Name: In Vivo Detektion und Analyse von Rb Protein Sumoylierung in menschlichen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Lernen Sie die in vivo Detektion von Rb-Protein-SUMOylierung in menschlichen HEK293-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse endogener und exogener SUMOylierungsprozesse für die Zellbiologieforschung.

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Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der Wissenschaft und Technologie Kommission von Shanghai (Grant Nr. 14411961800) und National Natural Science Foundation of China (Grant Nr. 81300805).

1. Erkennung von endogenen Rb Sumoylierung in der Frühphase G1 <ol><li>Zell-Kultur und Zellzyklus Synchronisation.
	<ol><li>Pflegen HEK293 Zellen im Dulbecco-haltigem Wachstumsmedium &#39; s Modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 1 % Pen-Strep und 10 % fetalen bovine Serum (FBS) bei 37 ° C und 5 % CO 2 in einem Inkubator.</li>
		<li>Synchronisieren der HEK293 Zellen in der G0-Phase.
		<ol><li>Zählen die HEK293 Zellen mit einem Hemocytometer und Samen ~1.5 X 10 7 Zellen in ein 15 cm mit 25 ml Wachstumsmedium für 24 h vor der Behandlung Schüssel. Nach dem Erreichen eines Zusammenfluss von 70-80 %, Absaugen, Medium und waschen die Zellen zweimal mit 5 mL vorgewärmt Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
			<li>Fügen Sie 25 mL DMEM mit 1 % Penicillin-Streptomycin und die Zellen bei 37 ° C inkubieren Sie für 72 h waschen Sie die Zellen aus der Platte mit 3 mL eiskaltem PBS. Übertragen Sie die Zellen in eine neue 5-mL-Tube.</li>
			<li>Vorbehaltlich Zellzyklus Analyse einen kleinen Teil der Zellen durch Durchflusszytometrie (Schritt 1.2); die verbleibenden Mehrheit der Zellen durch Zentrifugation bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur zu sammeln, und dann speichern Sie sie in ein Ultra-niedriger Temperatur Gefrierschrank bis zur Analyse der Rb Sumoylierung.</li>
		</ol></li> <li>G1-Phase zu erhalten am Ende des Synchronisierungsprozesses G0-Zellen, die DMEM entfernen und hinzufügen wieder frische Wachstumsmedium, wodurch die HEK293 Zellen der Zellzyklus erneut eingeben zu müssen. Dann sammeln die Zellen in verschiedenen Phasen G1 (frühen G1: 30 min; G1: 2 h) für Zellzyklus Analyse und weitere SUMO assay.</li>
		<li>Synchronisieren der HEK293 Zellen in der S-Phase mit der Doppel-Thymidin-Block-Methode.
		<ol><li>Wachsen HEK293 Zellen eine Konfluenz von 50 % und waschen Zellen mit vorgewärmte PBS. Fügen Sie dann Wachstumsmedium ergänzt mit 2,5 mM Thymidin für 18 h (erster Block).</li>
			<li>Das Thymidin-haltigen Medium zu entfernen und dann die Zellen zweimal mit vorgewärmte PBS waschen. Fügen Sie frisches Wachstumsmedium für 14 h, die Zellen freizugeben.</li>
			<li>Das Medium mit einer Pipette zu verwerfen und fügen Wachstumsmedium ergänzt mit 2,5 mM Thymidin für eine weitere 18 h (2. Block) vor der Durchführung einer Analyse des Zellzyklus und Rb Sumoylierung.</li>
		</ol></li> <li>Für G2/M-Synchronisation, Platte ~1.5 × 10 7 HEK293 Zellen auf einen 15 cm Teller mit 25 mL Wachstumsmedium für 24 h. Fügen Sie Nocodazole auf das Medium, bis eine Endkonzentration von 400 ng/mL erreicht ist. Zu guter Letzt die Zellen für 16 h vor der Durchführung der Analysis des Zellzyklus und Rb Sumoylierung inkubieren.</li>
	</ol></li> <li>Zellzyklus Analyse von Durchflusszytometrie.
	<ol><li>Wieder aussetzen der synchronisierten HEK293 mit PBS-Puffer und dann fix die Zellsuspension mit eiskalten 70 % Ethanol für 2 h bei 4 ° c beachten Sie, dass zu minimieren, clustering-Zelle, die Zellsuspension tropfenweise hinzufügen das eiskalte 100 % Ethanol, eine Endkonzentration von zu erhalten 70 % Ethanol während sanft aufschütteln.</li>
		<li>Die Zellen für 5 min bei 500 X g Zentrifugieren dann sorgfältig überstand verwerfen und die Zellen zweimal mit PBS waschen. Wiederholen Sie den Schritt Zentrifuge.</li>
		<li>Hinzufügen 500 µL PBS mit 50 µg/mL-Nukleinsäure Fleck Propidium Jodid, 0,1 % Triton X-100 und 1 µg/mL RNase A zu den Zellen und gut mischen. Inkubieren Sie die Zellen für 15 min bei 37 ° c</li>
		<li>Speichern die Proben bei 4 ° C bis zur Analyse von Durchflusszytometrie.</li>
	</ol></li> <li>Immunopräzipitation des endogenen Rb-Proteins.
	<ol><li>Bereiten die HEK293 Zelle Lysates.
		<ol><li>Lyse der synchronisierten HEK293 Zellen sanft wieder aussetzen sie in 1 mL eiskaltes Radio-Immunopräzipitation (RIPA) Lyse Testpuffer (Tabelle 1) frisch mit 20 mM N-Ethylmaleimide, ein Isopeptidase-Inhibitor hinzugefügt, die konnte SUMO Proteasen zu blockieren und zu stabilisieren SUMO Konjugate.</li>
