Zählen Proteine in einzelne Zellen mit adressierbaren Tröpfchen Microarrays

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die absolute Proteinkopienzahl eines Zielproteins mit Einzelzellauflösung zu bestimmen. Einzelzelltechniken ermöglichen ein besseres Verständnis des Verhaltens eines Proteins in Bezug auf ein zentrales Dogma und helfen bei der genauen Quantifizierung der kontrollierten Genexpression. Die Arbeit auf Einzelzellebene kann die reiche Heterogenität der Zellpopulation erfassen, die sonst durch die Mittelwertbildung bei herkömmlichen biochemischen Techniken verloren gehen würde.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der Empfindlichkeit von Einzelzell-Assays oder einer begrenzten Proteinmenge in jeder Zelle Schwierigkeiten haben. Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir einen Einzelzellprotein-Assay durchführen wollten, der für die weitere Analyse im weiteren Stream leicht beprobt werden kann. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie Chips herstellen und Antikörper-Microarrays drucken, wie im Textprotokoll beschrieben.

Um das Gerät vorzubereiten, führen Sie einen 100 Millimeter langen Quarzglasschlauch mit einem Innendurchmesser von 150 Mikrometern und einem Außendurchmesser von 360 Mikrometern einem 40 Millimeter langen PFA-Schlauch mit einem Innendurchmesser von 1/16 Zoll zu, bis er um zwei Millimeter übersteht. Dadurch bildet sich die konzentrische Düse. Tragen Sie eine dünne Schicht Cyanacrylatkleber auf das Ende einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze auf und führen Sie ihn in das 40-Millimeter-Stück PFA-Schlauch ein.

Positionieren Sie bei Bedarf den Quarzglasschlauch neu, um einen 2-Millimeter-Vorsprung an der Düse zu erhalten, bevor der Klebstoff aushärtet. Führen Sie das andere Ende der Quarzglaskapillare in das Ende eines 200 Millimeter langen PTFE-Schlauchs mit einem Innendurchmesser von 014 Zoll und einem Außendurchmesser von 062 Zoll ein. Verbinden Sie dies mit einer 100-Mikroliter-Hamilton-Spritze, die mit vier Prozent Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gefüllt ist.

Führen Sie als Nächstes einen FEP-Schlauch mit einer Länge von 400 Millimetern und einem Innendurchmesser von 2 Millimetern und einem Außendurchmesser von 200 Millimetern in eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze ein, bis er eine Dichtung bildet. Tragen Sie eine dünne Schicht Cyanacrylatkleber auf eine weitere 200-Mikroliter-Pipettenspitze auf und schieben Sie diese dann in die erste Spitze, um den Schlauch zu fixieren. Verbinden Sie dann das offene Ende des FEP-Schlauchs mit einer 1-Milliliter-Hamilton-Spritze, die mit Mineralöl gefüllt ist.

Setzen Sie die 200-Mikroliter-Pipettenspitze in die 10-Mikroliter-Pipettenspitze der konzentrischen Düse ein. Füllen Sie anschließend die 100-Mikroliter-Spritze mit 4-prozentiger PBSA-Blockierungslösung. Befestigen Sie den wässrigen Schlauch wieder und spülen Sie ihn mit der Verstopfungslösung.

Wiederholen Sie dies zweimal für insgesamt drei Spülungen. Füllen Sie dann die 100-Mikroliter-Spritze mit 0,125 Mikrogramm pro Liter Nachweisantikörper in 4-prozentigem PBSA und befestigen Sie den Schlauch wieder. Ersetzen Sie die Blockierungslösung im Schlauch, indem Sie 25 Mikroliter Nachweis-Antikörperlösung abgeben.

Spülen Sie den Ölschlauch mit Mineralöl, bis sich alle Schläuche und die Düse mit Öl füllen. Füllen Sie dann die 1-Milliliter-Spritze wieder mit Mineralöl auf und befestigen Sie den Schlauch wieder. Befestigen Sie abschließend die Schlauch- und Düsenbaugruppe an einem XYZ-Manipulator.

Um adressierbare Tröpfchen zu bilden, befestigen Sie den Chip auf dem Mikroskoptisch. Zeichnen Sie die Tischkoordinaten des Mikroskops für jeden Punkt im Array mit der automatisierten Mikroskopsteuerungssoftware auf. Stellen Sie anschließend den XYZ-Manipulator auf den Mikroskoptisch.

