Name: Zählen Proteine in einzelne Zellen mit adressierbaren Tröpfchen Microarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Erfahren Sie die Quantifizierung von Proteinen in einzelnen Zellen mit adressierbaren Tröpfchen-Microarrays. Diese Methode ermöglicht die Bestimmung absoluter Protein-Kopienzahlen und erfasst die Heterogenität von Zellpopulationen.

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ASR geplante Experimente, Protokolle entwickelt und analysiert Daten. SC und PS durchgeführt Zelle Größe Experimente. ASR und OC schrieb das Manuskript. Die Autoren möchten die Unterstützung von Prof. David R. Klug dankbar anerkennen, für den Zugriff auf Geräte. Die Autoren danken der Imperial College Advanced Hackspace für den Zugriff auf Fertigung und Prototyping Anlagen.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Adressierbare Tröpfchen Microarrays sind eine sensible und erweiterbare Methode für quantitativ bestimmen die absolute Kopienzahl des Proteins innerhalb einer einzelnen Zelle.
Begrenzung der Höhe der unspezifischen Bindung ist (NSB) im Rahmen des Protokolls zur Erreichung möglichst geringen maximal Erkennung wie möglich. Proteine und andere biochemische Arten können unspezifisch binden an eine Reihe von Schnittstellen in die Tröpfchen-Deckglas Oberfläche, der Antikörper vor Ort und der Öl/Wass...

