Stereologischen Schätzung der dopaminergen Neuron Nummer in der Maus Substantia Nigra mit dem optischen Plasmafraktionierer und Standard-Mikroskopie-Ausrüstung
1. September 2017
Dieses Werk stellt eine schrittweise Protokoll für die unparteiischen stereologischen Schätzung der dopaminergen neuronalen Zellzahlen in der Maus Substantia Nigra mit standard-Mikroskopie-Ausrüstung (z. B. einem Lichtmikroskop eine motorisierte Objekttabelle (X, y, z Flugzeug) und Public Domain-Software für die digitale Bildanalyse.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die designbasierte stereologische Schätzung der dopaminergen Zellzahl in der Maus-SN mit Hilfe von Standardmikroskopiegeräten zu beschreiben. Diese Methode ist nützlich, um die Anzahl dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra der Maus für die präklinische Parkinson-Forschung unter Verwendung der designbasierten, unverzerrten Stereoforschung zu schätzen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie mit Standard-Mikroskopiegeräten durchgeführt werden kann, ohne dass ein kommerziell erhältliches vollständiges Stereologie-Setup erforderlich ist.
Das Verfahren wird von Louisa Friez, einer Technikerin aus meinem Labor, vorgeführt. Beginnen Sie damit, ein mit Paraformaldehyd fixiertes Mausgehirn in eine Gehirnmatrix zu platzieren und einen Schnitt plus 0,74 Millimeter aus Bregma zu machen. Übertragen Sie den kaudalen Teil des Gehirns einschließlich des SN in 4%PFA in 0,1 molaren und fixieren Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius.
Tauschen Sie am nächsten Tag das PFA gegen 30%ige Saccharose in 0,1 molaren PBS aus und inkubieren Sie weitere zwei Tage bei vier Grad Celsius, um die Probe zu kryoschützen. Nach zwei Tagen, wenn das Gehirn in der Saccharose versunken ist, legen Sie das Gewebe in einen Kryomold, der mit der optimalen Schnitttemperatur gefüllt ist, und frieren Sie das Gewebe langsam in flüssigem, mit Trockeneis gekühltem Isopentane ein. Verwenden Sie einen Kryostaten, um 30-Mikrometer-Kryoschnitte in der Koronalebene seriell zu schneiden.
Markieren Sie die rechte Hemisphäre, indem Sie ein kleines Loch in die obere Region des Hirnstamms stechen. Sammeln Sie vier Reihen von Schnitten, die bei minus 2,46 Millimetern aus Bregma beginnen und bei 4,04 Millimetern aus Bregma enden. Jede Serie von Abschnitten wird in ein mit Kryoprotektor gefülltes Röhrchen umgefüllt und bei minus 20 Grad Celsius gelagert.
Erfassen Sie digitale Bilder von immunhistochemisch gefärbten SN-Schnitten mit Tyrosinhydroxylase-Stämmen mit einer Bildgebungssoftware, die mit einem Mikroskop gekoppelt ist. Beginnen Sie mit der Bestimmung der tatsächlichen Halterung und Dicke der Profile an drei zufällig ausgewählten Zählstellen pro Abschnitt. Klicken Sie zunächst auf oberen Versatz der Ansicht, um den oberen Teil des Abschnitts zu definieren.
Klicken Sie dann auf Stop View Top. Klicken Sie danach auf View Bottom Offset und dann auf Stop View Bottom. Notieren Sie sich die Dicke des Abschnitts.
Berechnen Sie die Schutzzone, indem Sie drei Mikrometer vom oberen Versatz abziehen und das Ergebnis in das obere Versatzfeld eingeben. Subtrahieren Sie dann die Höhe des optischen Dissektors von 13 Mikrometern von der oberen Offset-Zahl und geben Sie das Ergebnis in das untere Offset-Feld ein. Wählen Sie die folgenden Parameter aus, Schritt 14, Größe 1,00.
