In Vivo Detektion und Analyse von Rb Protein Sumoylierung in menschlichen Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die SUMOylierung von Retinoblastomproteinen unter endogenen und exogenen Bedingungen in menschlichen Zellen nachzuweisen. An die Lysinreste von Zielproteinen gebundene Proteine der Familie der kleinen ubiquitinähnlichen Modifikatoren (SUMO) regulieren verschiedene zelluläre Prozesse. In der Regel ist es schwieriger, die SUMOylierung eines Proteins in Zellen zu initiieren, aufgrund der Komplexität der SUMOylierung in vivo.

Dieses Experiment dient zum Nachweis der SUMOylierung sowohl endogener als auch exogener Rb-Proteine. Obwohl diese Methode Einblicke in die SUMOylierung von Rb-Proteinen ermöglicht, eignet sie sich ebenfalls zum Nachweis vieler anderer SUMO-Zielproteine in Zellen. Geben Sie zunächst 25 Milliliter DMEM, das ein Prozent Penicillin-Streptomycin enthält, hinzu und inkubieren Sie die HEK293-Zellen 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Spülen Sie die Zellen mit drei Milliliter eiskalter PBS von der Platte ab. Überführen Sie die Zellen anschließend in ein neues fünf Milliliter-Röhrchen. Um am Ende des G0-Synchronisationsprozesses Zellen in der G1-Phase zu erhalten, entfernen Sie das DMEM und geben frisches Wachstumsmedium hinzu, wodurch die HEK293-Zellen wieder in den Zellzyklus eintreten können.

Sammlen Sie anschließend die Zellen in verschiedenen G1-Phasen für die Zellzyklusanalyse und weitere SUMO-Assays. Um die HEK293-Zellen in der S-Phase zu synchronisieren, verwenden Sie die Doppel-Thymidin-Block-Methode. Züchten Sie zunächst die HEK293-Zellen bis zu einer Konfluenz von 50 %. Waschen Sie dann die Zellen mit vorgewärmtem PBS.

Als ersten Block 18 Stunden lang Wachstumsmedium mit 2,5 mmolarem Thymidin zugeben. Das Thymidin enthaltende Medium entfernen und die Zellen zweimal mit vorgewärmtem PBS waschen. 14 Stunden frisches Wachstumsmedium hinzufügen, um die Zellen aus der Blockade zu lösen.

Nachdem die Zellen aus dem ersten Block freigegeben wurden, verwerfen Sie das Medium mit einer Pipette. Fügen Sie anschließend Wachstumsmedium, das mit 2,5 Millimolar Thymidin ergänzt ist, für weitere 18 Stunden hinzu, um einen zweiten Block durchzuführen, bevor eine Analyse des Zellzyklus und der Rb-SUMOylierung erfolgt. Für die Synchronisierung in der G2- oder M-Phase säen Sie etwa 15 Millionen HEK293-Zellen auf eine 15-Zentimeter-Schale mit 25 Milliliter Wachstumsmedium aus und kultivieren sie 24 Stunden lang.

Fügen Sie anschließend Nicotisol dem Medium hinzu, bis eine Endkonzentration von 400 Nanogramm pro Milliliter erreicht ist. Inkubieren Sie die Zellen abschließend 16 Stunden lang, bevor Sie die Analyse des Zellzyklus durchflusszytometrisch wie im Textprotokoll beschrieben durchführen. Lyse die synchronisierten HEK293-Zellen, indem Sie sie vorsichtig in einem Milliliter eiskaltem Radioimmunpräzipitations-Assay- oder RIPA-Lysepuffer, der frisch zugesetzten Isopeptidase-Inhibitoren zur Hemmung von SUMO-Proteasen und Stabilisierung von SUMO-Konjugaten enthält, resuspendieren.

Versetzen Sie die Zellen, indem Sie sie 10-mal durch eine 21-Gauge-Nadel, die an eine 2-Milliliter-Spritze angeschlossen ist, auf Eis homogenisieren. Inkubieren Sie anschließend die Zellen fünf Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie danach die Zelllysate 30 Minuten bei 18000 × g und 4 °C.

Nach der Zentrifugation die Überstände in neue 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Zum Überstand je ein Mikrogramm unspezifisches Maus-Immunglobulin G derselben Spezies und Isotypen wie der monoklonale Rb-Antikörper hinzufügen. Außerdem 20 Mikroliter 50-prozentige Protein-AG-Sepharosesuspension zugeben und die Mischung eine Stunde bei vier Grad Celsius unter sanfter Rotation inkubieren.

