In Vivo Detektion und Analyse von Rb Protein Sumoylierung in menschlichen Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Retinoblastom-Proteine SUMOylierung unter endogenen und exogenen Bedingungen in menschlichen Zellen nachzuweisen. Proteine der Familie der kleinen Ubiquitin-verwandten Modifikatoren (SUMO) werden an die Lysinreste von Zielproteinen konjugiert, um verschiedene zelluläre Prozesse zu regulieren. Normalerweise ist es aufgrund der Komplexität der SUMOylierung in vivo schwieriger, eine Protein-SUMOylierung in Zellen zu starten.

Dieses Experiment weist die SUMOylierung sowohl endogener als auch exogener Rb-Proteine nach. Obwohl diese Methode einen Einblick in die SUMOylierung von Rb-Proteinen geben kann, eignet sie sich auch für den Nachweis vieler anderer SUMO-Zielproteine in Zellen. Fügen Sie zunächst 25 Milliliter DMEM mit einem Prozent Penicillin-Streptomycin hinzu und inkubieren Sie die HEK293-Zellen 72 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Waschen Sie die Zellen mit drei Millilitern eiskaltem PBS von der Platte. Übertragen Sie dann die Zellen in ein neues Fünf-Milliliter-Röhrchen. Um G1-Phasenzellen am Ende des G0-Synchronisationsprozesses zu erhalten, entfernen Sie das DMEM und fügen Sie frisches Wachstumsmedium wieder hinzu, damit die HEK293-Zellen wieder in den Zellzyklus eintreten können.

Sammeln Sie dann die Zellen in verschiedenen G1-Phasen für die Zellzyklusanalyse und den weiteren SUMO-Assay. Um die HEK293-Zellen in der S-Phase zu synchronisieren, verwenden Sie die Doppel-Thymidin-Block-Methode. Züchten Sie zuerst die HEK293-Zellen auf eine Konfluenz von 50 % und waschen Sie dann die Zellen mit vorgewärmtem PBS.

Fügen Sie als ersten Block Wachstumsmedium hinzu, das mit 2,5 millimolaren Thymidin für 18 Stunden ergänzt ist. Entfernen Sie das thymidinhaltige Medium und waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmtem PBS. Fügen Sie 14 Stunden lang frisches Wachstumsmedium hinzu, um die Zellen aus dem Block zu lösen.

Nachdem Sie die Zellen aus dem ersten Block gelöst haben, entsorgen Sie das Medium mit einer Pipette. Fügen Sie dann als zweiten Block weiteres 18 Stunden lang Wachstumsmedium hinzu, das mit 2,5 millimolaren Thymidin ergänzt ist, bevor Sie eine Analyse des Zellzyklus und der Rb-SUMOylierung durchführen. Für die G2- oder M-Phasensynchronisation werden etwa 15 Millionen HEK293-Zellen auf eine 15-Zentimeter-Schale mit 25 Millilitern Wachstumsmedium aufgetragen und 24 Stunden lang gezüchtet.

Geben Sie dann Nikotisol in das Medium, bis eine Endkonzentration von 400 Nanogramm pro Milliliter erreicht ist. Inkubieren Sie die Zellen schließlich 16 Stunden lang, bevor Sie die Analyse des Zellzyklus durch Durchflusszytometrie durchführen, wie im Textprotokoll beschrieben. Lysieren Sie die synchronisierten HEK293-Zellen, indem Sie sie vorsichtig in einem Milliliter eiskaltem Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA) Lysepuffer mit frisch hinzugefügtem Isopeptidase-Inhibitor resuspendieren, um SUMO-Proteasen zu blockieren und SUMO-Konjugate zu stabilisieren.

Homogenisieren Sie die Zellen auf Eis weiter, indem Sie sie 10 Mal durch eine 21-Gauge-Nadel führen, die an einer Zwei-Milliliter-Spritze befestigt ist. Dann inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang auf Eis. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zelllysate bei 18000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.

Nach der Zentrifugation werden die Überstände in neue 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Zu den Überständen wird ein Mikrogramm unspezifisches Maus-Immunglobulin G der gleichen Spezies und des gleichen Isotyps wie der monoklonale Rb-Antikörper hinzugefügt. Fügen Sie außerdem 20 Mikroliter 50 Prozent Protein AG Sephyroslurry hinzu und inkubieren Sie die Mischung dann eine Stunde lang bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation.

