Eine standardisierte Methode zur Messung der inneren Lungenoberfläche über Maus Pneumonektomie und Prothesenimplantation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die innere Oberfläche einer Mauslunge nach einer Pneumonektomie und Implantation einer Prothese präzise zu messen. Diese Methode trägt zur Analyse der morphologischen und physiologischen Funktionen der Lunge bei der mechanisch induzierten Regeneration der erwachsenen Lunge bei. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt in der genauen Quantifizierung der inneren Lungenoberfläche, was die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit des Lungenfunktionsstatus erhöhen kann.

Bereiten Sie die Maus für die Operation auf einer Intubationsplattform vor, wobei die Bauchseite zugänglich ist. Ziehen Sie dann die Zunge heraus und untersuchen Sie die Stimmbänder mit einem kleinen tierärztlichen Laryngoskop, das mit Führungskathetern kompatibel ist. Führen Sie anschließend vorsichtig eine 20-Gauge-Intravenen-Intubationskanüle unter einem inneren Winkel in die Luftröhre ein.

Als Nächstes bringen Sie die Maus in eine rechte Seitenlage und verbinden die Kanüle mit einem mechanischen Beatmungsgerät. Beobachten Sie den Brustkorb, um die Einführung der Kanüle in die Luftröhre zu beurteilen. Stellen Sie den inspiratorischen Druck auf 12 Zentimeter Wassersäule ein und legen Sie die Atemfrequenz auf 120 Atemzüge pro Minute fest.

Reinigen Sie die freiliegende Haut nun mit mindestens drei abwechselnden Abreibungen mit Betadine und 70 % Ethanol. Beginnen Sie dann die Operation mit einem zwei bis drei Zentimeter langen posterolateralen Thorakotomie-Schnitt im fünften Interkostalraum. Durchtrennen Sie die Muskulatur mit Noyes-Spring-Scheren.

Danach einen 1,5 cm langen Einschnitt vornehmen, um die linke Lunge freizulegen. Bei Bedarf während der gesamten Operation einen Hochtemperatur-Koagulator verwenden, um Blutungen zu stoppen. Anschließend ein Drittel des linken Lungenlappens mit stumpfen Pinzetten aus der Brusthöhle anheben und mit einem Wattestäbchen die gesamte linke Lunge herausziehen.

Identifizieren Sie nun die Lungenarterie und die Bronchien des linken Lungenlappens und ligieren Sie die Bronchien und Gefäße am Hilus mit einer durchfeuchteten chirurgischen Naht fest. Schneiden Sie anschließend den linken Lungenlappen drei bis vier Millimeter distal der Ligatur heraus, wobei darauf geachtet werden muss, die Naht nicht abzutrennen, da dies zu einem Pneumothorax führen könnte. Schließen Sie danach die Brustwand mit einer Naht.

Nähen Sie anschließend die Muskelschicht und die Hautschicht nacheinander mit fünf bis sechs Einzelknopfnähten und Abständen von drei bis vier Millimetern. Achten Sie darauf, die chirurgische Nadel stets vom Herzen fernzuhalten. Eine Herzpunktion ist tödlich.

Desinfizieren Sie abschließend den Operationsbereich mit Povidon-Iod. Anschließend stellen Sie die Maus auf eine Wärmeunterlage mit 38 Grad Celsius. Verwenden Sie den Beatmungsapparat weiterhin, bis die spontane Atmung zurückkehrt.

Führen Sie den zuvor beschriebenen Eingriff durch, bereiten Sie jedoch unmittelbar nach der Entfernung der Lunge die Implantation der Prothese vor. Greifen Sie mit stumpfen Pinzetten die Mitte der ellipsoiden Silikonprothese. Halten Sie danach mit der Pinzette einen Rippenbogen fest, um die Brusthöhle freizulegen, und setzen Sie die Prothese sehr vorsichtig ein.

Betreten Sie in einem 45-Grad-Winkel zwischen der frontalen Ebene der Prothese und der Brustwand. Stellen Sie mit stumpfen Pinzetten sicher, dass die Prothese vollständig in der linken leeren Brusthöhle liegt. Schließen Sie nun den Brustkorb und überwachen Sie die Maus wie zuvor beschrieben.

