Generation von eine chronisch obstruktive Lungenerkrankung-Modell bei Mäusen durch wiederholte Ozonbelastung

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, bei Mäusen eine chronisch obstruktive Lungenerkrankung (C-O-P-D) über Ozonexposition, O-E, zu induzieren. Dieses neue OE-Modell kann bei der Charakterisierung des zugrunde liegenden Mechanismus von COPD eingesetzt werden und für das Screening neuer Medikamente verwendet werden. Die Hauptvorteile dieses OE-Modells bestehen darin, dass es die pathologischen Prozesse von COPD-Patienten rekapituliert.

Es kann in nur sechs bis acht Wochen generiert werden. Mit mir wird Weijaian Sang, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter in unserer Gruppe, das Verfahren demonstrieren. Um Ozon zu erzeugen, verwenden Sie einen elektrischen Generator und ein kleines Luftgebläse, um die Luft aus dem Plexiglaskasten durch ein Entlüftungsrohr zu blasen, das an der Innen- und Außenseite des Kastens mit einer Ozonsonde verbunden ist, um die Ozonkonzentration im Kasten zu überwachen.

Wenn die Ozonkonzentration 2,5 ppm erreicht, legen Sie die Mäuse für 3 Stunden in die Box. Am Ende von Woche 7 werden die mit Ozon behandelten Tiere mittels Mikro-Computertomographie nach Standardprotokollen abgebildet. Um die ozoninduzierten Veränderungen und Funktionskapazitäten wie Lungenermüdung zu testen, wärmen die Mäuse zunächst mit einer Geschwindigkeit von 10 Metern pro Minute auf einem Laufband auf.

Erhöhen Sie nach 5 Minuten die Geschwindigkeit für einen Zeitraum von 10 Minuten auf 15 Meter pro Minute. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit alle 30 Minuten um fünf Meter pro Minute, bis die Mäuse nicht mehr laufen können. Aufzeichnung der Gesamtlaufstrecke und der Laufzeit für jedes Tier als Ermüdungsstrecke bzw. Ermüdungszeit.

Um die Lungenfunktion der ozonexponierten Tiere zu messen, wird eine anästhesierte Maus in einen Körperplethysmographen gelegt, der mit einem computergesteuerten Beatmungsgerät verbunden ist. Verwenden Sie eine druckkontrollierte Beatmung, um dem anästhesierten Tier eine durchschnittliche Atemfrequenz von 150 Atemzügen pro Minute aufzuerlegen, bis ein regelmäßiges Atemmuster und eine vollständige Ausatmung bei jedem Atemzyklus erreicht ist. Zeichnen Sie dann das erzwungene exspiratorische Volumen in den ersten 25, 50 und 75 Millisekunden der Ausatmung auf und lehnen Sie suboptimale Manöver ab.

Verwenden Sie nach der terminalen Anästhesie einen Endotrachealtubus mit einem Durchmesser von einem Millimeter, um die Tiere zweimal mit einem Milliliter PBS pro Spülung zu spülen. Bündeln Sie die von jedem Tier geborgenen Lavage-Aloquüten für die Zentrifugation und sammeln Sie die Überstände auf flüssigem Stickstoff. Suspendieren Sie die Pellets zum Zählen wieder in frischem PPS und bestücken Sie zwei Halter pro Maus mit einem Objektträger, einer Filterkarte und einem Trichter.

Geben Sie etwa 100 bis 125 Mikroliter der resuspendierten Zellen in jeden Trichter. Laden Sie die Halter auf eine Zytozentrifuge und drehen Sie die Zellen auf die Objektträger. Tragen Sie dann die richtige Färbelösung gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die Zellen auf und zählen Sie 200 Zellen pro Maus unter einer 400-fachen Vergrößerung.

Für die Herzblutentnahme werden ca. 500 Mikroliter Blut von den ozonexponierten Tieren mittels Herzpunktion entnommen. Und gib das Blut in 1,5 Milliliter Röhrchen auf Eis. Nach 30 Minuten auf Eis zentrifugieren Sie die Blutproben und überführen die Serumüberstände in neue Röhrchen zur Lagerung auf flüssigem Stickstoff.

Die Proben können später aufgetaut werden, um die Expression von Serumzytokinen per ELISA nach Standardprotokollen zu bestimmen. Für die lungenmorphometrische Analyse legen Sie die erste Maus nach der Herzprobenahme in Rückenlage. Öffnen Sie dann die Brusthöhle und präparieren Sie das Platysma und die vorderen Trachealmuskeln, um Zugang zu den Trachealringen zu erhalten.

Entnehmen Sie die Lunge und die Luftröhre, ohne das Herz von der Lunge zu trennen. Verwenden Sie anschließend einen PE90-Polyethylenschlauch, um einen Endotrachealkatheter mit einer Spritze mit 4 % starkem Formaldehyd zu verbinden, und blasen Sie die Lunge vollständig mit etwa 200 Mikrolitern Paraformaldehyd auf. Legen Sie dann die Lunge für mindestens vier Stunden in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern frischem Formaldehyd mit vier Prozent Power.

Wie mittels Mikrocomputertomographie beurteilt, weisen ozonexponierte Mäuse ein signifikant größeres Gesamtlungenvolumen und einen geringeren Prozentsatz an Dämpfungsfläche auf als Kontrolltiere, die der Umgebungsluft ausgesetzt waren. Der Emphysem-Phänotyp zeigt sich auch in den vergrößerten Lungenalveolen und den erhöhten mittleren linearen Schnittzeiten. Die Beurteilung der Lungenfunktion mittels Plethysmograph zeigt, dass alle Parameter, die bei ozonexponierten Mäusen abnehmen, mit den typischen Lungenfunktionsdefekten übereinstimmen, die bei Patienten mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung beobachtet werden.

Darüber hinaus verringert die Ozonexposition die Ermüdungszeit und die Ermüdungsdistanz in einem Belastungsverträglichkeitstest erheblich. Mit Ozon behandelte Tiere zeigen auch einen signifikanten Anstieg von Entzündungszellen, einschließlich Makrophagen und Neutrophilen, sowie einen signifikanten Rückgang von IL-10 und einen Anstieg von IL-1 beta und TNF alpha, was zeigt, dass das Ozonexpositionsmodell die Symptome chronisch obstruktiver Lungenerkrankungen beim Menschen rekapituliert. Nach diesem Verfahren können andere Mäusestämme wie die C57 BR6-Mäuse zur Generierung dieses OE-Modells verwendet werden. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Lungenerkrankungen den Weg, um die zugrunde liegenden Mechanismen von COPD zu erforschen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem Paraformaldehyd gefährlich sein kann und dass bei der Arbeit mit diesem Reagenz immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, eine Schutzbrille und die Verwendung der Lösung im Abzug getroffen werden sollten.