Name: Stereologischen Schätzung der dopaminergen Neuron Nummer in der Maus Substantia Nigra mit dem optischen Plasmafraktionierer und Standard-Mikroskopie-Ausrüstung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Lernen Sie die stereologische Schätzung dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra der Maus mit Standard-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht präklinische Parkinson-Forschung ohne spezialisierte Systeme.

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Die Autoren sind dankbar für Keali Röhm, Louisa Frieß und Heike Menzel für ihre kompetente technische Unterstützung; zu Helga Brünner für die Pflege der Tiere; und Chistopher S. Ward für die Erzeugung und Verteilung von optischen Disector Grid Plugin für die ImageJ-Software.

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</ol>

C. W. I. diente auf wissenschaftliche Boards für Merz Pharmaceuticals LLC und TEVA; wird finanziell für Reisen von Ipsen, Merz Pharmaceuticals LLC und Allergan, Inc.; und Lautsprecher Honorare von Merz, TEVA und Allergan, Inc. außerhalb der eingereichten Arbeit erhalten hat. J. V. diente als Berater für Boston Scientific, Medtronic und AbbVie und erhielt Honorare von Medtronic, Boston Scientific, AbbVie, Bial, Allergan und GlobalKinetics außerhalb der eingereichten Arbeiten.

Stereologie beginnt mit Gewebe Verarbeitung. Das serielle Schneiden von SN Gewebe muss sorgfältig durchgeführt werden, zur Verhinderung des Verlusts der Abschnitte während der stereologischen Analyse. Darüber hinaus ist ein wesentlicher Schritt, eine Hemisphäre zu kennzeichnen, um das Recht von links SN zu unterscheiden, bei der Durchführung der Stereologie. Platzieren ein kleines Loch am oberen Teil der Hirnstamm erzeugt die besten Ergebnisse in der vorgestellten Studie. Darüber hinaus schneiden da die Arbeit mit den An...