Das Ziel dieser Methode ist die Variation in Hülle und Fülle an ein Zielprotein in einer Zellpopulation mit einzelligen Auflösung bestimmen. Einzelne Zelle Analyse liefert eine Reihe von Vorteilen, die nicht mit traditionellen Ensemble biochemischen Methoden zur Verfügung stehen. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 Erstens kann arbeiten auf der Ebene der einzelnen Zelle die reiche Heterogenität einer Zellpopulation, die sonst durch die Mittelwertbildung verloren gehen würde zu erfassen, die mit traditionellen Ensemble biochemischen Techniken auftritt. Die meisten Arbeitspferd biochemischen Methoden arbeiten mit der Masse erfordern, wie sie oft tun, Millionen von Zellen, um ein Ergebnis zu erzielen. Natürlich die Folgen ganze Zellpopulationen zu bewerten hängt eine Reihe von Faktoren, beispielsweise die Heterogenität in Protein-Expression, wo einige wichtigen Funktionen des Vertriebs von Protein Fülle ausgelassen werden können. Aus praktischer Sicht die Empfindlichkeit der einzelnen Zelle Techniken erforderlich machen sie in der Lage, arbeiten mit Mengen von biologischem Material, das für noch empfindlicheren Bulk-Techniken funktionieren nicht ausreicht. Ein wichtiges Beispiel hierfür ist das Studium der seltene Zelltypen wie zirkulierende Tumorzellen (CTC) wo auch für Patienten mit einer schlechten prognostischen Aussichten ziehen weniger als 10 CTCs in einem einzigen 7,5 mL Blut vorhanden sein könnte. 6 hier präsentieren wir Ihnen die Methodik erforderlich, um einzelne Zelle Protein Messungen mit einem reduzierten Volumen Antikörpern basierende Assays mit Öl-capped Tröpfchen auf ein Antikörper Microarray gedruckt.
Mikrofluidische Tröpfchen Plattformen sind hohen Durchsatz in der Lage, Tausende von Tröpfchen pro Sekunde und in der Lage zu isolieren, und sogar züchten, einzelner Zellen in einzelne Tröpfchen eine Vielzahl von biochemischen Tests durchführen zu erzeugen. Tröpfchen-basierte Techniken eignen sich gut für einzelne Zellanalyse,7,8,9 mit den letzten Beispiele einschließlich DropSeq10 und InDrop11, die stark durch die Kraft des unterstützt worden Verstärkung-Techniken. Die begrenzte Menge an Material und keine Methoden der Verstärkung für Proteine machen einzelne Zelle Proteomics besonders herausfordernd.
Tröpfchen können durch eine Reihe von Methoden analysiert werden und Fluoreszenz-Mikroskopie ist weit verbreitet. Einzelmolekül-Techniken wie Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) können fluoreszierende Moleküle mit unvergleichlicher Signal-Rausch-Verhältnis visualisiert werden. 12 aufgrund der exponentiellen Zerfall der evaneszenten Feldes sind nur Fluorophore in hohen Nähe an die Oberfläche (Reihenfolge der 100nm) begeistert machen TIRF eine gute Strategie bei der Aufdeckung von kleinen Mengen eines Zielmoleküls in einer komplexen Mischung. Die optische Stationspunkte Eigenfestigkeit des TIRF hilft auch waschen Schritte zu vermeiden und Grenzen bestimmen Dauer und Komplexität. Jedoch, TIRF erfordert planare Flächen und Beispiele für TIRF-Mikroskopie auf Tropfen im Fluss angewendet beinhalten die Bildung einer planaren Fläche davon zu Bild. 13 zu diesem Zweck design-Einzelzelle Proteomic Techniken oft mikrofluidischen Chips Oberfläche immobilisiert Capture-Agenten in einem Microarray-Format. 4 , 14
Die Tröpfchen, selbst können in Arrays auf planaren Flächen, sogenannte Tröpfchen Microarrays ausgebildet sein. 15 , 16 , 17 räumlich organisieren Tröpfchen in Arrays ermöglicht es ihnen, bequem indiziert, leicht im Laufe der Zeit überwacht, individuell angesprochen und bei Bedarf abgerufen. Droplet Microarrays erreichen eine hohe Dichte von Mikroreaktoren mit Tausenden von Elementen pro Chip sind freistehend oder von Microwell Strukturen unterstützt. 18 , 19 , 20 sie können gebildet werden durch sequentielle Abscheidung von liquid Handling-Roboter, Inkjet-Spotter, wenden Sie sich an Microarrayers21,22,23,24,25, 26 , oder sie können selbst-zusammenbauen auf Oberflächen wie Superhydrophillic Flecken gemustert auf einer superhydrophob Oberfläche. 27 , 28 , 29
Mit diesen Überlegungen im Auge wurden adressierbare Tröpfchen Microarrays (ADMs) entwickelt, um die Vielseitigkeit, räumliche Adressierbarkeit und reduzierten Volumina von Tröpfchen Microarrays quantitativ mit der Empfindlichkeit der Einzelmolekül-TIRF-Mikroskopie zu kombinieren Protein-Fülle zu messen. 5 ADMs ermöglichen Einzelzelle Analyse bildet ein Tröpfchen Microarray mit einzelnen Zellen über einen Antikörper Microarray, die dann mit Öl, um Verdunstung zu verhindern begrenzt ist. Die Bände der Tröpfchen sind diskrete Probenverlust, zu verhindern, die sonst durch Ventile auf dem Chip im kontinuierlichen Fluss Mikrofluidik erreicht werden würde. 30 die absolute Menge an Zielprotein aus einer einzigen Zelle ist äußerst gering; Allerdings ermöglicht das geringere Volumen der Tröpfchen für relativ hohe lokale Konzentration, so dass sie erkannt werden, mit einem Sandwich-Antikörper-Assay - Antikörper immobilisiert ist, in eine eigenständige Region oder vor Ort, auf eine Oberfläche, die Protein fängt die wiederum bindet um ein eindringmittel gekennzeichneten detektionsantikörper in Tröpfchen Volumen vorhanden. Als markierungsfreie Ansatz (d.h. Protein Ziele müssen nicht direkt gekennzeichnet werden), ADM-Dateien sind generell für die Analyse von Zellen aus Primärquellen, wie z. B. verarbeitete Blut, gut brauchen Aspiraten und dissoziierten Tumor Biopsien sowie Zellen von Kultur und Ihre Lysaten.
Messung der Variation in Hülle und Fülle Protein in einer Zellpopulation ist wichtig bei der Bestimmung der Heterogenität, z. B. als Reaktion auf ein Medikament und hilft bei bietet Einblick in die Zellfunktionen und Wege, Bewertung von Subpopulationen und ihre Verhalten sowie seltene Ereignisse zu identifizieren, die sonst durch lose Methoden maskiert werden würde. Dieses Protokoll beschreibt, wie zu produzieren und adressierbare Tröpfchen Microarrays verwenden, um die Fülle der Transkription Faktor p53 in menschlichen Krebszellen quantitativ zu bestimmen und kann verwendet werden, um die Rolle von p53 in Reaktion auf Chemotherapeutika zu untersuchen. Das Zielprotein wird bestimmt durch die Wahl der Erfassung und Erkennung Antikörper und kann geändert werden, um mehr oder andere Ziele enthalten. Anleitung zum Erstellen einer einfachen Apparatur unter Einbeziehung einer konzentrischen Düse aus allgemeinen Labor Verbrauchsmaterial manuell Array 10 nL Tröpfchen mit Öl bedeckt. Die vollen experimentelle Verfahren ist beschrieben, wobei jedes Tröpfchen dann geladen wird, mit einer einzelnen Zelle, die dann lysiert ist und der Ausdruck des Proteins bestimmt mit Einzelmolekül-Auflösung mit TIRF-Mikroskopie.