			<li>Weitere Homogenisierung der Zellen auf Eis durch Dounce Homogenisierung, Beschallung oder Durchreise durch 10 Mal eine Nadel 21 G auf einer 2 mL Spritze. Inkubieren Sie dann die Zellen auf Eis für 5 min. 
			Hinweis: Die anionische Detergenzien Dodecyl Natriumsulfat (SDS) im RIPA Puffer ist entscheidend für die spätere Bestimmung der Rb-SUMO, da es das unspezifische SUMO-Signal beseitigen könnte, das aus der nicht-kovalente Wechselwirkung zwischen der Rb-Protein und anderen abgeleitet ist nicht-Rb SUMO-Art.</li>
		</ol></li> <li>Zentrifugieren der Zelle Lysates bei 18.000 x g für 30 min bei 4 ° c die Überstände an neuen 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren übertragen. 
		Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Proteine können bei-80 ° C für mindestens 6 Monate gelagert werden.</li>
		<li>Um das Eingabesteuerelement jeder Probe der späteren Western-Blot vorzubereiten, speichern Sie einen kleinen Teil der oben beschriebenen Überstand auf eine neue Röhre und speichern bei-80 ° c</li>
		<li>1 µg von unspezifischen Maus Immunglobulin G (IgG) der gleichen Spezies und Isotype Agrega zu den oben genannten Überstände der monoklonalen Antikörper Rb und 20 µL 50 % Protein A/G-Sepharose Gülle. Dann 1 h bei 4 ° C mit sanften Drehung inkubieren.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° C. sorgfältig die Überstände ohne zu stören die Perlen zu sammeln, und übertragen Sie sie auf neue 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren. Jedes der Beispiele fügen Sie 5 µL Rb Primärantikörper und 40 µL 50 % Protein A/G-Sepharose Gülle hinzu. Dann über Nacht bei 4 ° C mit sanften Drehung inkubieren.</li>
		<li>Sammeln die Perlen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° C, und entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch pipettieren. Beachten Sie, dass zur Vermeidung von Verlust der Wulst, aspirieren Sie trockenen Perlen nicht.</li>
		<li>Waschen die Perlen viermal mit 1 mL des Puffers RIPA. Jedes Mal, mischen die Rohre gut durch Rotation bei 4 ° C für 15 min. sammeln die Perlen von langsamem Zentrifugation bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° C und verwerfen Sie die Überstände.</li>
		<li>Nach der Entfernung der letzten Wäsche Überstände, erneut unterbrechen die Perlen in 30 µL 1 x Natrium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) laden Puffer (Tabelle 1) und gut mischen.
		<ol><li>Inkubieren blockieren die Rohre bei 100 ° C in die Hitze für 10 min Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 1 min um die Perlen zu Pellets. Sorgfältig die Überstände ohne zu stören die Perlen zu sammeln, und übertragen Sie sie auf 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren.</li>
		</ol></li> <li>Analysieren die Proben von 4-20 % Steigung SDS-PAGE gel und Western blot oder bei-20 ° C für die spätere Verwendung zu speichern.</li>
	</ol></li></ol> 2. Analyse der 6XHis-tagged exogene Rb Sumoylierung in menschlichen Zellen <ol><li>Zell-Kultur und Transfektion.
	<ol><li>Samen ~ 6 × 10 6 HEK293 Zellen in ein 10 cm Schale und inkubieren Sie für 24 h im Wachstumsmedium unter normalen Zelle Kulturbedingungen, 75-85 % konfluierende Zellen zu erwerben. Vor Transfektion, entfernen das Wachstumsmedium und 6 mL vorgewärmte reduzierte Serum-Medium (siehe Tabelle der Materialien) und legen Sie dann das Geschirr wieder in den Inkubator.</li>
		<li>Für Rb konstitutive Sumoylierung Assay, bzw. 15 µg 6XHis-tagged Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT und Ubc9-C93S-Plasmide in 500 µL reduzierte Serum Medium in 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren, hinzufügen.
		<ol><li>Zu analysieren, die SUMO-Konjugation der Wildtyp Rb und seine Sumoylierung-defekt-Mutante, 10 µg entweder 6XHis-tagged Rb-WT oder Rb-K720R Plasmid zusammen mit GFP-SUMO1 mischen (10 µg) in 500 µL reduziert Serum Medium in 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhrchen 13.</li>
		</ol></li> <li>Unterdessen in einem separaten Rohr mix 50 µL Transfection Reagens (siehe Tabelle der Materialien) in 500 µL Serum Medium reduziert und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min.</li>
		<li>Voll kombinieren die zwei separate Röhren, die oben beschriebenen und Inkubation bei Raumtemperatur 15 Minuten hinzufügen die Transfektion Reagenz/Plasmid-komplexe, die Zellen und weiterhin Kultur für 8 h bei 5 % CO 2 und 37 ° c</li>
