Name: Kryokonservierung von Zebrafisch-Spermatogonien durch ganze Hoden Nadel eingetaucht, ultra-schnelle Abkühlung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Kryokonservierung ganzer Zebrafisch-Hoden durch nadeltauchbasierte Vitrifikation. Diese Methode ermöglicht die sichere Lagerung von Keimzellen für Transplantationen und erleichtert die Isolierung von Spermatogonien.

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Diese Studie wurde unterstützt durch die nationalen Forschung, Entwicklung und Innovation Office von Ungarn (Grant 116912, ÁH), COST-Büros (Lebensmittel und Landwirtschaft COST Action FA1205: AQUAGAMETE), das Stipendium Hungaricum Stipendienprogramm (Finanzhilfe für ZM) "und" die neu Ungarische nationale Excellence Predoctoral Fellowship (Stipendium, EK).

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den ungarischen Tierschutzgesetz genehmigt.
(1) Reagenz Vorbereitung
<ol><li>Stammlösungen<ol>
<li>Bereiten Sie 1 M Trehalose durch Zugabe von 0,378 g Trehalose Dihydrat in 1 mL der dH2O. Mix gut, bis es vollständig auflöst.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 M Saccharose durch Zugabe von 0,342 g Saccharose in 1 mL der dH2O. Mix gut, bis es vollständig auflöst.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 M HEPES durch Zugabe von 0,238 g HEPES zu 1 mL von dH2O. Mix gut, bis es vollständig auflöst.</li>
		<li>Bereiten Sie 20 mg/mL Kollagenase (290 U/mg vor) durch Zugabe von 100 mg bis 5 mL PBS. Mischen Sie gründlich, bis es sich auflöst. Sterilfilter durch 0,2 µm-Filter. Aliquoten 50 µL in 0,2 mL PCR-Röhren und frieren bei - 20 ° C.</li>
		<li>Vorbereiten von 15 mg/mL Trypsin (~ 10000 U/mg) durch Zugabe von 75 mg auf 5 mL PBS. Mischen Sie gründlich, bis es sich auflöst. Sterilfilter durch 0,2 µm-Filter. Aliquoten 50 µL in 0,2 mL PCR-Röhren und frieren bei - 20 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 mg/mL DNase ich (~ 3000 U/mg) durch Zugabe von 5 mg bis 5 mL PBS. Mischen Sie gründlich, bis es sich auflöst. Sterilfilter durch 0,2 µm-Filter. Aliquoten 50 µL in 0,2 mL PCR-Röhren und frieren bei - 20 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie 0,4 % Trypan blau 10 mL PBS 40 mg Trypan Blau hinzu. Sterilfilter durch 0,2 µm-Filter. Aliquoten 1 mL in 1,5 mL Röhrchen.</li>
		<li>Vorbereiten von 200 mg/L MS-222 (Tricaine Methan Sulfonate) durch Zugabe von 200 mg von MS-222 in 1 L dH2O. Mix gut, bis es vollständig auflöst. Darüber hinaus die MS-222 Pufferlösung mit Natriumbicarbonat zu einem neutralen pH-Wert von 7,0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lösungen für Verglasung<ol>
<li>Bereiten Sie Gleichgewichtherstellung Lösung (ES): bereiten Sie 2 mL ES durch Mischen 121,5 µL von Methanol (MeOH; 1,5 M), 220 µL von Propylenglykol (PG, 1,5 M), 200 µL des FBS (10 %), 200 µL Trehalose-Stammlösung (0,1 M), 50 µL der Stammlösung HEPES (25 mM) und 1208.5 µL des L-15 in ein 2 mL-Tube.</li>
		<li>Bereiten Vitrification Lösung (VS): 2 mL VS durch das Mischen von 439 µL PG (3 M), 426 µL Dimethyl Sulfoxid vorbereiten (mir2SO; 3 M), 200 µL des FBS (10 %), 200 µL der Stammlösung Trehalose (0,1 M), 50 µL HEPES Lager-Lösung (25 mM) und 685 µL des L-15 in eine 2 mL-Tube.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lösungen für die Erwärmung<ol>
<li>Bereiten Sie wärmende Lösung 1 (WS1): bereiten Sie 1,5 mL WS1 in einer 2 mL-Tube durch Mischen 150 µL des FBS (10 %), 450 µL der Stammlösung Saccharose (3 M) und 900 µL des L-15.</li>
		<li>Bereiten Sie wärmende Lösung 2 (WS2): bereiten Sie 1,5 mL WS2 in einer 2 mL-Tube durch Mischen 150 µL des FBS (10 %), 150 µL der Stammlösung Saccharose (1 M) und 1200 µL des L-15.</li>
		<li>Bereiten Sie wärmende Lösung 3 (WS3): bereiten Sie 1,5 mL WS2 in einer 2 mL-Tube durch Mischen 150 µL EB (10 %) und 1350 µL des L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufschlusslösung vorzubereiten: für jede Probe vorbereitet 500 µL der Verdauung-Lösung durch das Mischen von 50 µL der Stammlösung Kollagenase (2 mg/mL), 50 µL der Stammlösung Trypsin (1,5 mg/mL), 10 µL der DNase I (20 µg/mL) und 390 µL des L-15 in einer 2 mL tube.</li>