<table><tbody><tr><td><stark>Zellkultur</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM mit hohem Glukosegehalt</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflaschen</td><td>Corning</td><td>SIAL0639</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td><>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Microarray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcontact Arrayer</td><td>DigiLab, UK</td><td>OmniGrid Micro</td><td></td></tr><tr><td>Microcontact Pin</td><td>ArrayIt, USA</td><td>946MP2</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser (Nexterion)</td><td>Schott, Europa</td><td>1098523</td><td>Größe (mm): 65.0 x 25.0; Dicke (mm) 0,17</td></tr><tr><td>p53 Capture-Antikörper</td><td>Enzo</td><td>ADI-960-070</td><td></td></tr><tr><td>p53 Nachweis-Antikörper, Alexa Fluor 488 markiert</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>Stammkonzentration 200 μm; g/mL</td></tr><tr><td>Kochsalz-Natriumcitrat-Puffer</td><td>Gibco</td><td>15557-044</td><td></td></tr><tr><td>Betain</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>384 Well-Platte (geringes Volumen)</td><td>Sigma</td><td>CLS4511</td><td></td></tr><tr><td>Stickstoffgasflasche</td><td>BOC</td><td>Industriequalität, sauerstofffrei</td><td></td></tr><tr><td><stark>Name</stark></td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Droplets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Patchman NP2</td><td></td></tr><tr><td>Manual Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>CellTram Vario</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Origio, Denmark</td><td>MBB-FP-L-0</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpen</td><td>KD Scientific</td><td>KDS-210</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; L-Spritze</td><td>Hamilton</td><td>81020</td><td>Gasdicht, PTFE Luer-Lock</td></tr><tr><td>1 mL Spritze</td><td>Hamilton</td><td>81327</td><td>Gasdicht, PTFE Luer-Lock</td></tr><tr><td>Silikon-Isolator</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR24R-A-0.5</td><td>6x4 Well Silikon-Isolator mit Klebstoff</td></tr><tr><td>Laserschneider</td><td>VersaLASE</td><td>VLS2.30 CO2 Laser 3W</td><td>zum Laserschneiden von kundenspezifischen Isolatoren</td></tr><tr><td>1 mm dicke Acrylplatte</td><td>Weatherall-UK</td><td>Clarex Precision Sheet 001</td><td>zum Laserschneiden von kundenspezifischen Isolatoren</td></tr><tr><td>Klebefolie</td><td>3M</td><td></td><td>zum Aufkleben von kundenspezifischen Isolatoren auf Microarray-Deckgläsern</td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td>Loctite</td><td>LOCPFG3T</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu; m ID/360 &mu; m AD Quarzglasschlauch</td><td>IDEX</td><td>FS-115</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/1/16" Außendurchmesser PFA-Schlauch</td><td>IDEX</td><td>1503</td><td></td></tr><tr><td>0,014" ID/0.062" Außendurchmesser PTFE-Schlauch</td><td>Kinesis</td><td>008T16-100</td><td></td></tr><tr><td>1,0 mm ID/2,0 mm Außendurchmesser FEP-Schlauch</td><td>IDEX</td><td>1673</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumen (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Reinstwasser</td><td>Millipore, Deutschland</td><td>MilliQ</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Mikroskopie & OptikTIRF-Mikroskop</td> mit kodiertem XY-Tisch <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon, Japan</td><td>Nikon Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Andor Technologies, Irland</td><td>IXON DU-897E Laseranregungsquelle</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vortran, USA</td><td>Stradus 488-50</td><td></td></tr><tr><td>Optische Lyse-Laserquelle</td><td>Continuum, USA</td><td>Surelite SLI-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Filterwürfel für TIRF</td><td>Chroma, USA</td><td>z488bp</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Filterwürfel für Optical Lysis</td><td>Laser 2000, UK</td><td>LPD01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen<</td><td>strong>Katalognummer<</td><td>>Kommentare</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fidschi</td><td>Open Source</td><td></td><td>Bildanalysesoftware</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>Version 7.14 oder höher</td><td>Bildanalysesoftware</td></tr></tbody></table>

