Name: Generation von eine chronisch obstruktive Lungenerkrankung-Modell bei Mäusen durch wiederholte Ozonbelastung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Erfahren Sie die Erzeugung eines COPD-Modells bei Mäusen durch wiederholte Ozonbelastung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Krankheitsmechanismen und das Screening neuer Wirkstoffe.

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Die Autoren möchten Mr Boyin Qin (Shanghai Public Health Clinical Center) bedanken, für die technische Hilfe bei der µCT-Bewertung in diesem Protokoll.

Hinweis: die OE-Modell generiert und in bereits berichtet Forschung 30 , 31 , 32 verwendet wurde. Alle Tierversuche wurden genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Shanghai Jiaotong University.
 1. Mäuse <ol><li>Haus Erreger frei, 7 bis 9 Woche alten weiblichen BALB/c Mäusen in einzelnen belüftete Käfige in ein Tier Anlage unter kontrollierten Temperatur (20 ° C) und Luftfeuchtigkeit (40-60 %). Bieten Sie eine leichte 12 h und 12 h-dunkel-Zyklus in der Anlage. Nahrung und Wasser Ad Libitum.</li>
</ol> 2. Ozon oder Luft Exposition <ol><li>erzeugen Ozon mit einem elektrischen Generator in einer Abdichtung (z.B. Plexiglas) Acryl-Box. Schlag die Luft aus der Box mit einem kleinen Gebläse durch eine Entlüftungsleitung, der auf der innen- und Außenseite der Box verbunden ist. Überwachung der Konzentration des Ozons in der Box mit einem Ozon-Sonde. Warten, bis die Konzentration von Ozon im Feld 2,5 Teile pro erreicht million (ppm). 
	Hinweis: Die Ozon-Sonde kann der Ozon-Generator automatisch wechseln, ein- oder ausschalten und pflegen das Ozon-Niveau im Feld bei 2,5 ppm.</li>
	<li>Statt die Mäuse in das Feld, wenn die Ozon 2,5 ppm erreicht. Halten Sie sich die Mäuse in der Box für 3 h jedes Mal Ozon ausgesetzt. 
	Hinweis: Feld kann Erhaltung ein Ozon 2,5 ppm in den 3 h durch die Ozon-Generator automatisch ein- und Auschalten und bläst die CO 2, die entsteht durch die Mäuse out of the Box.</li>
	<li>Geben zwei Ozon Belichtungen (jeder Belichtung dauert 3 h) pro Woche (einmal alle 3 Tage) für 7 Wochen; Kontrollmäusen Luft gleichzeitig und im gleichen Zeitraum aussetzen.</li>
</ol> 3. Mikro-Computertomographie <ol><li>am Ende der 7. Woche, betäuben die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Pelltobarbitalum Natricum (1 %, 0,6 - 0,8 ml/100 g) passen Sie die Dosis entsprechend dem individuellen Situationen zu sehen, dass die Maus nicht reagieren auf eine Zehe Prise. Monitor und halten Sie die Maustaste auf einem stetigen Atemfrequenz; und darauf achten, dass keine freiwillige Bewegungen existieren im Verlauf der Verfahren.</li>
	<li>Legen den narkotisierten Mäuse in der Kammer ein Mikro-Computertomographie (µCT).</li>
	<li>Kalibrieren der µCT unter Verwendung der standard-Protokoll und der Hersteller &#39; Anweisungen. Festlegen der Röntgenröhre um 50 kV und der Strom am 450 µA. 
	Hinweis: Sowohl der Röntgen- und der Detektor drehen sich um die Mäuse.</li>
	<li>Führen Sie die µCT-Analyse durch den Erwerb von 515 Projektionen mit einer effektiven Pixelgröße von 0,092 mm eine Belichtungszeit von 300 ms für eine Scheibe und eine Scheibendicke von 0,093 mm.</li>
	<li>Rekonstruieren die Lunge mit der aufgenommenen Bilder mit Hilfe einer Software. Passen Sie die Helligkeit des Graustufen-Bildes durch Festlegen von Minimum und Maximum der Graustufen-750 und-550 Hounsfield-Einheiten bzw.. 
	Hinweis: Die Software berechnet automatisch die Bände des Lungenparenchyms und der niedrige Dämpfung Bereich (LAA) 34 , 35.</li>