Die Quantifizierung der neuronalen Zellennummer ist von zentraler Bedeutung in der präklinischen Krankheit Parkinson Forschung zur Bestimmung der Höhe der Neurodegeneration in der Substantia Nigra (SN)1,2. Die unparteiische stereologischen Schätzung der Zellzahl in einer Region von Interesse gilt als der Goldstandard3,4,5.
Vor dem Aufkommen der unvoreingenommene Stereologie wurde die Anzahl der Neuronen in den Abschnitten bewertet, durch Manipulation der gezählten Zelle Profile für die Variable Wahrscheinlichkeiten zu korrigieren, dass Neuronen in Sicht in einem Abschnitt kommen. Eine der am häufigsten verwendeten Methoden wurde die Korrektur des quantifizierten Zellenzahlen von Abercrombie6beschrieben. Diese Methode versucht, zu berücksichtigen, dass die Zellen mehr als einmal quantifiziert werden können, wenn in benachbarten Dünnschliffe Fragmente der gleichen Zelle gefunden werden. Aus diesem Grund generiert Abercrombie und anderen Autoren Gleichungen, die Annahmen über die Form, Größe und Ausrichtung der gezählten Zellen7,8erforderlich. Diese Annahmen wurden jedoch in der Regel nicht realisiert und daher führte zu systematischen Fehlern und Abweichungen von der tatsächlichen Zellzahl (d. h. Bias). Darüber hinaus konnte die Vorspannung nicht durch zusätzliche Probenahme3reduziert werden.
Für die stereologischen Schätzung der Zelle Zahlen mit Hilfe der optischen Plasmafraktionierer sind mathematische Prinzipien angewandt, um direkt die Zellzahlen direkt in einem definierten, 3-dimensionale Volumen schätzen. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es nicht Annahmen über die Form, Größe und Ausrichtung der Zellen gezählt werden. So geschätzte Zellzahlen sind näher an die wahren Werte und näher als die Größe der Stichprobe (d.h., unvoreingenommene)3erhöht. Weil viele Regeln befolgt werden müssen, wenn Sie Stereologie verwenden, um die Methode neutral zu halten, Ready-to-Use kommerzielle Stereologie Systeme wurden entwickelt (Übersicht finden Sie unter Schmitz und Hof, 2005-4). Spezialisierte Stereologie Systeme implementieren Sie Design-basierte stereologischen Methoden mit a priori definiert Sonden und Stichprobenpläne für stereologischen Bewertungen, die zur Unabhängigkeit von Form, Größe, räumliche Verteilung und Ausrichtung der führen die Zellen zu analysierten4,9. Handelsübliche Stereologie Systeme sind jedoch teuer; Dies kann die Umsetzung in neue Forschung einschränken.
Das Ziel dieser Studie war es, eine brauchbare Technik für die Design-basierte stereologischen Schätzung der dopaminergen Zellzahlen in der Maus SN, beschäftigt die optische Plasmafraktionierer-Methode und mit standard-Mikroskopie Ausrüstung (z. B. Licht entwickeln Mikroskop, Mikroskop standard Software und einer motorisierten X, y, Z-Phase). Hierfür ist eine Anleitung, wie Sie Maus Hirngewebe zu verarbeiten und SN Zellzahlen mit Design-basierte unvoreingenommene Stereologie abzuschätzen vorgestellt. Darüber hinaus sind Vorlagen für die Berechnung der geschätzten Zellzahlen und Koeffizienten der Fehler (CE) zur Verfügung gestellt.
Die hier beschriebene Methode beschränkt sich nicht auf die Analyse der SN, aber für den Einsatz in anderen anatomisch definierten Regionen des Gehirns Maus oder Ratte angepasst werden kann. Zum Beispiel, wurde unvoreingenommene Stereologie zur neuronalen Zellzahlen in der Hippocampus-10 und den Locus Coeruleus11zu schätzen. Darüber hinaus können auch Zelltypen als Neuronen, wie Astrozyten12 und Mikroglia13, beurteilt werden. Diese Methode kann daher nützlich für Wissenschaftler, die unvoreingenommene Stereologie in ihrer Forschung durchführen wollen, aber nicht bereit sind, eine Menge Geld um ein Stereologie System zu kaufen.

<table><tbody><tr><td>Paxinos Mausatlas</td><td></td><td></td><td>Das Mausgehirn George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz</td></tr><tr><td>brain matrix slicer</td><td>mouse Zivic Instruments</td><td>BSMAS 001-1</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>saccharose /D(+) Saccharose</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Isopentan</td><td>Roth</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Merck</td><td>1040931000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>phosphatgepufferte Kochsalzlösung Inhaltsstoffe: </stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat</td><td>Merck</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumhydrogenphosphatdihydrat</td><td>Merck</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Merck</td><td>1049360500</td><td></td></tr><tr><td>normales Ziegenserum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ml</td><td>Waschmittel</td></tr><tr><td>3,3-Diaminbenzidin-tetrahydrochlorid/DAB Tabletten 10mg pH 7,0</td><td>Kem En Tec</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>H2O2/ Wasserstoffperoxid 30%</td><td>Merck</td><td>1072090250</td><td></td></tr><tr><td>Avidin/Biotin Reagenz</td><td>Thermo Scientific</td><td>32050</td><td>Standard Ultra Sensitive ABC Färbekit, 1:100</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti Maus Tyrosin Hydroxylase Antikörper</td><td>abcam</td><td>Ab112</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>biotinylierte Ziegen-Anti-Kaninchen IgG H+L</td><td>Vektor Laboratorien</td><td>BA-1000</td><td>1:100</td></tr><tr><td>StereoInvestigator Version 11.07</td><td>MBF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX53</td><td>Mikroskop Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td>Visitron Systems GmbH</td><td>3.3.0.2</td><td></td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>NIH</td><td>Version 4.7</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-TEK OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Trockeneisgitter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Overlay Plugin</td><td>Wayne Rasband</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</td></tr><tr><td>Zellzähler-Plugin</td><td>Kurt de Vos</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).&nbsp;</td></tr><tr><td>optischer Disektor Makro</td><td>Christopher Ward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6N männliche Mäuse</td><td>Charles River, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus beschichtete Objektträger</td><td>Langenbrinck, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G Nadel Mikrolanze 3</td><td>BD</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>REGLO Analoge Infusionspumpe</td><td>Ismatec</td><td>ISM 829</td><td></td></tr><tr><td>StereoInvestigator System</td><td></td><td></td><td>StereoInvestigator Version 11.07</td></tr><tr><td>BX53 Mikroskop</td><td></td><td></td><td>BX53 Mikroskop</td></tr><tr><td>selbstsortierte Stereologie</td><td></td><td></td><td>Visiview</td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td></td><td></td><td>Axiophot2</td></tr></tbody></table>