Zentrifugieren Sie die Proben bei dreitausend g für drei Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie die Überstände vorsichtig, ohne die Kügelchen zu stören, und geben Sie sie in neue Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zu jeder Probe fügen Sie fünf Mikroliter rb-Primärantikörper und 40 Mikroliter 50 Prozent Protein-Ag-Sephyroslurry hinzu und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation.

Waschen Sie die Kügelchen nach dem Zentrifugieren mit einem Milliliter des Rifa-Puffers. Mischen Sie die Röhrchen durch Rotation bei vier Grad Celsius 15 Minuten lang gut. Dann werden die Kügelchen wie bisher durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit gesammelt und die Überstände verworfen.

Nachdem Sie die Wäsche viermal durchgeführt haben, resuspendieren Sie die Kügelchen in 30 Mikrolitern eines x Natriumdodecalsulfat-Polyachrylymid-Gelelektrophorese-Ladepuffers und mischen Sie es gut. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 100 Grad Celsius in einem Heizblock für 10 Minuten. Zentrifugieren Sie die Proben eine Minute lang bei 12 Tausend g, um die Kügelchen zu pelletieren.

Zum Schluss sammeln Sie die Überstände vorsichtig, ohne die Kügelchen zu stören, und geben sie in ein Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie die Zellkulturtransfektion und Zelllyse von HEK293-Zellen durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Waschen Sie dann für jede Probe 25 Mikroliter 50 Prozent Nickel-Nigrotriessigsäure-Agoros-Kügelchen mit Ripa-Puffer in einem Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Sammeln Sie die Kügelchen durch Zentrifugation bei dreitausend g für drei Minuten bei vier Grad Celsius. Geben Sie zu jeder Probe ein molares Emytozol, um eine Endkonzentration von 10 Millimolar zu erhalten. Geben Sie dann jede Probe in das Röhrchen mit den vorbereiteten Agoros-Kügelchen.

Inkubieren Sie die Kügelchen und die Lysate zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation. Dann die Kügelchen drei Minuten lang bei vier Grad Celsius mit dreitausend g drehen. Nach dem Zentrifugieren die Überstände vorsichtig durch Verpipetten entfernen.

Um Perlenverlust zu vermeiden, saugen Sie die Perlen nicht trocken an. Waschen Sie anschließend die Kügelchen mit einem Milliliter Waschpuffer mit 20 Millimolar Emytozol. Mischen Sie die Röhrchen durch Rotation bei vier Grad Celsius 15 Minuten lang gut, bevor Sie die Kügelchen durch Schleudern auffangen.

Nach dem letzten Waschen 30 Mikroliter des Eleusian-Puffers mit 250 millimolarem Emitozol zu jeder Probe hinzufügen und zum Mischen schnippen. Dann inkubieren Sie die Proben 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius, um die Proteine zu eluieren. Mischen Sie jede Probe mit sechs x SDS-Seitenladepuffern.

Anschließend werden die Röhrchen bei 100 Grad Celsius in einem Heizblock 10 Minuten lang inkubiert. Laden Sie nach der Zentrifugation die Immunpräzipitations- oder Pulldown-Proben auf SDS-Seitengele mit einem Gradienten von vier bis 20 Prozent. Führen Sie eine Elektrophorese bei 120 Volt für 90 Minuten durch, um die Proteine zu trennen.

Nach der Zellzyklussynchronisation und Immunpräzipitation der endogenen rb-Spezies wurde das Vorhandensein des SUMO-Signals spezifisch durch einen anti-SUMO-1-Antikörper in der frühen G1-Phase nachgewiesen. Repräsentative Ergebnisse zeigen die forcierte SUMOylierung des rb-Proteins durch direkte Fusion des SUMO E2-Enzyms UBC9 mit seinem C-Terminal. Beachten Sie das am langsamsten migrierende SUMOylierte rb-Protein.

Durch die Verwendung der SUMO-defizienten Mutante von rb, K720R, wird das Vorhandensein von rb SUMOylierung in Zellen weiter bestätigt. Bei diesem Verfahren können also viele weitere SUMO-Zielproteine in kultivierten Zellen analysiert werden. In den meisten Fällen ist nur ein sehr kleiner Teil eines Substrats SUMOyliert, daher ist es wichtig, bei diesem Verfahren die Effizienz der Immunpräzipitation zu optimieren.