	<li>Berechnung des Prozentsatzes von LAA (LAA %) dividiert das LAA-Volumen durch das gesamte Lungenvolumen.</li></ol>
 4. Laufband testen <ol><li>geben die Mäuse eine Anpassung mit einer Geschwindigkeit von 10 m/min für 10 min auf einem laufenden Laufband Maschine Hinweis testen: der Strom ist immer deaktiviert, wenn das Verfahren durchgeführt wird.</li> <li>verwalten ein Dauertest für die Mäuse.
	<ol><li>Wärmen die Mäuse mit einer Geschwindigkeit von 10 m/min für 5 min.</li>
		<li>Erhöhen Sie die Geschwindigkeit auf 15 m/min für 10 min.</li>
		<li>Die Trainingsintensität zu erhöhen: erhöht die Geschwindigkeit von 5 m/min, ab 20 m/min., alle 30 min. bis Mäuse kann nicht weiter 36 ausgeführt.</li>
	</ol></li> <li>Erfassen die gesamte Laufstrecke und Laufzeit als Müdigkeit Distanz und Müdigkeit Zeit bzw..</li></ol>
 5. pulmonale Funktion Messungen <ol><li>betäuben die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Pelltobarbitalum Natricum (1 %, 0,6 - 0,8 ml/100 g) passen Sie die Dosis entsprechend dem individuellen Situationen zu sehen, dass die Maus reagiert nicht auf eine Zehe Prise und warten, bis die Mäuse spontane Atmung. Monitor unterhalten und halten Sie die Maustaste auf einem stetigen Atemfrequenz; und darauf achten, dass keine freiwillige Bewegungen existieren im Verlauf der Verfahren.</li>
	<li>Tracheostomize die Mäuse sorgfältig und legen Sie sie in einen Körper Plethysmogramm, die an eine Computer-gesteuerte Lüfter angeschlossen ist. 
	Hinweis: Belüftung erfolgt über ein Ventil befindet sich proximal zu den Endotrachealtubus. Das Setup bietet verschiedene halbautomatische Manöver, einschließlich die quasi-statische Druck-Volumen-Manöver und das Manöver schnell Spülmenge.</li>
	<li>Durchschnittlich Atemfrequenz von 150 Atemzüge/min um den narkotisierten Maus über druckgesteuerte Beatmung bis eine regelmäßige Atmung zu verhängen und komplette Ablauf bei jedem Atemzyklus erzielt wird.</li>
	<li>Führen das quasi-statische Druck-Volumen-Manöver mit dem Gerät mithilfe der Unterdruck erzeugt in der Plethysmogramm.</li>
	<li>Führen Sie durch die schnelle Strömung Volumen Manöver in die quasi-statische Druck-Volumen-Loops zum Aufzeichnen der FVC und der FEV. Aufblasen die Lunge + 30 cm H 2 O und sofort danach verbinden Sie es mit einem äußerst negativen Druck zur Durchsetzung Ablauf bis das Restvolumen der FEV in den ersten 25, 50 und 75 ms Ausatmung (FEV 25-30 cm H 2 O. Record ist FEV 50 und FEV 75, beziehungsweise). Lehnen Sie die suboptimale Manöver. Für jeden Test mit jedem Mausklick führen mindestens drei akzeptable Manöver, einen zuverlässigen Mittelwert für alle numerischen Parametern zu erhalten.</li>
</ol> 6. BALF Sammlung <ol><li>nach terminal Anästhesie mit Pelltobarbitalum Natricum ((1 %, 1,8-2,4 ml/100 g) passen Sie die Dosis entsprechend dem individuellen Situationen zu sehen, dass die Maus nicht auf eine Zehe Prise reagieren und Atem zu verlieren), Lavage der Mäuse mit 2 mL PBS über eine 1 mm Durchmesser endotracheal Schlauch und dann abrufen BALF 10.</li>
	<li>Die abgerufenen Lavage Aliquote bündeln und Zentrifugieren sie bei 4 ° C und 250 X g für 10 min.</li>
	<li>Den Überstand für den sofortigen Einsatz sammeln und speichern den Rest bei-80 ° C oder flüssiger Stickstoff.</li>
	<li>Zählen die Gesamtzahl der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer.</li>
	<li>Der Zelle Pellet in PBS und dann Spin (1.400 x g, 6 min) 250 µL resuspendierte Zellen auf Folien mit einer Folie Spinner Zentrifuge Aufschwemmen.</li>