zählen proteine in einzelne zellen mit adressierbaren tröpfchen microarrays

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Oft zellulären Verhalten und zelluläre Reaktionen auf Bevölkerungsebene analysiert, wo die Antworten aus vielen Zellen als ein durchschnittliches Ergebnis Maskierung der reichen einzelne Zelle Verhalten innerhalb einer komplexen Population zusammengefasst sind. Einzelne Zelle Protein Erkennung und Quantifizierung Technologien haben in den letzten Jahren einen bemerkenswerten Einfluss gemacht. Hier beschreiben wir eine praktische und flexible Einzelzelle Analyse-Plattform basierend auf adressierbaren Tröpfchen Microarrays. Diese Studie beschreibt, wie die absolute heftnummern Zielproteine mit einzelligen Auflösung gemessen werden können. Der Tumorsuppressor p53 ist das am häufigsten mutierte Gen im menschlichen Krebs, mit mehr als 50 % der insgesamt Krebsfälle Ausstellen eines nicht gesunden p53 Expressionsmuster. Das Protokoll beschreibt die Schritte zum Erstellen von 10 nL Tröpfchen in dem einzigen menschlichen Krebszellen sind isoliert und die Kopienzahl des p53-Protein wird gemessen mit Einzelmolekül-Auflösung, die Variabilität der Ausdruck genau zu bestimmen. Die Methode kann auf jeden Zelltyp einschließlich Primärmaterial zu bestimmen, die absolute Kopienzahl jedes Ziel interessierender Proteine angewendet werden.

Die absoluten basalen Protein Kopienzahl des p53 wurde mit einer Einzelzelle Auflösung in eine menschlichen Dickdarm-Krebs-Zell-Linie, BE-Zellen bestimmt. Wir zeigen, wie p53 Ausdruck über mehrere Größenordnungen variieren kann und zeigen eine schwache positive Korrelation zwischen Größe und Protein Kopie Zellzahl innerhalb der ruhenden BE-Zell-Population.
Adressierbare Tröpfchen Microarrays werden gebildet, wenn wässrige Tröpfc...

Hier präsentieren wir Ihnen adressierbare Tröpfchen Microarrays (ADM-Dateien), ein Tröpfchen Array-basierte Methode absolute Protein Fülle in einzelnen Zellen zu bestimmen. Wir zeigen die Fähigkeit der ADM-Dateien, die Heterogenität im Ausdruck der Tumorsuppressor Protein p53 in einem menschlichen Krebs-Zell-Linie zu charakterisieren.

Zählen Proteine in einzelne Zellen mit adressierbaren Tröpfchen Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die absolute Kopienzahl eines Zielproteins mit Einzelzell-Auflösung zu bestimmen. Einzelzell-Methoden ermöglichen ein besseres Verständnis des Verhaltens eines Proteins im Zusammenhang mit dem zentralen Dogma und tragen zu einer genauen Quantifizierung der regulierten Genexpression bei. Die Arbeit auf Einzelzellebene kann die vielfältige Heterogenität der Zellpopulation erfassen, die andernfalls durch die Mittelwertbildung bei herkömmlichen biochemischen Methoden verloren ginge.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten aufgrund der Empfindlichkeit von Einzelzell-Assays oder der begrenzten Menge an Protein in jeder Zelle. Wir hatten ursprünglich die Idee zu dieser Methode, als wir einen Einzelzell-Protein-Assay durchführen wollten, der leicht für weitere Analysen in nachgeschalteten Schritten entnommen werden konnte. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie Chips herstellen und Antikörper-Mikroarrays gemäß der schriftlichen Protokollanleitung aufbringen.Um die Apparatur vorzubereiten, führen Sie ein 100 Millimeter langes Stück Fusionskieselsäure-Rohr mit 150 Mikrometer Innendurchmesser und

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Droplet-based mikrofluidischen Plattformen sind vielversprechende Kandidaten für einen hohen Durchsatz Experimente, da sie in der Lage, Picoliter, Selbst-compartmentalized Schiffe kostengünstig erzeugen bei kHz Preise sind. Durch die Integration mit schnellen, empfindlichen und hoch aufgelöste Fluoreszenz-spektroskopischen Methoden kann die große Mengen von Informationen in diesen Systemen erzeugt effizient extrahiert werden können, genutzt und verwertet werden.