		<li>Ersetzen Sie reduzierte Serum Medium mit Wachstumsmedium und inkubieren Sie die Zellen unter normalen Kulturbedingungen für 48 h nach Transfektion.</li>
	</ol></li> <li>Nickel Pulldown-Affinität des Rb 6XHis-tagged Proteins.
	<ol><li>Die transfizierten HEK293 Zellen lysiert und die gesamten Proteine als beschriebenen Abschnitt 1.3.1 extrahieren.</li>
		<li>Zentrifuge der Zelle Lysates bei 18.000 x g für 30 min bei 4 ° C. sorgfältig sammeln die Überstände und übertragen Sie sie auf saubere Rohre. 
		Hinweis: Das Protein eingefroren werden kann an dieser Stelle für mehr als 6 Monate bei-80 ° c</li>
		<li>Um das Eingabesteuerelement jeder Probe der späteren Western-Blot vorzubereiten, speichern Sie einen kleinen Teil der Überstände oben beschrieben, eine neue Röhre und speichern bei-80 ° c</li>
		<li>Waschen 25 µL 50 % nickel Nitrilotriacetic Säure (Ni-NTA) Agarose Korne mit RIPA Puffer zweimal in einem 1,5 mL Mikro-Zentrifugenröhrchen für jede Probe. Sammeln Sie die Perlen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° c</li>
		<li>Add 1 M Imidazol zu jeder Probe, eine Endkonzentration von 10 mM zu erhalten. Fügen Sie dann jede Probe in das Röhrchen mit der vorbereiteten Ni-NTA Agarose Korne.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Perlen und die Lysates für 2 h bei 4 ° C mit sanften Drehung. Drehen Sie die Perlen bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° C, und entfernen Sie vorsichtig die Überstände durch pipettieren. Aspirieren Sie um Perlen zu vermeiden, nicht die Perlen trocken.</li>
		<li>Waschen die Perlen mit 1 mL Waschpuffer mit 20 mM Imidazol (Tabelle 1). Jedes Mal, mischen die Rohre gut durch Rotation bei 4 ° C für 15 min. sammeln die Perlen von Spinnen bei 3.000 x g für 3 min bei 4 ° C und verwerfen die Überstände.</li>
		<li>Nach dem letzten Waschen jede Probe 30 µL Elution buffer mit 250 mM Imidazol (Tabelle 1) hinzu und wechseln Sie um zu mischen. Dann 20 min bei 4 ° C, die Proteine eluieren inkubieren.</li>
		<li>Mischen jede Probe mit 6 × SDS-PAGE laden Puffer (Tabelle 1). Dann, brüten die Rohre bei 100 ° C in einem Hitze-Block für 10 min.</li>
		<li>Zentrifuge bei 12.000 x g für 1 min um die Perlen zu Pellets. Sorgfältig die Überstände ohne zu stören die Perlen zu sammeln, und die Proben auf 1,5 ml Mikro-Zentrifuge Rohre übertragen. Die Proben von Western-Blot analysiert oder bei-20 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden können.</li>
	</ol></li></ol> 3. Western-Blot <ol><li>laden die Immunopräzipitation oder pull-down Proben aus den vorherigen Schritten auf 4-20 % Steigung SDS-PAGE Gelen. Durchführung von Elektrophorese bei 120 V für 90 min um die Proteine zu trennen.</li>
	<li>Übertragen die Proteine aus dem Gel auf eine Membran Polyvinylidene Difluoride (PVDF) von Elektroblotting bei 300 mA für 90 min bei 4 ° C mit der Tank-Transfer-Methode. Blockieren die PVDF-Membran in mit 5 % Magermilch (Tabelle 1) für 1 h bei Raumtemperatur-Blockpuffer.</li>
	<li>Inkubation der Membran mit Primärantikörper in Verdünnungspuffer Antikörper enthält 3 % Rinderserumalbumin (BSA) (Tabelle 1) über Nacht bei 4 ° C. Verwenden Sie für primären Antikörper eine arbeiten-Konzentration von 0,5 µg/mL (Anti-SUMO1 Antikörper) oder einer Verdünnung von 1: 2000 (Anti-Rb und Anti-Tubulin Antikörper) oder 1:5,000 (Anti-GFP und Anti-His Antikörper).</li>
	<li>Waschen die Membran 3 X für 10 min jeweils mit 1 x Tris gepufferte Kochsalzlösung mit Tween (TBST) Puffer (Tabelle 1). Inkubieren Sie die Membran mit Arten bestimmten Meerrettich Peroxidase HRP-konjugierten Sekundärantikörper verdünnten 1:5,000 in Blockpuffer, enthält 5 % Magermilch (Tabelle 1). Waschen Sie die Membran 3 X für 10 min jeweils mit 1 Puffer X TBST.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit verstärkte Chemilumineszenz (ECL) Lösung arbeiten. Die Membran mit Plastikfolie abdecken und setzen Sie es je nach Signalstärke Röntgenfilm.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll zum erkennen und analysieren der endogenen Sumoylierung Rb in menschlichen Zellen. Da diese Methode speziell auf das endogene Rb-Protein ohne jede Abwechslung der globalen SUMO-bezogenen Signal ausgerichtet ist, ist es ein wichtiges Instrument für die Untersuchung von Rb-SUMO Modifikation unter völlig natürlichen physiologischen Umständen.
Um dieses Ziel zu erreichen, ist es wichtig, im Hinterkopf behalten, dass: 1) Obwohl SUMO vier Isoformen (SUMO1-4...