	<li>Gelten Wright zu beflecken Zellen auf den Folien nach Angaben des Herstellers &#39; s Protokoll.</li>
	<li>200 Zellen pro Maus; identifizieren die Zellen wie Makrophagen und Neutrophilen, nach standard Morphologie unter 400 X Vergrößerung; zählen und ihre Nummern.</li>
</ol> 7. Kardiale Blutabnahme <ol><li>Blut über Herzpunktion zu sammeln, laden Sie es in 1,5 mL Röhrchen, und halten Sie es für 30 min auf Eis</li>
	<li>Zentrifugieren der Blutproben für 5 min bei 2.000 x g und 4 ° c</li>
	<li>Übertragung den überstand (Serum) zu einem neuen Schlauch und bei-80 ° C oder flüssiger Stickstoff aufbewahren.</li>
	<li>Bereiten das Serum für IL-1β, IL-10 und Tests zum Nachweis von TNF-α mit der jeweiligen ELISA-Kits.</li>
</ol> 8. Lunge morphometrische Analyse <ol><li>zu sezieren, die Lunge und Tracheas von den Mäusen.
	<ol><li>Stellung jedes euthanasierten Maus auf eine chirurgische Board sofort nach Opfer.</li>
		<li>Sezieren entfernt das Platysma und vorderen trachealen Muskeln zu visualisieren und Zugriff auf die trachealen Ringe.</li>
		<li>Open up der thorakalen Hohlraum. Sezieren von Lunge und Luftröhre, aber nicht das Herz aus der Lunge zu trennen.</li>
	</ol>
	</li> <li>Den endotrachealen Katheter an eine Spritze mit 4 % Paraformaldehyd durch ein PE90 Polyethylen-Rohr anschließen. 
	Achtung: Paraformaldehyd ist giftig. Handschuhe und Schutzbrille zu tragen und verwenden Sie die Lösung in einer Dampfhaube.</li>
	<li>Aufblasen die Lunge komplett mit 4 % Paraformaldehyd (10 Tropfen, ~ 200 µL) durch den Endotrachealtubus Katheter. Entfernen Sie das Herz nach dem Abschluss der Inflation.</li>
	<li>Pflegen der Lunge in der 15 mL Tube mit 10 mL 4 % Paraformaldehyd für mindestens 4 Std.</li>
	<li>Die Lunge in Paraffin einbetten. Erhalten Sie 5 µm Abschnitte durch Paraffinblock mit einem rotierenden Mikrotom. Während dem Schneiden, setzen Sie die maximale Fläche von Lungengewebe im Bereich Bronchialbaum.</li>
	<li>Für morphometrische Analyse durchführen, Hämatoxylin und Eosin (H &#38; E) Flecken auf den Abschnitten.</li>
	<li>Bild in den Abschnitten mit aufrechten Hellfeld Mikroskop (Objektiv, 20 X, Belichtungszeit, 1,667 ms).</li>
	<li>Haben zwei Ermittler geblendet, das Behandlungsprotokoll die histologischen Abschnitte unabhängig voneinander zählen. Verwenden Sie die mittlere lineare abfangen (L m) als Parameter zum Messen des Abstands zwischen alveoläre septal Wand. L-m mit den folgenden Schritten zu bestimmen: <ol><li>die Bilder der Abschnitte in Photoshop öffnen und ein Fadenkreuz-Gitter auf das Bild mit fünf 550 µm langen Leitungen zeichnen.</li>
		<li>Die Anzahl der Alveolen über die Rasterlinie.</li>
		<li>L m berechnen indem man die Länge der Rasterlinie durch die Anzahl der Alveolen. Für die Quantifizierung Bild fünf Abschnitte per Mausklick. Zehn Bilder der einzelnen Abschnitte (ein Bild pro Feld) zu erwerben und nach dem Zufallsprinzip zu beurteilen. Während der Feldauswahl, vermeiden Felder der Atemwege und Schiffe durch ein Feld verschieben, vor oder in eine andere Richtung. 
		Hinweis: Die Daten sind als Mittelwert ± S.E.M vorgestellt Ein UN-gepaarter t-Test wurde für den Vergleich zwischen Luft-exponierten Mäusen und Ozon ausgesetzt Mäusen durchgeführt. Drei Tiere jeder Gruppe wurden verwendet, um die erhebliche Differenz berechnen. Ein p-Wert von &#60; 0,05 galt als bedeutende.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Z.W.S. und W.W sind aktuelle Mitarbeiter und Stock-Option-Inhaber der zellulären Biomedizin-Gruppe (NASDAQ: CBMG). Die anderen Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.

