Mäusen entnommen wurden, die mit floxierten, bedingten onkogenen Allelen gezüchtet und über virale Cre-vermittelte Rekombination transformiert wurden, können zur Modellierung der Astrozytom-Pathogenese in vitro und in vivo durch orthotope Injektion von transformierten Zellen in Gehirne von syngenen, immunkompetenten Wurfgeschwistern verwendet werden.

Modellierung Astrozytom Pathogenese In-vitro- Und In Vivo Verwenden kortikale Astrozyten oder neuralen Stammzellen aus dem Bedingten, gentechnisch veränderte Mäuse

Wir modifizieren und Umsetzung eines bereits veröffentlichten Protokoll beschreibt die schnelle, reproduzierbare und effiziente Differenzierung von humanen 12 pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) in exzitatorischen kortikalen Neuronen induziert. Insbesondere ermöglicht unsere Modifikation zur Steuerung neuronaler Zelldichte und der Verwendung auf Mikroelektrodenarrays elektrophysiologischen Eigenschaften auf Netzwerkebene zu messen.

Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays

Ischämischen Schlaganfall ist schwer zu lernen ist ein komplexer Vorgang, in dem der spezifische Beitrag der Astrozyten, die betroffene Hirnregion Glukose Sauerstoffmangel (OGD) ausgesetzt. Dieser Artikel stellt eine Methode zur isolierte Astrozyten zu erhalten und ihre Reaktivität und Verbreitung unter OGD Bedingungen zu studieren.

Überwachung der Astrozyten Reaktivität und Proliferation in Vitro unter ischämischen-ähnlichen Bedingungen

Wir präsentieren hier ein Protokoll zur Vorbereitung von Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus Rattenkortices für die Zeitraffer-Videobildgebung von intrazellulärem Ca2+ für die Erforschung der Pathophysiologie der amyotrophen Lateralsklerose im hSOD1G93A-Rattenmodell .

Primärkulturen von Rattenastrozyten und Mikroglia und ihre Verwendung bei der Untersuchung der amyotrophen Lateralsklerose

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung hochangereicherter Kulturen von Astrozyten, die aus verschiedenen Regionen des Zentralnervensystems postnataler Mäuse stammen, und deren direkte Umwandlung in funktionelle Neuronen durch die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren.

Isolierung und direkte neuronale Reprogrammierung von Maus-Astrozyten

Dieses Protokoll stellt eine einzigartige Möglichkeit dar, Zellkulturen des Zentralnervensystems aus embryonalen Tag-17-Mäusegehirnen für die neuro(immun)ologische Forschung zu generieren. Dieses Modell kann mit verschiedenen experimentellen Techniken analysiert werden, darunter RT-qPCR, Mikroskopie, ELISA und Durchflusszytometrie.

Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von gereinigten Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark der erwachsenen Maus und erleichtert spätere Anwendungen wie RNA-Analyse und Zellkultur. Es umfasst detaillierte Zelldissoziationsmethoden und -verfahren, die darauf ausgelegt sind, sowohl die Qualität als auch die Ausbeute isolierter Zellen zu verbessern.

Isolierung von reinen Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark adulter Mäuse für In-vitro-Assays und Transkriptomstudien

Lernen Sie das AWESAM-Protokoll zur schnellen, einfachen und kostengünstigen Kultivierung muriner Astrozyten mit in-vivo-ähnlichen Eigenschaften. Diese Methode ermöglicht Studien zur Calcium-Signalgebung und Astrozytenbiologie.

In VivoKultivierung-wie Murine Astrozyten über das schnelle, einfache und kostengünstige AWESAM-Protokoll

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