Eine standardisierte Methode zur Messung der inneren Lungenoberfläche über Maus Pneumonektomie und Prothesenimplantation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die innere Oberfläche einer Mauslunge nach einer Pneumonektomie und Prothesenimplantation genau zu vermessen. Diese Methode hilft dabei, die morphologischen und physiologischen Funktionen der Lunge bei der mechanisch kraftinduzierten Lungenregeneration bei Erwachsenen zu analysieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht in der genauen Quantifizierung der inneren Lungenoberfläche, was eine Erhöhung der Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit des Lungenfunktionsstatus verspricht.

Bereiten Sie die Maus auf einer Intubationsplattform mit zugänglicher Bauchseite auf die Operation vor. Ziehen Sie dann die Zunge heraus und inspizieren Sie die Stimmbänder mit einem Kleintierlaryngoskop, das mit Führungskathetern kompatibel ist. Führen Sie dann vorsichtig eine intravenöse Intubationskanüle mit 20 Gauge in einem Innenwinkel in die Luftröhre ein.

Bringen Sie anschließend die Maus in eine rechte seitliche Liegeposition und schließen Sie die Kanüle an ein mechanisches Beatmungsgerät an. Beobachten Sie den Brustkorb, um das Einführen der Kanüle in die Luftröhre zu beurteilen. Stellen Sie den Inspirationsdruck auf 12 Zentimeter Wasser und die Atemfrequenz auf 120 Atemzüge pro Minute ein.

Reinigen Sie nun die exponierte Haut mit mindestens drei abwechselnden Peelings aus Betadin und 70 % Ethanol. Beginnen Sie dann die Operation mit einem zwei bis drei Zentimeter langen posterolateralen Thorakotomieschnitt in den fünften Interkostalraum. Dringen Sie mit der Noyes Federschere in die Muskulatur ein.

Machen Sie als Nächstes einen 1,5 Zentimeter großen Schnitt, um die linke Lunge freizulegen. Verwenden Sie bei Bedarf während der gesamten Operation einen Hochtemperatur-Kauterisator, um die Blutung zu stoppen. Heben Sie dann 1/3 des linken Lungenlappens mit einer stumpfen Pinzette aus der Brust und ziehen Sie mit einem Wattestäbchen die gesamte linke Lunge heraus.

Identifizieren Sie nun die Lungenarterie und die Bronchien des linken Lungenlappens und binden Sie die Bronchien und Gefäße am Hilum mit einer getränkten chirurgischen Naht fest. Schneiden Sie als Nächstes den linken Lungenlappen drei bis vier Millimeter von der Ligatur entfernt heraus und achten Sie darauf, die Naht nicht abzuschneiden, was zu einem Pneumothorax führen könnte. Als nächstes verschließen Sie die Brustwand mit einer Naht.

Nähen Sie dann die Muskelschicht und die Hautschicht nacheinander mit fünf bis sechs unterbrochenen Nähten mit drei bis vier Millimetern Abstand. Achten Sie darauf, die chirurgische Nahtnadel vom Herzen fernzuhalten. Eine Herzpunktion ist tödlich.

Zum Schluss desinfizieren Sie den Operationsbereich mit Povidon-Jod. Platzieren Sie dann die Maus auf einem 38 Grad Celsius warmen Wärmeleitpad. Verwenden Sie das Beatmungsgerät weiter, bis die Spontanatmung zurückkehrt.

Führen Sie die zuvor beschriebene Operation durch, aber bereiten Sie sich unmittelbar nach dem Entfernen der Lunge auf das Einsetzen der Prothese vor. Fassen Sie mit einer abgestumpften Pinzette die Mitte der ellipsoiden Silikonprothese. Halten Sie anschließend die Rippe mit einer Pinzette fest, um die Brusthöhle freizulegen, und führen Sie die Prothese sehr vorsichtig ein.

In einem Winkel von 45 Grad zwischen der Frontebene der Prothese und der Thoraxoberfläche eintreten. Stellen Sie mit einer stumpfen Pinzette sicher, dass sich die Prothese vollständig in der linken leeren Brusthöhle befindet. Schließen Sie nun die Truhe und überwachen Sie die Maus wie zuvor beschrieben.