In dieser Studie stellen wir eine zuverlässige Methode zur Erzeugung eines neuen COPD-Modells. Im Vergleich zu anderen Modellen (z.B. LPS oder PSA-Modelle), rekapituliert dieser OE-Modell des pathologischen Prozesses von COPD-Patienten. Da Zigarettenrauch das Hauptmaterial gefährlicher, das menschlichen Patienten40COPD verursacht ist, bleibt das CS-Modell der beliebtesten COPD Modell41,42. Das CS-Modell erfordert jedoch eine 3 - 1...

Es wurde geschätzt, dass COPD, Emphysem und chronische Bronchitis, darunter möglicherweise die dritte Todesursache in der Welt im Jahr 20201,2. Das mögliche Auftreten von COPD in einer Bevölkerung über 40 Jahre alt wird voraussichtlich 12,7 % bei Männern und Frauen innerhalb der nächsten 40 Jahre38,3 %. Keine Medikamente sind derzeit für die progressive Verschlechterung der COPD Patienten4rückgängig zu machen. Zuverlässige Tiermodellen der COPD nicht nur fordern die Nachahmung des pathologischen Prozesses Erkrankung aber auch benötigen eine kurze Generation. Aktuelle COPD-Modelle, einschließlich der LPS oder ein PSA-induzierte Modell induzieren können Emphysem-ähnliche Symptome5,6. Eine einzige Verwaltung oder eine Woche lang Herausforderung von LPS oder PSA auf Mäuse oder Ratten führt zu deutlichen Neutrophilie im alvéolaire Lavage Fluid (BALF), Erhöhungen Pro-inflammatorischen Mediatoren (z. B. TNF-α und IL-1β) in BALF oder Serum, produziert die Lunge Parenchym Zerstörung erweiterten Lufträume und Grenzen Luftstrom5,6,7,8,9,10. Jedoch LPS oder PSA sind keine Ursachen der menschlichen COPD und somit nicht zu imitieren den pathologischen Prozess11. Ein CS-induzierte Modell produziert eine persistente Luftstrom Einschränkung, Lungen-Parenchym Zerstörung und funktionelle Übung Kapazität verringert. Eine traditionelle CS-Protokoll erfordert jedoch mindestens 3 Monate um eine COPD Modell12,13,14,15zu generieren. Daher ist es wichtig, eine neue, effizientere Tiermodell zu generieren, die die zwei Anforderungen erfüllt.
Vor kurzem neben Rauchen, Luftverschmutzung und berufsbedingte Exposition häufiger Ursachen der COPD16,17,18geworden. Ozon, als eines der wichtigsten Schadstoffe (obwohl nicht Hauptbestandteil der Luftverschmutzung), kann direkt mit der Atemwege reagieren und schädigen das Lungengewebe von Kindern und Jugendlichen Erwachsenen19,20,21 ,22,23,24,25. Ozon, sowie andere Stimulatoren wie LPS, PSA und CS, engagieren sich in eine Reihe von biochemischen Wege der pulmonale oxidativen Stress und DNA-Schäden und Zusammenhängen für die Initiierung und Förderung von COPD26,27. Ein weiterer Faktor ist, dass die Symptome der COPD-Patienten verschlechtert sich nach Ozon, darauf hinweist, dass Ozon Lunge Funktion18,28,29stören kann ausgesetzt werden. Aus diesem Grund generiert wir ein neues Modell der COPD durch immer wieder Mäuse, um hohe Konzentrationen von Ozon für 7 Wochen aussetzen; Dies führte zu Luftstrom Mängel und parenchymatösen Lungenschäden ähnlich denen von früheren Untersuchungen30,31,32. Wir erweitern das OE-Protokoll zu weiblichen Mäusen in dieser Studie und erfolgreich reproduziert das Emphysem beobachtet bei männlichen Mäusen in unserem vorherigen Studien30,31,32. Da COPD-Mortalität bei Männern zurückgegangen aber erhöht bei Frauen in vielen Ländern33, eine COPD-Modell bei den Weibchen notwendig ist, um die Mechanismen zu studieren und therapeutischen Methoden für weibliche COPD-Patienten zu entwickeln. Die Anwendbarkeit des OE-Modells für alle Geschlechter unterstützt weitere seine Verwendung als ein COPD-Modell.