stereologischen schätzung der dopaminergen neuron nummer in der maus substantia nigra mit dem optischen plasmafraktionierer und standard-mikroskopie-ausrüstung

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

In präklinischen Krankheit Parkinson Forschung unbedingt Analyse des Nigrostriatal Trakt, einschließlich Quantifizierung der dopaminergen Neuronenverlust in der Substantia Nigra. Um die gesamte dopaminergen Neuron Anzahl abschätzen zu können, gilt unvoreingenommene Stereologie mit der optischen Plasmafraktionierer-Methode heute der Goldstandard. Da die Theorie hinter der optischen Plasmafraktionierer Methode Komplex ist und Stereologie schwierig ist, ohne spezielle Ausrüstung zu erreichen, sind mehrere handelsübliche komplette Stereologie-Systeme, die die notwendige Software enthalten, rein vorhanden für Zelle zählen Gründe. Da Kauf eine spezialisierte Stereologie Setup nicht immer möglich, aus vielen Gründen ist, dieser Bericht beschreibt eine Methode für die stereologischen Schätzung der dopaminergen neuronale Zelle mit standard-Mikroskopie zählt, einschließlich einem Lichtmikroskop eine motorisierte Objekttabelle (X, y, Z-Ebene) mit imaging-Software und einem Computer für Analyse. Eine schrittweise Erklärung wird zum stereologischen Quantifizierung der optischen Plasmafraktionierer Methode durchführen, und vorprogrammierte Dateien für die Berechnung der geschätzten Zellzahlen werden zur Verfügung gestellt. Um die Genauigkeit dieser Methode zu bewerten, wurde ein Vergleich mit Daten aus einem handelsüblichen Stereologie Apparat durchgeführt. Vergleichbare Zellzahlen wurden durch dieses Protokoll und dem Stereologie Gerät, so zeigen die Präzision dieses Protokolls für unvoreingenommene Stereologie gefunden.

Die vorgestellte Methode, die geschätzte Anzahl der TH + dopaminergen Neuronen in der rechten Ecke SN lag zwischen 7.363 und 7.987 Zellen und in der linken SN, verwenden zwischen 7.446 und 7.904 Zellen. So war die durchschnittliche Anzahl von dopaminergen Neuronen (± SEM) 7.647 ± 83 Zellen für die Rechte SN und 7.675 ± 66 für die linke SN. Die berechneten CE für jedes Tier war niedriger als 0,08 (Bereich: 0.0.73.-0.079) (Abbildung 7). Um die Vergleichbarkeit ...

Dieses Werk stellt eine schrittweise Protokoll für die unparteiischen stereologischen Schätzung der dopaminergen neuronalen Zellzahlen in der Maus Substantia Nigra mit standard-Mikroskopie-Ausrüstung (z. B. einem Lichtmikroskop eine motorisierte Objekttabelle (X, y, z Flugzeug) und Public Domain-Software für die digitale Bildanalyse.