Zentrifugieren Sie die Proben bei dreitausend × g für drei Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie vorsichtig die Überstände, ohne die Perlen zu stören, und überführen Sie sie in neue 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie zu jeder Probe fünf Mikroliter rb-Primärantikörper und 40 Mikroliter 50-prozentige Protein-A/G-Sepharose-Suspension hinzu und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation.

Nach der Zentrifugation waschen Sie die Kügelchen mit einem Milliliter des Rifa-Puffers. Mischen Sie die Röhrchen durch Rotation bei vier Grad Celsius 15 Minuten lang gut durch. Sammeln Sie die Kügelchen anschließend erneut durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit wie zuvor und verwerfen Sie die Überstände.

Nachdem der Waschschritt viermal durchgeführt wurde, die Kügelchen in 30 µL 1x Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Lade-Puffer resuspendieren und gut mischen. Die Röhrchen 10 Minuten lang bei 100 °C in einem Heizblock inkubieren. Die Proben bei 12.000 × g eine Minute lang zentrifugieren, um die Kügelchen zu pelletieren.

Sammlen Sie abschließend vorsichtig die Überstände, ohne die Perlen zu stören, und überführen Sie sie in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie die Zellkulturtransfektion und die Zelllyse von HEK293-Zellen wie im Textprotokoll beschrieben durch. Waschen Sie anschließend 25 Mikroliter 50-prozentiger Nickel-Nitrilotriessigsäure-Agarose-Perlen mit RIPA-Puffer in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für jede Probe.

Sammeln Sie die Perlen durch Zentrifugation bei dreitausend ×g für drei Minuten bei vier Grad Celsius. Geben Sie einem molaren Emytozol zu jeder Probe hinzu, um eine Endkonzentration von 10 Millimolar zu erreichen. Anschließend geben Sie jede Probe in das Röhrchen, das die vorbereiteten Agoros-Perlen enthält.

Die Kügelchen und die Lysate zwei Stunden bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren inkubieren. Anschließend die Kügelchen dreitausendmal zentrifugieren bei drei Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation vorsichtig die Überstände per Pipettieren entfernen.

Um einen Verlust der Kügelchen zu vermeiden, dürfen diese nicht trocken abgesaugt werden. Anschließend waschen Sie die Kügelchen mit einem Milliliter Waschpuffer, der 20 Millimolar Emzitol enthält. Vortexen Sie die Röhrchen gründlich und inkubieren Sie sie vierzehn Grad Celsius für 15 Minuten, bevor Sie die Kügelchen durch Zentrifugation sammeln.

Nach der letzten Wäsche 30 Mikroliter des Eleusian-Puffers, der 250 Millimolar Emitozol enthält, zu jeder Probe hinzufügen und vorsichtig schütteln, um zu mischen. Anschließend die Proben 20 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren, um die Proteine zu eluieren. Jede Probe mit sechsfachem SDS-PAGE-Lade-Puffer mischen.

Anschließend die Röhrchen 10 Minuten lang bei 100 Grad Celsius in einem Wärmeblock inkubieren. Nach der Zentrifugation die Immunpräzipitations- oder Pull-down-Proben auf SDS-PAGE-Gelen mit einem Gradienten von vier bis 20 Prozent auftragen. Die Elektrophorese 90 Minuten lang bei 120 Volt durchführen, um die Proteine zu trennen.

Nach der Zellzyklus-Synchronisierung und der Immunpräzipitation der endogenen Rb-Spezies wurde das Vorhandensein des SUMO-Signals im frühen G1-Stadium spezifisch mittels eines anti-SUMO1-Antikörpers nachgewiesen. Repräsentative Ergebnisse zeigen die erzwungene SUMOylierung des Rb-Proteins durch direkte Fusion des SUMO-E2-Enzyms UBC9 an sein C-Terminus. Beachten Sie das am langsamsten wandernde, SUMOylierte Rb-Protein.

Durch die Verwendung des SUMO-defizienten Mutanten von Rb, K720R, wird das Vorhandensein der Rb-SUMOylierung in Zellen weiter bestätigt. Mit diesem Verfahren können somit viele weitere SUMO-Zielproteine in Kulturzellen analysiert werden. In den meisten Fällen ist nur ein sehr kleiner Anteil eines Substrats SUMOyliert, weshalb es bei der Durchführung dieses Verfahrens wichtig ist, die Effizienz der Immunpräzipitation zu optimieren.