<table><tbody><tr><td>BALB/c-Mäuse</td><td>Slac Laboratory Animal, Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>7 bis 9 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden in dieser Studie verwendet.</td></tr><tr><td>Einzelne belüftete Käfige</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>Modellnummer: MU64S7</td><td>Die Käfige wurden für die Unterbringung von Mäusen in der Tieranlage verwendet.</td></tr><tr><td>Dichtung Plexiglas-Box</td><td>Suhang, Shanghai, China</td><td>N/A</td><td>Die Box wurde zur Aufnahme des Ozongenerators verwendet. Die Mäuse wurden in der Box Ozon ausgesetzt.</td></tr><tr><td>Elektrischer Generator</td><td>Sander Ozonisator, Uetze-Eltze, Deutschland</td><td>Modell 500&nbsp;</td><td>Das Gerät wurde zur Erzeugung von Ozon verwendet.</td></tr><tr><td>Ozonsonde</td><td>ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK</td><td>Ozone 300</td><td>Das Gerät wurde zur Überwachung und Steuerung der Ozonerzeugung eingesetzt.</td></tr><tr><td>Pelltobarbitalum natricum</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P3761</td><td>Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von Pelltobarbitalum natricum anästhesiert.</td></tr><tr><td>Mikro-Computertomographie</td><td>GE Healthcare, London, ON, Kanada</td><td>RS0800639-0075</td><td>Dieses Gerät wurde für die Aufnahme von Bildern der Lunge verwendet.</td></tr><tr><td>Micro-view 2.01 ABA-Software</td><td>GE Healthcare, London, ON, Kanada</td><td>Micro-view 2.01&nbsp;</td><td>Dieses Gerät wurde zur Rekonstruktion der Lunge und zur Analyse des Volumens, LAA der Lunge, verwendet.</td></tr><tr><td>Laufband&nbsp;</td><td>Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China</td><td>DSPT-208</td><td>Diese Maschine wurde für einen Ermüdungstest verwendet.</td></tr><tr><td>Körperplethysmograph</td><td>eSpira&trade; System für erzwungene Manöver, EMMS, Edinburgh, Vereinigtes Königreich</td><td>System für erzwungene Manöver</td><td>Dieses Gerät wurde verwendet, um die Lungenfunktion der Spirometrie zu testen.</td></tr><tr><td>Beatmungsgerät</td><td>eSpira&trade; System für erzwungene Manöver, EMMS, Edinburgh, Vereinigtes Königreich</td><td>System für erzwungene Manöver</td><td>Dieses Gerät wurde verwendet, um die Lungenfunktion der Spirometrie zu testen.</td></tr><tr><td>Slide Spinner Zentrifuge</td><td>Denville Scientific, Holliston, MA, USA</td><td>C1183&nbsp;</td><td>Es wurde verwendet, um BALF-Zellen auf Objektträger zu spinnen.</td></tr><tr><td>Wright Staining</td><td>Hanhong, Shanghai, China</td><td>RE04000054</td><td>&nbsp; Es wurde zur Färbung von Makrophagen, Neutrophilen im suspendierten BALF, verwendet.</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Hausser Scientific, Horsham, PA, USA</td><td>4000</td><td>Es wurde zur Zählung von Zellen verwendet.</td></tr><tr><td>IL-1&beta;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab100704</td><td>Sie wurden verwendet, um die entsprechenden Faktoren im Serum zu testen.</td></tr><tr><td>IL-10</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab46103</td><td>Sie wurden verwendet, um die entsprechenden Faktoren im Serum zu testen.</td></tr><tr><td>TNF-&alpha;</td><td>Abcam, Cambridge, MA, USA</td><td>ab100747</td><td>Sie wurden verwendet, um die entsprechenden Faktoren im Serum zu testen.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P6148</td><td>Die Lunge wurde mit 4% Paraformaldehyd aufgebläht.</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Hualing, Shanghai, China</td><td>56#</td><td>Es wurde verwendet, um die Lunge einzubetten.</td></tr><tr><td>Rotationsmikrotom</td><td>Leica, Wetzlar,&nbsp; Hessen, Deutschland</td><td>RM2255</td><td>Es wurde zum Schneiden der Lunge verwendet.</td></tr><tr><td>Hgaematoxylin und Eosin (H& E) Färbelösung</td><td>Solarbio, Peking, China</td><td>G1120</td><td>H& Die E-Färbung wurde für die morphometrische Analyse durchgeführt.</td></tr><tr><td>Aufrechtes Hellfeldmikroskop</td><td>Olympus, Center Valley, PA, USA</td><td>CX41</td><td>Es wurde verwendet, um das H& E Färbeobjektträger.</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 12</td><td>Adobe, San Jose, CA, USA</td><td>Adobe Photoshop 12</td><td>Es wurde verwendet, um die Anzahl der Lungenbläschen auf dem H& E gefärbte Bilder.</td></tr><tr><td>GraphPad prism 5</td><td>Graphpad Software Inc., San Diego, CA</td><td>GraphPad prism 5</td><td>Es wurde für die Datenanalyse und die Erstellung von Zahlen verwendet.</td></tr></tbody></table>

generation von eine chronisch obstruktive lungenerkrankung-modell bei mäusen durch wiederholte ozonbelastung

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Chronischer obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) zeichnet sich durch anhaltende Luftstrom Einschränkung und Lunge parenchymatösen Zerstörung. Es hat eine sehr hohe Inzidenz in alternden Bevölkerung. Die aktuellen konventionellen Therapien für COPD Fokus hauptsächlich auf Symptom-modifizierende Drogen; die Entwicklung neuer Therapien ist daher dringend erforderlich. Qualifizierte Tiermodellen der COPD könnte dazu beitragen, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu charakterisieren und eignet sich für neue Drogen-Screening. Aktuelle Modelle der COPD, wie Lipopolysaccharid (LPS) oder die Schweine Pankreas Elastase (PSA)-induzierte Emphysem Modell generieren COPD-ähnliche Läsionen in der Lunge und Atemwege aber nicht sonst ähneln die Pathogenese der menschlichen COPD. Eine Zigarette zu rauchen (CS)-induzierte Modell bleibt eines der beliebtesten, weil es nicht nur COPD-ähnliche Läsionen in den Atemwegen simuliert, aber es basiert auch auf einer der wichtigsten gefährlichen Stoffen, die COPD in den Menschen verursacht. Allerdings beschränken die zeitraubende und arbeitsintensive Aspekte des Modells CS-induzierte drastisch ihre Anwendung in der neuen Wirkstoff-Screening. In dieser Studie erzielten wir erfolgreich ein neues Modell der COPD, indem man Mäuse zu hohen Niveaus des Ozons. Dieses Modell zeigt die folgenden: 1) erzwungene exspiratorischen Volumen 25, 50 und 75/gezwungen Vitalkapazität verringert (FEV25/FVC, FEV50/FVC und FEV75/FVC), unter Angabe der Verschlechterung der Lungenfunktion; (2) erweiterten Lungen-Alveolen mit Lungen-Parenchym Zerstörung; (3) reduziert Müdigkeit Zeit und Distanz; und 4) Entzündung erhöht. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass das Ozon Exposition (OE) Modell ein zuverlässiger Tiermodell das ähnlich wie beim Menschen ist ist, weil Ozon Überbelichtung ist eines der ätiologischen Faktoren der COPD. Darüber hinaus dauerte es nur ca. 6-8 Wochen, basierend auf unsere bisherige Arbeit, um eine OE-Modell zu erstellen, es erfordert 3-12 Monate induzieren das Zigarettenrauch Modell, darauf hinweist, dass die OE-Modell eine gute Wahl für COPD Forschung werden könnte.