Stereologischen Schätzung der dopaminergen Neuron Nummer in der Maus Substantia Nigra mit dem optischen Plasmafraktionierer und Standard-Mikroskopie-Ausrüstung

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die stereologische, designbasierte Schätzung der Anzahl dopaminergener Zellen im murinen SN unter Verwendung standardmäßiger Mikroskopie-Ausrüstung zu beschreiben. Diese Methode eignet sich zur Abschätzung der Anzahl dopaminergener Neuronen im murinen Substantia-nigra-Komplex für präklinische Forschung zum Parkinson-Syndrom mithilfe der designbasierten, unverzerrten Stereologie. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie mit Standardmikroskopen durchführbar ist und keiner kommerziell erhältlichen, vollständigen Stereologie-Ausstattung bedarf.Die Durchführung des Verfahrens übernimmt Louisa Friez, eine Technikerin aus meinem Labor. Beginnen Sie damit, ein mit Paraformaldehyd fixiertes Maushirn in eine Gehirnmatrix einzulegen und einen Schnitt plus 0,74 Millimeter von Bregma entfernt durchzuführen. Überführen Sie den kaudalen Teil des Gehirns, einschließlich der Substantia nigra (SN), in 4 % PFA in 0,1 molarer Lösung und fixieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius.Am nächsten Tag das PFA durch 30 % Saccharose in 0,1 molarer PBS ersetzen und die Probe weitere zwei Tage bei vier Grad Celsius inkubieren, um die Probe k

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Neurowissenschaften

Dopamin wird deutlich im Mittelhirn Kerne, die den Zellkörper und Dendriten der Dopamin-Neuronen enthalten geregelt. Hier beschreiben wir eine Dissektion und Probe-Handling-Ansatz, um Ergebnisse zu maximieren, und damit Schlussfolgerungen und Erkenntnisse, auf die Dopamin-Regulierung im Mittelhirn Kerne der Substantia nigra (SN) und ventralen Tegmentum (VTA) bei Nagern.

Umfassende Profilierung der Verordnung Dopamin in der Substantia nigra und ventralen Tegmentum

Dieses Video zeigt den Prozess der Quantifizierung der Alpha-Synuclein-Akkumulation in embryonalen Dopamin-Neuronen der Maus, die mit alpha-Synuclein-vorgeformten Fibrillen vorbehandelt wurden. Es werden die Schritte zur Fixierung, Färbung und Quantifizierung der Dopamin-Neuronen, die Alpha-Synuclein-Aggregate enthalten, mittels Immunfluoreszenz beschrieben.

Untersuchung der Alpha-Synuclein-Akkumulation in primären embryonalen Dopamin-Neuronen der Maus

Quelle: Olesen, M. V., et al. Die optische Fraktionatortechnik zur Schätzung der Zellzahl in einem Rattenmodell der Elektrokrampftherapie. J. vis. exp. (2017).  Das Video demonstriert die Technik zur Quantifizierung neu gebildeter Neuronen im Hirngewebe. Hippocampus-Gewebeschnitte, die Bromodeoxyuridin (BrdU)-markierte Neuronen enthielten, wurden mittels Immunhistochemie gefärbt und anschließend mit der optischen Fraktionatortechnik über die Gewebedicke quantifiziert.

Quantifizierung neu erzeugter Neuronen im Hirngewebe von Ratten mit der optischen Fraktionatortechnik

Dieses Protokoll beschreibt zwei verschiedene Umweltmanipulationen und ein gleichzeitiges Gehirninfusionsprotokoll, um umweltinduzierte Gehirnveränderungen zu untersuchen, die dem adaptiven Verhalten und der Gehirnreparatur bei erwachsenen Mäusen zugrunde liegen.