Wählen Sie das Verzeichnis aus, in dem die Datei gespeichert werden soll. Klicken Sie auf Sequenz, um die Erfassung zu starten. Nachdem die Bilder aufgenommen wurden, klicken Sie auf Verarbeitung und wählen Sie die folgenden Parameter aus, alle Ebenen aus Sequenz, Montage und die Schnell- und Stitching-Boxen mit einer Bildüberlappung von 10%Starten Sie das Zusammenfügen der Bilder mit einem Klick auf Start.
Dadurch werden Stapelbilder für die Analyse generiert. Um zu beginnen, öffnen Sie das Bild, indem Sie auf Datei klicken und öffnen. Legen Sie den Bildmaßstab mit dem Befehl Analysieren und Maßstab festlegen fest.
Ändern Sie in diesem Schritt die definierte Größe von Pixel in Mikrometer. Wählen Sie die Plugins aus, dann das Raster und dann den Befehl Rastertyp, um ein Raster nach dem Zufallsprinzip einzufügen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für den zufälligen Versatz.
Definieren Sie die Größe eines Quadrats innerhalb des Rasters als 130 Mikrometer x 130 Mikrometer, um 16.900 Quadratmikrometer zu entsprechen. Ändern Sie den Bildtyp von 16-Bit auf RGB-Farbe, indem Sie auf Bild klicken und dann RGB-Farbe eingeben. Lokalisieren Sie die substantia nigra pars compacta.
Umkreisen Sie den Bereich mit dem Pinsel mit einer Pinselbreite von 11. Machen Sie den Befehl zum Festlegen des Maßstabs rückgängig, indem Sie auf Analysieren und dann auf Maßstab festlegen klicken und dann auf klicken, um den Maßstab zu entfernen, um in Pixeln statt in Mikrometern zu berechnen. Machen Sie einen Screenshot, speichern Sie die Bilddatei und öffnen Sie die neue Datei mit ImageJ.
Wählen Sie den Pinsel und eine Pinselbreite von 25 aus. Markieren Sie jedes Gitterquadrat, das mit dem SN in Kontakt kommt, um einen optischen Dissektor zu platzieren. Wählen Sie ein Rasterquadrat aus, das Teile des SN enthält. Messen Sie die obere linke Ecke des Quadrats mit dem Cursor in ImageJ, um die x- und y-Startkoordinaten zu definieren.
Wählen Sie die Tabellenkalkulationsvorlage mit dem Titel "Position des optischen Dissektors" aus und berechnen Sie die Position des optischen Dissektors. Schätzen Sie dann die Zellzahl anhand der Tabelle zur Berechnung der Zellzahl, wie im schriftlichen Teil des Protokolls beschrieben. Dieses Low-Power-Bild zeigt einen Schnitt des Gehirns von Mäusen nach TH-Färbung auf dopaminerge Neuronen.
Eine höhere Vergrößerung zeigt TH-positive dopaminerge Neuronen. Der Einschub zeigt den umrahmten Bereich bei erhöhter Vergrößerung. Dieses Bild zeigt eine Serie von TH-gefärbten SN-Schnitten, die das gesamte Maus-SN von rostral bis kaudal abdecken.
Jeder Abschnitt ist 120 Mikrometer von dem nachfolgenden Abschnitt getrennt. Die Anzahl der TH-positiven Neuronen in der rechten und linken Maus-SN wurde mit der in diesem Video gezeigten Methode und unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Stereologiesystems geschätzt. Wie hier zu sehen ist, führten beide Methoden zu vergleichbaren Zellzahlen und es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Datensätzen.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von persönlicher Schutzausrüstung wie Schutzhandschuhen getroffen werden sollten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine unvoreingenommene stereologische Schätzung der dopaminergen Neuronenzahl in der Substantia nigra der Maus mit der optischen Fraktionsmethode und Standardmikroskopiegeräten durchführen können.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur unvoreingenommenen stereologischen Schätzung der Anzahl dopaminerger Neurone im Substantia-nigra-Gebiet der Maus unter Verwendung standardmäßiger Mikroskopie-Tools. Die Methode zielt darauf ab, die präklinische Forschung bei Morbus Parkinson zu unterstützen, indem sie einen zuverlässigen Ansatz für die Zellquantifizierung ohne Notwendigkeit spezialisierter stereologischer Systeme bereitstellt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Forschung zur Parkinson-Krankheit
Hintergrund
- Dopaminerge Neurone sind für die motorische Kontrolle von entscheidender Bedeutung.