Beispiele für 3D µCT-Bilder der einzelnen Gruppen werden in Abbildung 1eineangezeigt. Die Ozon-exponierten Mäuse hatten einen deutlich größeren totale Lungenvolumen (Abbildung 1ein und b) und LAA % (Abbildung 1c) als die Luft-exponierten Kontroll-Mäusen hat. Das Lungenvolumen und LAA % weiterhin auf erhöhtem Niveau nach sechs Wochen von Ozon Expositi...

Diese Studie beschreibt die erfolgreiche Generierung von ein neues Tiermodell für die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), indem man immer wieder Mäuse, um hohe Konzentrationen von Ozon.

Generation von eine chronisch obstruktive Lungenerkrankung-Modell bei Mäusen durch wiederholte Ozonbelastung

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, eine chronisch obstruktive Lungenerkrankung oder C-O-P-D durch Ozonexposition, O-E, bei Mäusen zu induzieren. Dieses neue OE-Modell kann zur Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen der COPD beitragen und für die Untersuchung neuer Wirkstoffe verwendet werden. Die wichtigsten Vorteile dieses OE-Modells liegen darin, dass es die pathologischen Prozesse von COPD-Patienten nachbildet.Es kann innerhalb von nur sechs bis acht Wochen erzeugt werden. Die Durchführung des Verfahrens wird gemeinsam mit mir Weijaian Sang, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter in unserer Gruppe, demonstrieren. Zur Erzeugung von Ozon verwenden Sie einen elektrischen Generator und einen kleinen Gebläselüfter, um die Luft aus einer abgedichteten Plexiglasbox durch ein Luftabzugsrohr zu blasen, das innen und außen an der Box angeschlossen ist, sowie eine Ozonsonde, um die Ozonkonzentration in der Box zu überwachen.Wenn die Ozonkonzentration 2,5 Teile pro Million erreicht hat, bringen Sie die Mäuse für 3 Stunden in die Box. Am Ende der Woche 7 bilden Sie die mit Ozon behandelten Tiere mittels Mikrocomputertomographie gemäß Standardprotokollen ab. Um die durch Ozon hervorgerufenen Veränderungen und funktionellen Kapazitäten wie beispielsweise die Lungenermüdung zu testen, erwärmen Sie die Mäuse zunächst auf einem Laufband mit einer Geschwindigkeit von 10 Metern pro Minute auf. Nach 5 Minuten die Geschwindigkeit auf 15 Meter pro Minute für einen Zeitraum von 10 Minuten erhöhen. Die Geschwindigkeit anschließend alle 30 Minuten um fünf Meter pro Minute weiter erhöhen, bis die Mäuse nicht mehr laufen können. Die gesamte Laufstrecke und Laufzeit für jedes Tier jeweils als Ermüdungsstrecke und Ermüdungszeit aufzeichnen.Um die Lungenfunktion der Ozon-exponierten Tiere zu messen, platzieren Sie eine anästhesierte Maus in einem Ganzkörperplethysmographen, der mit einem computergesteuerten Beatmungsgerät verbunden ist. Verwenden Sie eine druckgesteuerte Beatmung, um eine durchschnittliche Atemfrequenz von 150 Atemzügen pro Minute am anästhesierten Tier so lange aufzuerlegen, bis ein regelmäßiges Atemmuster und eine vollständige Exspiration in jedem Atemzyklus erreicht ist. Anschließend wird das forcierte Atemzugsvolumen in den ersten 25, 50 und 75 Millisekunden der Ausatmung aufgezeichnet, wobei alle suboptimalen Manöver verworfen werden.Nach der terminalen Anästhesie lavagieren Sie die Tiere zwei Mal mit je einem Milliliter PBS unter Verwendung einer endotrachealen Kanüle mit einem Durchmesser von einem Millimeter. Sammeln Sie die gewonnenen Lavage-Aliquots jedes Tieres gemeinsam, zentrifugieren Sie sie und gewinnen Sie die Überstände in flüssigem Stickstoff. Resuspendieren Sie die Pellets in frischem PPS zur Zellzählung und rüsten Sie zwei Halter pro Maus mit einem Objektträger, einer Filterkarte und einem Trichter aus.Geben Sie etwa 100 bis 125 Mikroliter der resuspendierten Zellen in jeden Trichter. Setzen Sie die Halter in eine Zytospinzentrifuge und zentrifugieren