	<li>Dissektion Werkzeuge erhalten: Schere, Microscissors, Pinzetten, gebogenen Pinzette und Akupunkturnadeln.</li>
</ol>2. Hoden Sammlung
<ol><li>Die Fische einzuschläfern, indem man es in eine Schale mit 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Stellen Sie bevor Sie fortfahren mit der Dissektion sicher, dass die Kiemen haben aufgehört sich zu bewegen und, dass mindestens 10 min vergangen seit diesem Moment Tod durch Hypoxie zu gewährleisten.</li>
	<li>Trocknen Sie die Fische durch klopfen sie auf einem Papiertuch und legen Sie es auf der dorsalen Seite auf einen sezierenden Mat.<ol>
<li>Erstens die Becken- und Brust Flossen für einfacher Dissektion abgeschnitten.</li>
		<li>Horizontal schnippeln Sie die Haut auf dem Bauch des Fisches zwischen den Brustflossen und schneiden Sie die Haut und die darunter liegenden Muskeln entlang der Bauch bis die Afterflosse.</li>
		<li>Öffnen Sie die Körperhöhle des Fisches und Heften Sie den linken und rechten Körperwand auf die Dissektion Matte mit Nadeln. Hinweis: Hoden befinden sich über den Magen-Darm-Organe auf beiden Seiten der Schwimmblase (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um Verunreinigungen zu vermeiden, nicht nehmen die Magen-Darm-Organe, aber sanft zur Seite schieben und Entfernen des Hodens von der gegnerischen Seite. Hoden mit der Körperwand verbunden sind so sorgfältig zu entfernen und das verbindende Peritoneum durch Microscissors geschnitten.</li>
	<li>Zusätzlich, um Verunreinigungen zu vermeiden, erstens sterilisieren die Hoden, indem man sie in 70 % igem Ethanol für 2 s, und legen Sie dann Sie in L-15 auf einer 96-Well-Platte auf dem Eis. Hinweis: Wenn es notwendig ist, Blutgefäße saubere Hoden von Fettgewebe und große genau unter dem Stereomikroskop</li>
</ol>(3) Ultra-schnelle Abkühlung des Testikular-Gewebes
<ol><li>Mark Nadeln mit entsprechenden Etiketten je nach Probe geben und bereiten die Gleichgewichtherstellung (ES) und Verglasung Lösungen (VS).</li>
	<li>Übertragen Sie die Hoden auf eine größere well-Platte oder Schüssel und Stift zwei bis drei Hoden (oder mehr je nach Größe der Nadel) auf eine sterile Akupunkturnadel.<ol>
<li>Positionieren Sie zunächst den Hoden auf gebogenen Pinzette. Legen Sie die Spitze der Nadel in der Mitte der Hoden und ziehen Sie vorsichtig die Hoden nach oben mit der Pinzette.</li>
		<li>Ziehen Sie nach der Punktion des Hodens es vorsichtig nach oben in Richtung der Spitze der Nadel. Stellen Sie sicher die Hoden voneinander getrennt sind und dass sie nicht herunterfallen oder Abrutschen.</li>
		<li>Ort der Nadeln mit angehefteten Hoden in einem 2 mL Röhrchen gefüllt mit L-15 bis Verglasung (bei 25 ° c; Lagerzeit sollte nicht mehr als 1 h). Hinweis: Fixieren die Hoden auf der Nadel sollte erfolgen schnell, um den Hoden Austrocknen verhindert wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie die Nadel mit Hoden in die Gleichgewichtherstellung Lösung und 5 min bei 25˚C inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Nadel in die Verglasung-Lösung und inkubieren Sie für 30 s bei 25˚C.</li>
	<li>Entfernen Sie die Nadel aus der Vitrifikation Lösung, nehmen Sie schnell und schonend die restliche Lösung aus dem Gewebe von einem sterilen Papiertuch auf. Seien Sie vorsichtig, um den Hoden festhalten an das Papiertuch oder Herunterfallen zu vermeiden.</li>
	<li>Legen Sie die Nadel schnell in flüssigen Stickstoff in einer Styropor-Box gelegt. Hinweis: Führen Sie diesen Schritt schnell zu des Gewebes um die Flüssigstickstoff-Dampf zu vermeiden. Verwenden Sie geringe Mengen an flüssigem Stickstoff, um Cross-Kontamination der Proben zu vermeiden.</li>
	<li>Halten Sie die Nadel in flüssigem Stickstoff in eine geschlossene Styropor-Box für 5-10 min.</li>
	<li>PreCool, eine geöffnete 4,5 mL Cryotube und seine Mütze in der gleichen Box.</li>
	<li>Übertragen Sie nach ca. 5-10 min jede Nadel in eine separate Cryotube unter der Oberfläche des flüssigen Stickstoffes und schließen Sie die Cryotube. Achtung: Verwenden Sie immer Schutzkleidung (z. B. isolierte Handschuhe) beim Arbeiten mit flüssigem Stickstoff Exposition kann zu schweren Erfrierungen führen.</li>