Umwelt Modulationen der Anzahl der Mittelhirn Dopamin-Neuronen in erwachsenen Mäusen

Bei der Parkinson-Krankheit (PD), Substantia Nigra (SNC) dopaminergen Neuronen degenerieren, was zu Motorstörungen. Hier berichten wir über ein Protokoll zur Kultivierung von ventralen Mittelhirns Neuronen aus einer Maus eGFP durch eine Tyrosinhydroxylase (TH) Promotorsequenz angetrieben exprimieren, Ernten einzelnen fluoreszierenden Neuronen aus den Kulturen, und die Messung ihrer Transkriptom RNA-seq verwenden.

Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression

Hier stellen wir eine stereologische Methode vor, die optische Fraktionierung, die zur Quantifizierung der Bildung neuer Neuronen und ihres Überlebens im Rattenhippocampus nach der elektrokonvulsiven Stimulation verwendet wird. Bei korrekter Umsetzung gewährleistet die Empfindlichkeit und Effizienz von stereologischen Methoden genaue Schätzungen mit einer festen und vorgegebenen Präzision.

Die optische Fraktionator-Technik zur Schätzung der Zellzahlen in einem Rattenmodell der elektrokonvulsiven Therapie

Identifikation der Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor in dem Nucleus Accumbens ist von entscheidender Bedeutung für die Klärung von D1-Rezeptor Dysfunktion während eine Erkrankung des zentralen Nervensystems. Wir haben einen neuartigen RNA in Situ Hybridisierung-Assay um einzelne RNA-Moleküle in einem bestimmten Hirnareal zu visualisieren.

Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie

Hier beschreiben wir einen quantitativen Ansatz zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein im Verhältnis zu einer Marker Protein mit Immunfluoreszenz-Färbung, konfokalen Mikroskopie und Computer-basierte Analyse.

Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

Die neuronale Faserlänge innerhalb einer dreidimensionalen Struktur einer Hirnregion ist ein zuverlässiger Parameter, um spezifische neuronale strukturelle Integrität oder Degeneration zu quantifizieren. Dieser Artikel beschreibt eine stereologische Quantifizierungsmethode zur Messung der cholinergen Faserlänge innerhalb des Kernbasalis von Meynert bei Mäusen als Beispiel.

Stereologische Abschätzung der cholinergen Faserlänge im Nukleus Basalis von Meynert des Maushirns

Hier, Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur Untersuchung der neuronalen Synuclein-Akkumulation in primären Maus-Dopamin-Neuronen. Phosphorylierte-Synuclein-Aggregate in Neuronen werden mit vorgebildeten ,-Synuclein-Fibrillen induziert. Die automatisierte Bildgebung von immunfluorest markierten Zellen und die unvoreingenommene Bildanalyse machen dieses robuste Protokoll für das Screening von Medikamenten mit mittlerem bis hohem Durchsatz geeignet, die die Akkumulation von Synuclein...

Studium der vorgeformten Fibril-induzierten Synuclein-Akkumulation in primären embryonalen Maus-Midbrain-Neuronen

Hier stellen wir eine automatisierte Methode zur semi-quantitativen Bestimmung der dopaminergen Neuronenzahl in der Rattensubantia nigra pars compacta vor.

Semi-quantitative Bestimmung der dopaminergen Neuronendichte in der Substantia Nigra von Nagetiermodellen mittels automatisierter Bildanalyse

Lernen Sie die stereologische Schätzung dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra der Maus mit Standard-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht präklinische Parkinson-Forschung ohne spezialisierte Systeme.

Stereologischen Schätzung der dopaminergen Neuron Nummer in der Maus Substantia Nigra mit dem optischen Plasmafraktionierer und Standard-Mikroskopie-Ausrüstung (Video) | JoVE Journal

Stereologischen Schätzung der dopaminergen Neuron Nummer in der Maus Substantia Nigra mit dem optischen Plasmafraktionierer und Standard-Mikroskopie-Ausrüstung

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