Die genaue Steuerung der Zellzyklus Progression in eukaryontischen Zellen beruht auf einer engen regulatorischen Netzwerk sorgt dafür, dass bestimmte Ereignisse in einer geordneten Art und Weise1,2stattfinden. Einer der wichtigsten Akteure in diesem Netzwerk ist das Retinoblastom (Rb)-Protein, das erste geklonte Tumorsuppressor1,3. Das Rb-Protein wird angenommen, dass ein negativer Regulator der Zellzyklus Progression, vor allem für die G0/G1 S Phasenübergang und Tumor Wachstum4,5. Ausfall der Rb führt entweder direkt auf die am häufigsten verwendeten intraokularen Bösartigkeit bei Kindern, Retinoblastom, oder trägt zur Entwicklung von vielen anderen Arten von Krebs5. Darüber hinaus engagiert sich die Rb in viele zelluläre Signalwege einschließlich der Zelldifferenzierung, Chromatin umgestalten und Mitochondrien-vermittelten Apoptose3,6,7.
Post-translationalen Modifikationen spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des RB Funktion8,9. Phosphorylierung ist eine solche Änderung, und es führt in der Regel zu Rb Inaktivierung. In ruhenden G0-Zellen ist Rb aktiv mit einem niedrigen Phosphorylierung. Fortschritt durch G0/G1-Phase Zellen, ist Rb sequenziell hyper phosphoryliert durch eine Reihe von cyclin-abhängige Proteinkinasen (CDKs) und Cyclin, z. B. cyclin E/CDK2 und cyclin D/CDK4/6, die Rb zu inaktivieren und seine Fähigkeit, Zellzyklus unterdrücken zu beseitigen im Zusammenhang mit gen-Ausdruck4,10. RB konnte auch durch kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO)11,12,13geändert werden.
SUMO ist ein Ubiquitin-wie Protein, das eine Vielzahl von Zielproteinen kovalent verbunden ist. Es ist wichtig für verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich der Regulierung des Zellzyklus, Transkription, Protein zellulären Lokalisation und Abbau, Transport und DNA-Reparatur14,15,16, 17 , 18. der SUMO Konjugation Weg besteht aus dimeres SUMO E1 aktivierende Enzym SAE1/UBA2, der einzigen E2 conjugating Enzym Ubc9 und mehrere E3 Ligases SUMO-spezifische Proteasen. Im Allgemeinen müssen im Entstehen begriffenen SUMO Proteine proteolytisch verarbeitet werden, um die ältere Form zu erzeugen. Reife SUMO ist durch E1-Heterodimer aktiviert und dann auf das Enzym E2 Ubc9 übertragen. Schließlich die C-terminale Glycin Sumo ist kovalent an die Ziel-Lysin eines Substrats konjugiert, und dieser Prozess wird in der Regel durch E3 Ligases erleichtert. Das SUMO Protein kann durch spezifische Proteasen aus dem modifizierten Substrat entfernt werden. Eine frühere Studie von den Autoren dieses Papiers ergab, dass Sumoylierung Rb die Bindung an CDK2 erhöht, führt zu hyper-Phosphorylierung bei der frühen G1-Phase, ein Prozess, der für Zellzyklus Fortschreiten13notwendig ist. Wir zeigten auch, dass der Verlust der Rb Sumoylierung eine verminderte Zellvermehrung verursacht. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass die Sumoylierung Rb proteasomalen Umsatz, das Rb-Protein schützt somit die Erhöhung des Rb-Protein in Zellen19. Daher spielt Sumoylierung eine wichtige Rolle bei Rb-Funktion in verschiedenen zellulären Prozessen. Weiter zu studieren der funktionalen Konsequenz und physiologische Relevanz von Rb Sumoylierung, ist es wichtig, eine wirksame Methode um die SUMO-Status der Rb in menschlichen Zellen oder Geweben Patienten analysieren zu entwickeln.
Sumoylierung ist eine reversible, hoch dynamischen Prozess. So ist es in der Regel schwer zu erkennen, die SUMO-modifizierte Proteine vollständig endogenen Bedingungen. Dieses Papier stellt eine Methode, um endogene Rb Sumoylierung zu erkennen. Außerdem zeigt es, wie exogene Rb Sumoylierung Wildtyp Rb und seine SUMO-defizienten Mutation11erkannt. Jacobs Et Al. beschrieben vor allem eine Methode, um die SUMO-Änderung eines bestimmten Substrats speziell von Ubc9 unter der Regie von Fusion Sumoylierung (UFD)20erhöhen. Basierend auf dieser Methode, beschreibt dieses Protokoll die erzwungene Sumoylierung Rb und seiner funktionellen Konsequenzen zu analysieren. Da die Hunderte von SUMO Substrate bisher beschrieben worden sind und weitere vermeintliche SUMO Substrate aus vielen Proteomic basierende Assays identifiziert wurden, kann dieses Protokoll angewendet werden, um die SUMO-Modifikation dieser Proteine in menschlichen Zellen zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 31985070</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Thymidin</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethylmaleimid</td><td>Sigma</td><td>E3876&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>AMRESCO</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Ersatz (NP-40)</td><td>AMRESCO</td><td>M158</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor</td><td>Roche</td><td>5892970001</td><td></td></tr><tr><td>Maus Immunglobulin G (IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Rb Antikörper</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>#9309</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G-Sepharose Perlen</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Nickel-Nitrilotriaessigsäure (Ni-NTA) Agarose-Kügelchen</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Gel mit 4 %-20 % Gradient</td><td>BIO-RAD</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>AMRESCO</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin-Antikörper</td><td>Abmart</td><td>M30109</td><td></td></tr><tr><td>SUMO1-Antikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-2044</td><td></td></tr><tr><td>GFP-Antikörper</td><td>Abmart</td><td>M20004</td><td></td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase (HRP)-Sekundärantikörper</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>verbesserte Chemilumineszenz (ECL) Kit</td><td>Thermo Fisher Wissenschaftlich</td><td>32106</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo detektion und analyse von rb protein sumoylierung in menschlichen zellen