Sie die Zellen auf die Objektträger. Anschließend wenden Sie gemäß den Herstelleranweisungen die geeignete Färbelösung auf die Zellen an und zählen je Maus 200 Zellen bei einer 400-fachen Vergrößerung.Für die Gewinnung von Herzblut sammeln Sie etwa 500 Mikroliter Blut aus den Ozon-exponierten Tieren mittels Herzpunktion und geben das Blut in 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis. Nach 30 Minuten auf Eis zentrifugieren Sie die Blutproben und überführen die serösen Überstände in neue Röhrchen zur Lagerung in flüssigem Stickstoff.Die Proben können später aufgetaut werden, um die Expression von Zytokinen im Serum mithilfe von ELISA gemäß Standardprotokollen zu bestimmen. Für die lungemorphometrische Analyse positionieren Sie die erste Maus nach der Herzpunktion in Rückenlage. Öffnen Sie anschließend die Brusthöhle und dissezieren Sie den Plattenmuskel und die vorderen Trachealmuskeln, um Zugang zu den Trachealringen zu erhalten.Entnehmen Sie die Lunge und die Luftröhre, ohne das Herz von der Lunge zu trennen. Verbinden Sie anschließend mit einem PE90-Polyäthylenschlauch einen endotrachealen Katheter mit einer Spritze, die 4 %ige Formaldehydlösung enthält, und füllen Sie die Lunge vollständig mit etwa 200 Mikrolitern Paraformaldehyd auf. Danach geben Sie die Lunge in ein 15-Milliliter-Gefäß, das 10 Milliliter frische 4 %ige Formaldehydlösung enthält, und lassen sie mindestens vier Stunden lang darin einwirken.Wie mittels Mikrocomputertomographie festgestellt wurde, weisen Mäuse, die Ozon ausgesetzt waren, ein signifikant größeres Gesamtlungenvolumen und einen höheren Prozentsatz an Bereichsanteilen mit geringer Dichte auf als Kontrolltiere, die Luft unter Normalbedingungen ausgesetzt waren. Das Emphysem-Phänotyp wird ebenfalls durch vergrößerte Lungenalveolen und erhöhte mittlere lineare Interzepte belegt. Die Lungenfunktionsprüfung mittels Plethysmographie zeigt, dass alle Parameter, die bei den Ozon-exponierten Mäusen abnehmen, mit den typischen Lungenfunktionsstörungen übereinstimmen, die bei Patienten mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung beobachtet werden.Außerdem verringert eine Ozonexposition signifikant die Ermüdungszeit und die Ermüdungsstrecke in einem Belastungstoleranztest. Tiere, die mit Ozon behandelt wurden, weisen ebenfalls einen signifikanten Anstieg entzündlicher Zellen, einschließlich Makrophagen und Neutrophilen, sowie eine signifikante Abnahme von IL-10 und eine Zunahme von IL-1-beta und TNF-alpha auf, was zeigt, dass das Ozonexpositionsmodell symptomatische Merkmale der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung des Menschen nachbildet. Die Durchführung dieses Verfahrens an anderen Mausstämmen, wie beispielsweise den C57 BR6 Mäusen, kann verwendet werden, um dieses OE-Modell zu erzeugen. Nach seiner Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Lungenerkrankungen den Weg, die zugrundeliegenden Mechanismen der COPD zu erforschen.Beachten Sie, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und Schutzbrille sowie die Verwendung der Lösung in einem Abzug, wenn Sie mit diesem Reagenz arbeiten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Das vorliegende Protokoll bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Verfahren erforderlich, um Messungen der Atmungsorgane Mechanik sowie die Beurteilung der Atemwege Reaktionsfähigkeit auf inhalierte Methacholin bei Mäusen mit der erzwungenen Schwingung Technik (flexiVent auszuführen; SCIREQ Inc, Montreal, QC , Kanada).

Auswertung der Atemwege Mechanik in Mäuse mit den Forced Oscillation Technique

Wir beschreiben die Agar-Perlen Methode, um anhaltende langfristige chronische Pseudomonas aeruginosa-Infektion der Atemwege im Mausmodell zu etablieren.