- Die Substantia nigra ist ein zentraler Bereich, der bei der Parkinson-Krankheit betroffen ist.
- Die unvoreingenommene Stereologie bietet eine robuste quantitative Methode.
- Herkömmliche Mikroskopieausrüstung macht die Technik zugänglich.
Zweck der Studie
- Etablierung eines Schritt-für-Schritt-Protokolls zur neuronalen Quantifizierung.
- Anwendung der designbasierten, unverzerrten Stereologie in lebenden Mausmodellen.
- Ermöglichung präklinischer Studien zur Untersuchung des Verlusts dopaminergener Neuronen.
Verwendete Methoden
- Standardmikroskopie einschließlich Lichtmikroskopie und Software zur digitalen Bildanalyse.
- Substantia nigra der Maus als biologisches Modell.
- Ausführliche Fixierung, Kryoschutzbehandlung und Schnittpräparation von Maushirngewebe.
- Digitalisierung und spezifische immunhistochemische Methoden.
- Sorgfältige Messungen und Berechnungen zur Bestimmung der Neuronenzahlen.
Hauptergebnisse
- Nachgewiesene genaue Schätzung dopaminerger Neuronen im SN.
- Sowohl Standard- als auch fortgeschrittene Methoden ergaben vergleichbare Neuronenzahlen.
- Wichtiger Hinweis auf die Methodenzuverlässigkeit unter Verwendung standardmäßiger Werkzeuge.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie stellt einen machbaren Ansatz zur Quantifizierung neuronaler Populationen in der Forschung vor.
- Sie vertieft das Verständnis des neuronalen Verlusts bei der Parkinson-Krankheit.
- Verwendet leicht verfügbare Werkzeuge, was eine breitere Anwendung in neurowissenschaftlichen Studien fördert.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Eine genaue Quantifizierung des dopaminergen Neuronenverlusts in der Substantia nigra ist ein entscheidender Endpunkt in der präklinischen Forschung zu Parkinson, der direkt die Zielvalidierung und die mechanistische Ent-Risikobewertung neuroprotektiver Strategien beeinflusst. Dieses Protokoll ermöglicht eine zuverlässige, unvoreingenommene stereologische Schätzung unter Verwendung gängiger Mikroskopieausrüstung, wodurch die Abhängigkeit von spezialisierten Stereologiesystemen verringert und die Zugänglichkeit für Entdeckungsbiologie-Arbeitsabläufe verbessert wird. Durch die Bereitstellung quantitativer, reproduzierbarer Zellzählungen unterstützt die Methode die Vorhersagesicherheit bei der Hypothesenprüfung in frühen Stadien und bei Entscheidungen zur Portfolio-Priorisierung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch eine unvoreingenommene Quantifizierung des Überlebens dopaminerger Neuronen in präklinischen Modellen der Parkinson-Krankheit.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch eine designbasierte Stereologie, die Beobachterbias und technische Variabilität in Target-Engagement-Studien minimiert.
- Prädiktiver Wert: Erzeugt quantitative Daten zur Neuronenzahl, die bei der Bewertung der Wirksamkeit einer Target-Modulation sowie bei der Entscheidungsfindung zwischen Fortführung oder Abbruch in der frühen Entdeckungsphase helfen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, quantitative histologische Ergebnisse, die zur Validierung von Screening-Hits geeignet sind, die darauf abzielen, die Integrität dopaminerger Neurone zu bewahren.