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Die post-translationalen Modifikationen von Proteinen sind entscheidend für die richtige Regulierung der intrazellulären Signaltransduktion. Unter diesen Änderungen ist kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO) ein Ubiquitin-wie Protein, das die Lysin-Rückstände verschiedener Zielproteine zu regulieren zelluläre Prozesse wie Gentranskription, DNA-Reparatur, Protein kovalent verbunden ist Interaktion und Abbau, subzelluläre Transport und Signaltransduktion. Die gängigste Methode zur Erkennung von Protein Sumoylierung basiert auf den Ausdruck und die Reinigung von rekombinanten tagged Proteinen in Bakterien, so dass für eine in-vitro- biochemische Reaktion, die ist einfach und eignet sich für den Umgang mit mechanistischen Fragen. Aufgrund der Komplexität des Prozesses der Sumoylierung in Vivoist es jedoch schwieriger zu erkennen und zu analysieren, Protein Sumoylierung in Zellen, vor allem unter endogenen Bedingungen. Eine aktuelle Studie von den Autoren dieses Artikels ergeben, dass endogene Retinoblastom (Rb) Protein, ein Tumorsuppressor, die entscheidend für die negative Regulierung des Zellzyklus Progression, speziell sumoyliert in der frühen G1-Phase. Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für die Erkennung und Analyse von Rb Sumoylierung endogene und exogene Bedingungen in menschlichen Zellen. Dieses Protokoll eignet sich für die phänotypische und funktionelle Untersuchung der SUMO-Änderung der Rb, sowie viele andere SUMO-gezielte Proteine in menschlichen Zellen.