Legen Sie die Spritzen in separate Spritzenpumpen, da sie unabhängig voneinander betrieben werden müssen. Platzieren Sie die Düse in einem Winkel von 50 bis 60 Grad. Stellen Sie dann die wässrige Spritzenpumpe so ein, dass sie 10 Nanoliter von 100 Mikrolitern pro Minute abgibt, und stellen Sie die Ölspritzenpumpe so ein, dass sie 5 Mikroliter bei 100 Mikrolitern pro Minute dispergiert.

Geben Sie die wässrige Lösung ab, bis eine Flüssigkeitsperle am Kopf der Düse sichtbar ist. Tupfen Sie die Perle mit einem staubfreien Tuch ab, um sie zu entfernen. Stellen Sie mit der automatisierten Mikroskopsteuerungssoftware die Koordinaten des Mikroskoptisches auf einen Antikörperpunkt im Array ein und fokussieren Sie auf die Deckglasoberfläche.

Achten Sie beim Ausrichten der Düse darauf, den Antikörperfleck nicht zu stören. Seien Sie besonders vorsichtig und stellen Sie sicher, dass Sie die Annäherung der Glaskapillarspitze durch ein Mikroskop beobachten. Achten Sie darauf, den Spot nicht zu stören, und richten Sie mit dem XYZ-Manipulator die Glaskapillarspitze der konzentrischen Düse an der Seite des Antikörperspots aus.

Nach dem Ausrichten 10 Nanoliter wässrige Lösung abgeben. Geben Sie fünf Mikroliter Öl ab, ohne die Tische zu bewegen, um die wässrige Lösung zu verschließen. Heben Sie die Düse langsam vom Tröpfchen ab und gehen Sie zur nächsten Vertiefung.

Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Antikörper-Spots im Array. Nach 30 Minuten bilden Sie alle Spots im Array mit der automatisierten Mikroskopsteuerungssoftware ab, um den Hintergrund einzelner Moleküle zu bestimmen, die an jeden Antikörperfleck gebunden sind, bevor die Zellen geladen werden. Um die adressierbaren Tröpfchen mit Zellen zu beladen, suspendierten wir die Zellen in einer Lösung von 0,125 Mikrogramm pro Milliliter Nachweisantikörper in L-15-Medien mit 10 Prozent FDS.

Filtrieren Sie die Zelllösung durch ein Zellensieb mit 40 Mikrometern, um eine einzellige Suspension zu gewährleisten. Laden Sie die einzelnen Zellen mit Hilfe des Mikromanipulators und der Mikrokapillare in die adressierbaren Tröpfchen aus dem Zellreservoir. Beobachten Sie durch ein 10-faches Objektiv und verwenden Sie den Mikroinjektor, um eine einzelne Zelle aus dem Zellreservoir in die Mikrokapillare zu aspirieren.

Manuell mit einem Joystick arbeitend, gießen Sie automatisch mit der Auswurffunktion eines elektronischen Manipulatortisches. Lehnen Sie die Mikropipette ab, indem Sie sie nach oben verschieben, um die Höhe des Chips von 1 Millimeter freizugeben. Stellen Sie die Tischkoordinaten mit der automatisierten Mikroskopsteuerungssoftware auf die eines adressierbaren Tröpfchens ein.

Injizieren Sie die Mikropipette, indem Sie sie wieder in die gespeicherte Z-Position bringen. Führen Sie dies manuell mit dem Joystick oder automatisch durch, wenn Sie einen elektronischen Manipulatortisch verwenden. Durch die mechanischen Prozesse durch die laserinduzierte Lyse kann am Tröpfchenrand eine Emulsion entstehen, die durch höhere Pulsenergien die Tröpfchen vollständig aufbrechen kann.

Stellen Sie sicher, dass die richtigen Lyseimpulsenergien auf ein Minimum reduziert werden und sich die Zellen nicht am unmittelbaren Rand der Tröpfchen ablagern. Dispensieren Sie die Zellen mit dem Mikroinjektor in das adressierbare Tröpfchen. Abbildung der Zellen in Tröpfchen mittels Hellfeldmikroskopie, einschließlich Fluoreszenzbildgebung.

Bilden Sie auch alle Spots im Array mit der Einzelmolekül-TIRF-Mikroskopie ab. Fokussieren Sie sich auf die Zelle in einem adressierbaren Tröpfchen. Erzielen Sie eine vollständige optische Lyse, indem Sie einen einzelnen 6-Nanosekunden-Laserpuls in der Nähe der Position der Zelle fokussieren.

Notieren Sie sich den Zeitpunkt, zu dem jede Zelle lysiert wird. Nehmen Sie Einzelmolekülbilder mit TIRF-Mikroskopie aller Spots alle zehn Minuten für die ersten 30 Minuten auf, dann alle 20 Minuten für weitere 60 Minuten. Wenn Sie nur an der Menge des im Gleichgewicht gebundenen Proteins interessiert sind, stellen Sie alle Flecken dar, nachdem Sie den Chip 90 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben.