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

In diesem Artikel präsentieren wir ein Mikrofluidik-Chip für Einzelzellanalyse. Es ermöglicht die Quantifizierung der intrazellulären Proteine, Enzyme, Cofaktoren und zweiten Boten mittels Fluoreszenzassays oder Immunoassays.

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

Wir beschreiben einen digitalen Endpunkt-Assay zur Quantifizierung von Nukleinsäuren mit einer vereinfachten (analogen) Auslesung. Wir messen die Massenfluoreszenz von tröpfchenbasierten digitalen Assays mit einem Standard-qPCR-Gerät anstelle von speziellen Instrumenten und bestätigen unsere Ergebnisse durch Mikroskopie.

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines großflächigen, gemultiplexten zweidimensionalen DNA oder Antikörperarray, mit potentiellen Anwendungen in der Zellsignal Studien und Biomarkern.

Strömungsmuster Guided Herstellung von High-Density-Barcode Antikörper Microarray

Es wird eine empfindliche und genaue Methode zur Quantifizierung zellfreier microRNAs unter Verwendung einer farbstoffbasierten Chemie und einer digitalen Tröpfchen-PCR-Technologie beschrieben.

Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

Wir zeigen eine Snap-Chip-Technologie für die Durchführung von cross-reactivity-freie gemultiplexten Sandwich Immunoassays durch Einrasten einfach zwei Folien. Ein Snap-Apparat dient zur Übertragung von zuverlässig Reagenzien von Microarray-Microarray. Die Snap-Chip kann für jede biochemischen Reaktionen erfordern NS1 der verschiedenen Reagenzien ohne Cross-Kontamination verwendet werden.

Snap Chip für Cross-reactivity frei und Spotter Multiplex Sandwich Immunoassays

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Kennzeichnung Homogenität für jede Art von Protein in einer komplexen Protein-Probe auf der Einzelmolekül-Ebene zu bewerten.

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Das übergeordnete Ziel des Protokolls ist es, über eine Million geordnete, einheitliche, stabile und biokompatible Femtolitertröpfchen auf einem 1 cm2 planaren Substrat herzustellen, das für die zellfreie Proteinsynthese verwendet werden kann.

Ein Femtoliter Droplet Array für massive parallele Proteinsynthese aus einzelnen DNA-Molekülen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der absoluten mitochondrialen (mt)DNA-Kopienzahl und der mtDNA-Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen vor.

Messung der einzelligen mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Heteroplasmie mittels digitaler Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Diese Methode quantifiziert die mikrobielle Häufigkeit unter Verwendung eines 96-Well-Plattenformats für Plattenkoloniebildungseinheiten (CFUs) und wird auf das Drosophila-Mikrobiom in ganzen Fliegenhomogenatproben angewendet. CFUs werden mit einer hier bereitgestellten automatisierten Bildanalysesoftware gezählt.

Schnelle Koloniebildung im 96-Well-Plattenformat aufgebracht auf das Drosophila-Mikrobiom

Das Protokoll beschreibt eine fortschrittliche mikrofluidische Plattform zur quantitativen Messung der Zytokinsekretionsdynamik einzelner mononukleärer Zellen des menschlichen peripheren Blutes. Die Plattform misst bis zu drei Zytokine parallel (IL-6, TNFα und IL-1β) für jede einzelne Zelle, die beispielsweise mit Lipopolysaccharid stimuliert wird.

Mikrofluidischer Ansatz zur Auflösung der gleichzeitigen und sequentiellen Zytokinsekretion einzelner polyfunktioneller Zellen 

Erfahren Sie die Quantifizierung von Proteinen in einzelnen Zellen mit adressierbaren Tröpfchen-Microarrays. Diese Methode ermöglicht die Bestimmung absoluter Protein-Kopienzahlen und erfasst die Heterogenität von Zellpopulationen.

Zählen Proteine in einzelne Zellen mit adressierbaren Tröpfchen Microarrays

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