Stellen Sie für dieses Verfahren ein individuelles Aufblasrohr zusammen, das aus einem Kolben besteht, der von einer serologischen 10-Milliliter-Pipette entfernt wurde, einem 40 Zentimeter langen flexiblen Schlauch mit einem Nadeladapter, einem Durchflussregelventil und einer 18-Gauge-Nadel. Befestigen Sie die Pipette nach dem Zusammenbau mit Klebeband an einem Sideboard. Der Abstand zwischen der Oberseite der Pipette und dem Tisch muss mindestens 30 Zentimeter betragen.

Nachdem Sie die Maus durch eine Betäubungsinjektion eingeschläfert haben, befestigen Sie sie auf einem sterilisierten Brett und öffnen Sie vorsichtig den Brustkorb, um das Brustbein herauszuschneiden und die Lungenlappen freizulegen. Legen Sie dann die Luftröhre frei. Füllen Sie anschließend den Aufblasschlauch mit frisch hergestelltem 4%PFA und entfernen Sie alle Blasen aus dem Schlauch.

Führen Sie dann die Nadel in die Luftröhre ein. Um ein Auslaufen zu vermeiden, schneiden Sie die Luftröhre mit Gefäßklammern ab. Blasen Sie nun die Lunge mit Fixiermittel bei einem konstanten transpulmonalen Druck von 25 Zentimetern Wasser auf.

Inkubieren Sie die Lunge zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, um sich vollständig zu entfalten. Achten Sie nach dem Aufblasen auf die Volumenverschiebung des Fixiermittels. Ligatieren Sie nun die Luftröhre und präparieren Sie vorsichtig die Lunge intakt vom umgebenden Bindegewebe

Verwenden Sie eine Schere und seien Sie sehr vorsichtig. Als nächstes inkubieren Sie die Lunge in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen, das mit 4 % PFA gefüllt ist, für 12 Stunden bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln auf einem Shaker. Fahren Sie dann mit der Verarbeitung und Färbung fort, wie im Textprotokoll beschrieben.

Um den MLI zu quantifizieren, verwenden Sie Bilder des Agenten, die in Schnitten verwendet werden, die unter Hellfeld bei 20-facher Vergrößerung aufgenommen wurden. Wählen Sie aus drei verschiedenen Lungenabschnitten nach dem Zufallsprinzip insgesamt 15 nicht überlappende Ansichten aus, die jeweils etwa einen Quadratmillimeter groß sind, und entlüften Sie sie. Verwenden Sie nur Bereiche ohne Arterien und Venen, große Atemwege oder Alveolargänge.

Zeichnen Sie für die Analyse mit einem Linealwerkzeug ein 10 x 10 großes Raster über jeden ausgewählten Bereich. Die Gitterlinien sind also etwa 100 Mikrometer voneinander entfernt. Dann, um einen Schnittpunkt entlang der Linie zu finden, der der Länge zwischen zwei benachbarten Alveolarepithelien entspricht.

Die Doppelpfeile veranschaulichen zum Beispiel die Längen. Zählen Sie alle diese Längen entlang jeder Rasterlinie, und der MLI ist der Durchschnittswert der Schnittpunktlängen. Unter Verwendung der beschriebenen Protokolle wurden PNX-behandelte Mäuse mit prothetisch implantierten Mäusen verglichen.

Bei den verwendeten Mäusen handelte es sich um acht Wochen alte CD-1-Männchen, deren linke Lungenlappen reseziert wurden. Die Prothese ahmt die Größe und Form des linken Lungenlappens nach und wurde in den Brustkorb eingesetzt, nachdem der linke Lungenlappen entfernt wurde. 14 Tage nach der Operation wurde ein speziell angefertigter Aufblasschlauch verwendet, um das Innenvolumen der verbleibenden rechten Lunge zu bestimmen.

Das durchschnittliche Volumen der rechten Lunge bei den fünf mit PNX behandelten Mäusen betrug etwa 1,4 Milliliter und war damit signifikant größer, 1,05 Milliliter bei den fünf prothesenimplantierten Mäusen. Die MLI-Werte in der verbleibenden rechten Lunge waren ebenfalls signifikant höher. Anhand dieser Parameter wurde die innere Lungenoberfläche berechnet, die bei den prothesenimplantierten Mäusen signifikant kleiner war.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die innere Lungenoberfläche für das Mausmodell der mechanisch kraftinduzierten Alveolarregeneration