Stellen Sie für diesen Vorgang ein benutzerdefiniertes Aufblasrohr zusammen, das aus einem Kolben einer 10-Milliliter-Serologenpipette ohne Kolbenstößel, einem 40 Zentimeter langen flexiblen Schlauch mit Nadeladapter, einem Durchflussregelventil und einer 18-Gauge-Nadel besteht. Befestigen Sie die Pipette nach dem Zusammenbau mit Klebeband an einer Seitenplatte. Der Abstand zwischen der Oberseite der Pipette und der Arbeitsfläche muss mindestens 30 Zentimeter betragen.

Nachdem die Maus durch eine Anästhetikainjektion euthanasiert wurde, befestigen Sie sie an einer sterilisierten Unterlage und öffnen vorsichtig den Brustkorb, um das Brustbein zu entfernen und die Lungenlappen freizulegen. Danach freilegen die Luftröhre. Füllen Sie anschließend das Aufblasungsrohr mit frisch hergestellter 4 % PFA und entfernen Sie alle Blasen aus dem Rohr.

Danach die Nadel in die Luftröhre einführen. Um Leckagen zu vermeiden, die Luftröhre mit Gefäßklemmen abklemmen. Anschließend die Lunge mit Fixansatz bei einem konstanten transpulmonalen Druck von 25 Zentimeter Wassersäule aufblasen.

Inkubieren Sie die Lungen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, um eine vollständige Expansion zu erreichen. Notieren Sie nach der Aufblasung die Volumenverdrängung des Fixativs. Ligieren Sie nun die Luftröhre und dissezieren Sie die Lungen vorsichtig vollständig aus dem umgebenden Bindegewebe heraus.

Verwenden Sie eine Schere und seien Sie sehr vorsichtig. Anschließend inkubieren Sie die Lungen in einem 50-Milliliter-Konischgefäß, das mit 4 % PFA gefüllt ist, für 12 Stunden bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln auf einem Schüttler. Danach fahren Sie mit der Aufarbeitung und Färbung wie im Textprotokoll beschrieben fort.

Um die MLI zu quantifizieren, verwenden Sie Bilder des verwendeten Wirkstoffs aus unter Hellfeld bei 20-facher Vergrößerung aufgenommenen Schnitten. Wählen Sie zufällig insgesamt 15 nicht überlappende Ansichten aus drei verschiedenen Lungenabschnitten, jeweils etwa einen Quadratmillimeter groß, und belüften Sie diese anschließend. Verwenden Sie nur Bereiche ohne Arterien und Venen, große Atemwege oder Alveolärgänge.

Zeichnen Sie für die Analyse mithilfe eines Linealwerkzeugs ein 10 mal 10 großes Raster über jeden ausgewählten Bereich. Die Rasterlinien liegen somit etwa 100 Mikrometer auseinander. Ermitteln Sie anschließend einen Schnittpunkt entlang der Linie als die Länge zwischen zwei benachbarten alveolären Epithelien.

Beispielsweise veranschaulichen die Doppelpfeile die Längen. Zählen Sie alle diese Längen entlang jeder Gitterlinie, und die MLI ist der Mittelwert der Schnittlängen. Mithilfe der beschriebenen Protokolle wurden PNX-behandelte Mäuse mit Mäusen verglichen, die eine Prothese implantiert erhalten hatten.

Es wurden acht Wochen alte männliche CD-1-Mäuse verwendet, bei denen die linken Lungenlappen reseziert wurden. Die Prothese imitiert die Größe und Form des linken Lungenlappens und wurde nach Entfernung des linken Lungenlappens in die Brusthöhle eingesetzt. 14 Tage nach der Operation wurde mit einem speziell angefertigten Aufblasrohr das Innenvolumen des verbliebenen rechten Lungenlappens bestimmt.

Das durchschnittliche Volumen der rechten Lunge bei den fünf PNX-behandelten Mäusen betrug etwa 1,4 Milliliter, was signifikant größer war als die 1,05 Milliliter bei den fünf Mäusen mit Prothesenimplantat. Auch die MLI-Werte in den verbliebenen rechten Lungen waren signifikant erhöht. Anhand dieser Parameter wurde die innere Oberfläche der Lunge berechnet und erwies sich bei den Mäusen mit Prothesenimplantat als signifikant geringer.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die innere Lungenoberfläche für das Mausmodell der mechanisch induzierten alveolären Regeneration berechnet wird.