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, automatisierte Methoden zur Quantifizierung chronischer Lungenpathologien in einem Mausmodell der COPD bereitzustellen. Das Protokoll umfasst die Exposition von Mäusen gegenüber Zigarettenrauch (CS), die Messung der Lungenfunktion, das Aufblasen der Lunge und die Verwendung morphometrischer Methoden zur Messung von Emphysem und Umbau kleiner Atemwege bei Mäusen.

Automatisierte Messung von Lungenemphysem und Klein Airway Remodeling im Zigarettenrauch ausgesetzten Mäuse

Hier wird ein nützliches Protokoll zur Lungenfixierung vorgestellt, das einen stabilen Zustand für die histologische Auswertung von Lungenproben aus einem Mausmodell von Emphysem schafft. Der Hauptvorteil dieses Modells ist, dass es viele Lungen mit dem gleichen konstanten Druck ohne Lungenkollaps oder Deflation reparieren kann.

Lungenfixierung unter konstantem Druck zur Beurteilung von Emphysem bei Mäusen

Hier beschreiben wir eine Methode zur Bestimmung der Lunge Ausdruck von MiRNAs, die vorausgesagt werden, entzündlichen Gene regulieren mit Mäusen Ozon ausgesetzt oder gefilterte Luft in den verschiedenen Phasen des Estrous Zyklus.

Lunge MicroRNA Profiling über the Estrous Zyklus bei Mäusen Ozon ausgesetzt

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Bestimmung, ob die Exposition gegenüber Ozon, einem Kriterium des Luftschadstoffs, die Alveolarmakrophagen-Efferozytose in vivo beeinträchtigt. Dieses Protokoll verwendet häufig verwendete Reagenzien und Techniken und kann an mehrere Modelle von Lungenverletzungen angepasst werden, um Die Auswirkungen auf die Alveolar-Makrophagen-Efferozytose zu bestimmen.

In Vivo Bewertung der Alveolar Makrophagen-Efferozytose nach Ozon-Exposition

Kombinierte Ozon- und bakterielle Endotoxin-exponierte Mäuse zeigen einen weit verbreiteten Zelltod, einschließlich des von Neutrophilen. Wir beobachteten zelluläre Anpassungen wie die Störung der zytoskelettalen Lamellipodie, eine erhöhte zelluläre Expression der komplexen V-ATP-Synthase-Untereinheit β und Angiostatin in der broncho-alveolären Lavage, die Unterdrückung der Lungenimmunantwort und eine verzögerte Neutrophilenrekrutierung.

Visualisierung von lungenzellulären Anpassungen während kombinierter Ozon- und LPS-induzierter akuter Lungenverletzungen bei Der Maus

Verschiedene Tiermodelle der Lungenfibrose wurden unter Verwendung von Bleomycin etabliert, um die Pathogenese der Lungenfibrose zu klären und neue Angriffspunkte für Medikamente zu finden. Die meisten Lungenfibrosemodelle, die auf Lungengewebe abzielen, weisen jedoch eine ungleichmäßige Medikamentenverabreichung auf. Hier schlagen wir ein Modell der uniformen Lungenfibrose vor, die durch nasale Bleomycin-Vernebelung induziert wird.

Ein Mausmodell der Lungenfibrose, die durch nasale Bleomycin-Vernebelung induziert wird

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Etablierung eines Mausmodells der Silikose durch wiederholte Exposition gegenüber Kieselsäuresuspensionen über einen Nasentropf. Dieses Modell kann den pathologischen Prozess der menschlichen Silikose effizient, bequem und flexibel mit hoher Wiederholbarkeit und Wirtschaftlichkeit nachahmen.

Ein Silikose-Mausmodell, das durch wiederholtes Einatmen von kristallinem Quarzstaub hergestellt wurde

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion von Lungenfibrose bei Mäusen durch wiederholte oropharyngeale Verabreichung von Bleomycin, das pathologische Merkmale hervorbringt, die denen der idiopathischen Lungenfibrose sehr ähnlich sind.

Verfeinertes Mausmodell der idiopathischen Lungenfibrose

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Modellierung der Lungenfibrose bei Mäusen mittels aerosolisiertem Bleomycin, das über die Luftröhre verabreicht wird. Diese optimierte Methode ermöglicht eine einheitliche, quantitative und präzise Verabreichung ohne chirurgischen Schnitt und erhöht so die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der durch Bleomycin induzierten Fibrose.

Eine verfeinerte, aerosolbasierte intratracheale Bleomycin-Verabreichungsmethode für reproduzierbare und minimalinvasive Mausmodelle der Lungenfibrose

Erfahren Sie die Erzeugung eines COPD-Modells bei Mäusen durch wiederholte Ozonbelastung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Krankheitsmechanismen und das Screening neuer Wirkstoffe.

Generation von eine chronisch obstruktive Lungenerkrankung-Modell bei Mäusen durch wiederholte Ozonbelastung

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