Um endogene Rb Sumoylierung während Zellzyklus Progression zu erkennen, synchronisiert diese Studie zunächst HEK293 Zellen in fünf verschiedenen Phasen des Zellzyklus (G0, frühe G1, G1, S und G2/M), wie im Abschnitt "Protokoll" dieses Artikels beschrieben. Die Qualität der Synchronisation wurde bestätigt, indem die Nukleinsäure-Fleck mit Propidium Jodid gefolgt von Flow-Zytometrie-Analyse (Abbildung 1). Als nächstes wurden die Zellen gesammelt und durch Denat...

Kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO) Familie Proteine sind an Lysin-Reste von Zielproteine, verschiedene zelluläre Prozesse regulieren konjugiert. Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für den Nachweis von Retinoblastom (Rb) Protein Sumoylierung endogene und exogene Bedingungen in menschlichen Zellen.

In Vivo Detektion und Analyse von Rb Protein Sumoylierung in menschlichen Zellen

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die SUMOylierung von Retinoblastomproteinen unter endogenen und exogenen Bedingungen in menschlichen Zellen nachzuweisen. An die Lysinreste von Zielproteinen gebundene Proteine der Familie der kleinen ubiquitinähnlichen Modifikatoren (SUMO) regulieren verschiedene zelluläre Prozesse. In der Regel ist es schwieriger, die SUMOylierung eines Proteins in Zellen zu initiieren, aufgrund der Komplexität der SUMOylierung in vivo.Dieses Experiment dient zum Nachweis der SUMOylierung sowohl endogener als auch exogener Rb-Proteine. Obwohl diese Methode Einblicke in die SUMOylierung von Rb-Proteinen ermöglicht, eignet sie sich ebenfalls zum Nachweis vieler anderer SUMO-Zielproteine in Zellen. Geben Sie zunächst 25 Milliliter DMEM, das ein Prozent Penicillin-Streptomycin enthält, hinzu und inkubieren Sie die HEK293-Zellen 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.Spülen Sie die Zellen mit drei Milliliter eiskalter PBS von der Platte ab. Überführen Sie die Zellen anschließend in ein neues fünf Milliliter-Röhrchen. Um am Ende des G0-Synchronisationsprozesses Zellen in der G1-Phase zu erhalten, entfernen Sie das DMEM und geben frisches Wachstumsme

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Dieses Video demonstriert die in vitro Methode zur SUMOylierung von Substratproteinen unter Verwendung einer sequentiellen Enzymkaskade. Weiterhin wird der SUMOylierte Status des Proteins mit Hilfe der Elektrophorese- und Immunblotting-Technik identifiziert.