- Reproduzierbarkeit: Liefert konsistente Zellzählungen über Schnitte und Tiere hinweg und unterstützt die Standardisierung des Assays für die nachgeschaltete Evaluierung von Substanzen.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit gängiger Mikroskopie- und Bildanalyse-Software, wodurch eine breitere Anwendung über verschiedene Entdeckungsplattformen hinweg ohne spezielle Hardware ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Modelliert direkt den Verlust dopaminerger Neuronen im Substantia nigra, ein zentrales pathologisches Merkmal der Parkinson-Krankheit, und erhöht dadurch die translative Validität.
- Präklinische Kontinuität: Schafft eine quantitative Brücke von der Entdeckungsphase zur präklinischen Validierung, indem vergleichbare Daten wie kommerzielle Stereologie-Systeme bereitgestellt werden.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht objektive, datengestützte Entscheidungen über die Weiterentwicklung von Wirkstoffen basierend auf statistisch robusten Metriken zum neuronalen Überleben.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Testung von Zielhypothesen über die Identifizierung von Leitsubstanzen bis hin zur Beurteilung der präklinischen Wirksamkeit ein und bietet einen quantitativen histologischen Endpunkt, der zum mechanistischen Verständnis und zur Zielvalidierung beiträgt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem dopaminerge Neuronenpopulationen als funktioneller Endpunkt der Signalwegmodulation in präklinischen Modellen quantifiziert werden.
- Screening: Erzeugt reproduzierbare, quantitative, bildbasierte Ergebnisse, die einen zuverlässigen Vergleich der Wirkstoffeffekte auf das neuronale Überleben ermöglichen.
- Analytik: Liefert numerische Zellzahldaten und statistische Vergleichbarkeit zwischen experimentellen Gruppen und erleichtert datenbasierte Bedingungsvergleiche.
- Translationale Forschung: Orientiert sich an der Pathologie der Parkinson-Krankheit, indem Neuronenverlust in einer krankheitsspezifischen Hirnregion gemessen wird, und unterstützt so die biomarkerbasierte präklinische Validierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen standardisierten und zugänglichen Stereologie-Workflow, der über mehrere neurowissenschaftliche Entdeckungsprogramme hinweg angewendet werden kann, ohne aufwendige Geräte erfordern zu.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Uneindeutigkeiten durch eine unvoreingenommene, designbasierte stereologische Quantifizierung verringert werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung zwischen verschiedenen Laboren durch die Nutzung weit verbreiteter Mikroskopie- und Bildanalysewerkzeuge.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem der Bedarf an spezialisierten Stereologie-Systemen entfällt, während gleichzeitig die Datenvergleichbarkeit mit kommerziellen Plattformen erhalten bleibt.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung präklinischer Kandidaten basierend auf quantitativen, histologisch validierten Daten zur Erhaltung dopaminerger Neuronen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Histologie, Immunhistochemie und stereologischen Prinzipien für die korrekte Gewebepräparation und Gebietsidentifizierung.
- Benötigt motorisierte Mikroskopieausrüstung mit z-Achsen-Steuerung und Software zur Bildnaht für die systematische Schnittanalyse.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei Färbeprotokollen, Schnittdicke und Zählregeln voraus, um die Reproduzierbarkeit an verschiedenen Standorten sicherzustellen.
- Die Anpassung an andere Hirnregionen oder Neuronentypen kann Anpassungen der Färbeparameter, des Rasterabstands und der Dimensionen des optischen Dissektors erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Abhängigkeit von der Schnittqualität sowie die Notwendigkeit einer sorgfältigen Schulung, um die Genauigkeit der Zählung aufrechtzuerhalten und Stichprobenverzerrungen zu vermeiden.
Biopharma FAQs
- Wissenschaftlicher Wert: Die Wiederholung an mehreren Schnitten und Tieren berücksichtigt biologische und technische Variabilität und erhöht das Vertrauen, dass beobachtete Neuronenzahlen echten experimentellen Effekten statt Stichprobenartefakten entsprechen.
- Operativer Wert: Konsistente Probennahmeprotokolle verringern die Variabilität zwischen Bedienern und unterstützen die Standardisierung zwischen Laboren, was für multizentrische Entdeckungsprojekte unerlässlich ist.