Um eine Einzelmolkulenzählung für einen nicht kongestauten Antikörperfleck durchzuführen, laden Sie das Hintergrundbild, das vor der Lyse aufgenommen wurde. Wählen Sie in Fidschi das Hintergrundbild aus. Wählen Sie im Bildmenü Duplizieren aus, um den Hintergrund zu duplizieren.

Wählen Sie dann das duplizierte Bild aus und wählen Sie auf der Registerkarte Prozessfilter die Option Gaußscher Weichzeichner aus und geben Sie einen Radius von 50 Pixeln an. Navigieren Sie zu Prozess und wählen Sie Bildrechner aus. Geben Sie dort die Operation divide und die gewünschten Bilder an, dann aktivieren Sie die Kontrollkästchen Neues Fenster erstellen und 32-Bit-Ergebnis.

Subtrahieren Sie jedes Pixel im Bild um eins. Wählen Sie dann einen Bereich von 50 x 50 Pixeln in einer der vier Ecken des flachen Hintergrundbilds aus. Messen Sie die Standardabweichung der Pixelintensität, indem Sie Analysieren und Messen auswählen.

Wählen Sie unter "Bild anpassen" die Option "Schwellenwert" aus, und legen Sie den unteren Schwellenwert auf drei Standardabweichungen fest. Legen Sie in der SM-Maske des segmentierten Bildes die Werte für die Pixelintensität für alle Objekte mit einer Größe von vier bis neun quadratischen Pixeln und einer Kreisförmigkeit von 0,5 bis 1 auf Null fest. Wählen Sie dazu Analysieren gefolgt von Partikel analysieren und geben Sie die Größe und Kreisförmigkeit an.

Laden und wiederholen Sie für dieselben Antikörperspots die Datenanalyseschritte für alle Bildrahmen, die als Zeit-Ergebnis-Reihe nach der Lyse erfasst wurden. In repräsentativen Ergebnissen von Einzelmolekülbildern zeigt das Signal in den Hintergrundbildern das geringere Maß an unspezifischer Bindung des fluoreszenzmarkierten Detektionsantikörpers an die Oberfläche und den Antikörperspot. Das vergrößerte Einschubbild zeigt hervorgehobene einzelne Moleküle mit roten Pfeilen.

Ebenfalls zu sehen ist ein typisches Bild eines Pulldowns von p53 in BE humanen Kolonkarzinomzellen. Diese Bildsequenz zeigt die Akkumulation des p53-Proteins auf dem Antikörper-Spot. Eine Kalibrierungskurve, die unter Verwendung bekannter Konzentrationen des kombinanten Proteins erhalten wird, wird verwendet, um die Einzelmolekülzahlen an jedem Spot in die Anzahl der Zielproteine im Analysevolumen umzurechnen und gibt Hinweise auf die Anzahl der Einzelzellkopien.

Die horizontale rote gestrichelte Linie zeigt den Grad der unspezifischen Bindung an. Die basale p53-Proteinexpression in BE-Krebszellen zeigt eine langschwänzige gamma-ähnliche Verteilung, bei der die p53-Proteinexpression in einigen Zellen signifikant höher ist als der Modalwert. Hier wird die p53-Proteinexpression als Funktion des Zellvolumens aufgetragen, das aus dem gemessenen Zelldurchmesser vor der Lyse berechnet wird.

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass in diesen Zellen eine Mindestkonzentration des Proteins p53 aufrechterhalten wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Häufigkeit eines Zielproteins mit Einzelzellauflösung messen können. Bei der Arbeit mit biologischen Zellen ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Proteine abgebaut werden können.

Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von vier Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, und kann in Protokolle zur Analyse von Primärpatientenproben integriert werden. Einzelzelltechniken können helfen, Einblicke in die zelluläre Funktion und das zelluläre Verhalten zu geben und seltene Ereignisse zu identifizieren, die sonst von beiden Methoden übersehen würden. Obwohl diese Methode einen Einblick in die Biologie von p53- und Brustkrebszelllinien geben kann, kann sie auch auf andere Studien von Krankheiten angewendet werden, ohne dass eine Markierung erforderlich ist, was bei der Untersuchung von Primärzellen aus Patientenproben von Vorteil ist.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Quantenpunkt-PCR durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. um festzustellen, ob die Expression von Ziel-RNA und Protein korreliert ist. Die Messung der absoluten Kopienzahl eines Proteins wird für Biomathematiker und Computerwissenschaftler attraktiv sein, um ihre biologischen Modelle zu unterstützen.