SUMOylation Assay: Eine in vitro Technik zum Nachweis des SUMOylierungsstatus von Substratproteinen durch Immunoblotting

Ratiometrische bimolekularen Beacons (RBMBs), um die Bild einzigen entwickelt RNA-Transkripte in lebenden Zellen verwendet werden. Hier beschreiben wir die Herstellung und Reinigung von RBMBs, Lieferung RBMBs in Zellen von Mikroporation und fluoreszierende Abbildung einzelner RNA-Transkripte in Echtzeit.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

Diese Handschrift beschreibt den Nachweis von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Kinetochor-Proteinen, Ndc10 und Ndc80, in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae.

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

Protein-Wechselwirkungen können sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma einer Zelle auftreten. Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, werden die traditionelle Co-Immunpräzipitation und der moderne Proximity-Ligationsassay eingesetzt. In dieser Studie vergleichen wir diese beiden Methoden, um die Verteilung der NF90-RBM3-Wechselwirkungen im Zellkern und im Zytoplasma sichtbar zu machen.

Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in Kern- und Cytoplasma-Fraktionen durch Co-Immunpräzipitation und<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay

Wir beschreiben ein Protokoll zur RNA-bindende Proteine und RNA-bindende Regionen in lebenden Zellen mit UV-vermittelten Photocrosslinking und Massenspektrometrie.

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Im Gegensatz zu Ubiquitin Ligases wurden einige E3 SUMO Ligases identifiziert. Dieses modifizierte in-vitro- Sumoylierung Protokoll ist in der Lage, neuartige SUMO E3 Ligases durch eine in-vitro- Rekonstitution Assay zu identifizieren.

In-vitro- Sumoylierung Assay SUMO E3 Ligase Tätigkeit zu studieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Dominant-negativen induzierbaren System zu entwickeln, in der kein Protein bedingt inaktiviert durch reversibel überexprimiert eine Dominant-negativen mutierte Version davon.

Induzierbaren und Reversible Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung

SUMO ist ein essentielles und hoch konserviertes, kleines, ubiquitin-ähnliches Modifikatorprotein. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung eines stresstoleranten rekombinanten, rekombinanten SUMO-Fantifen-Proteins (kmUTAG) zur Visualisierung von nativen, nicht markierten SUMO-Konjugaten und deren Lokalisierung in einer Vielzahl von Zelltypen.

Lokalisierung von SUMO-modifizierten Proteinen mit fluoreszierenden Sumo-Fallen Proteinen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anreicherung, Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen vor, die durch SUMO in vivo sowohl aus menschlichen Häpatomzellen als auch aus Lebertumoren modifiziert wurden, die aus Mausmodellen des hepatozellulären Karzinoms unter Verwendung von SUMO-bindenden Einheiten (SUBEs) gewonnen wurden.

SUMO-Binding Entities (SUBEs) als Werkzeuge zur Anreicherung, Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung des SUMO-Proteoms bei Leberkrebs

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-Likes (Ubls) spezifische Proteome zu etablieren, um Änderungen dieser Art von post-translationalen Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, die mit einer bestimmten Erkrankung wie einer Behandlung oder einem Phänotyp verbunden sind.

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Diese Protokolle liefern die Methodik zur Beurteilung der enzymatischen Aktivität einzelner Mitglieder der Protein-Arginin-Methyltransferase-Familie (PRMT) in Zellen. Detaillierte Richtlinien zur Bewertung der PRMT-Aktivität unter Verwendung endogener und exogener Biomarker, Methyl-Arginin-erkennender Antikörper und Inhibitor-Werkzeugverbindungen werden beschrieben.

Quantitative Methoden zur Untersuchung der Protein-Arginin-Methyltransferase-1-9-Aktivität in Zellen

Lernen Sie die in vivo Detektion von Rb-Protein-SUMOylierung in menschlichen HEK293-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse endogener und exogener SUMOylierungsprozesse für die Zellbiologieforschung.

In Vivo Detektion und Analyse von Rb Protein Sumoylierung in menschlichen Zellen

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