	<li>Legen Sie die Cryotube auf dem Metall Rohrstock und legen Sie sie so schnell wie möglich in der Kryobank Kanister. Speichern Sie die Proben in einem Kanister Speicher Dewar bis zur weiteren Verwendung.</li>
</ol>4. Erwärmung Verfahren
<ol><li>Jede Nadel separat zu wärmen. Alle Erwärmung Lösungen sollte bei 25 ° C.</li>
	<li>Lösen Sie die Cryotube aus dem Metall Rohrstock und Tauchen Sie es in flüssigen Stickstoff in einer Styropor-Box gespeichert.</li>
	<li>Öffnen Sie die Cryotube im flüssigen Stickstoff Dampf (mit Pinzette) und lassen Sie die Nadel in den flüssigen Stickstoff.</li>
	<li>Übertragen Sie die Nadel sehr schnell in die erste wärmende Lösung und inkubieren Sie für 1 min (bei 25 ° C). Achten Sie darauf, die Nadel schnell, um zu verhindern, dass die Erwärmung in der Luft während der Übertragung zu übertragen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Nadel in die zweite Erwärmung Lösung und inkubieren Sie für 3 min (bei 25 ° C).</li>
	<li>Übertragen Sie die Nadel in die dritte wärmende Lösung und inkubieren Sie für 5 Minuten (bei 25 ° C).</li>
	<li>Lassen Sie die Hoden von der Nadel, indem Sie sie nach unten mit gebogenen Pinzette. Ort jeder erwärmte Hoden einzeln in einen separaten Brunnen (96-Well-Platte) mit 250 µL L-15 ergänzt mit 10 gefüllt % FBS. Stellen Sie sicher, dass der Brunnen nach der Probe beschriftet sind. Halten Sie die well-Platte auf Eis, bis alle Proben erwärmt werden und bis zum weiteren arbeiten.</li>
</ol>(5) Gewebe Verdauung
<ol><li>Bereiten Sie 500 µL der Dissoziation-Lösung für jede Probe in separaten 2-mL-Tuben. Beschriften Sie die Rohre nach dem Code der Probe. Inkubieren Sie die vorbereiteten Dissoziation Lösung für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Fügen Sie das erwärmte Gewebe in der Aufschlusslösung und durch mindestens 30 Bewegungen der kleinen Schere in kleine Stücke schneiden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die geschnittenen Gewebe auf einem schütteln Teller für 90 min bei 25 ° c.</li>
	<li>Beenden Sie den Verdauungsprozess durch Zugabe von 400 µL L-15 und 100 µL der FBS (10 % FBS V/V). Kurz schütteln Sie die Lösung und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Filtern Sie die erhaltene Lösung durch 50 µm Filter in einem 1,5 mL-Tube. Beschriften Sie die Rohre entsprechend.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die gefilterte Lösung bei 200 × g für 10 min bei 25 ° c.</li>
	<li>Nehmen Sie den Überstand vorsichtig und Aufschwemmen der Pellets in 20 µL L15 ergänzt mit 10 % FBS. Manuell schütteln Sie das Rohr, bis die Tablette vollständig aufgelöst ist. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis oder bei 4 ° c bis zur weiteren Verwendung.</li>
</ol>6. Wirtschaftlichkeit Bewertung und Zellzählung
<ol><li>Mix 5 µL Zellsuspension und 5 µL 0,4 % Trypan blau-Lösung in einem entsprechend gekennzeichneten 0,2 mL PCR-Rohr. Wenn unterschiedliche Volumina verwendet werden, stellen Sie sicher, dass das Verdünnungsverhältnis von 1:1 bleibt.</li>
	<li>Inkubieren Sie diese Aussetzung für 1 bis 3 min bei Raumtemperatur (25 ° C).</li>
	<li>Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit jeder Probe in einem Hemocytometer unter die Lupe genommen.</li>
	<li>Die Anzahl der lebenden Zellen (unbefleckt von Trypan blau) in 15 Feldern. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen in der Zellsuspension 20 µm. Die Suspension ist jetzt für alle nachgelagerten Anwendungen bereit. Hinweis: Verwenden Sie bei der Optimierung von Verfahren für andere Arten mit größeren Körpergröße Hoden Fragmente von gleichem Gewicht. Verwenden Sie Hoden von einem Individuum für alle experimentellen Gruppen um individuelle Variabilität in den Ergebnissen zu vermeiden. Im Falle der Zebrafisch, wir nutzten die Tatsache, dass links und rechts Hoden sollte eine gleiche (oder ähnliche) Anzahl von Keimzellen13 enthalten (siehe die Vertreter-Ergebnisse). Der linke Hoden wurde als Kontrolle gehalten, während der Rechte Hoden verglast/erwärmt wurde. Lebensfähigkeit Prozentsatz wurde berechnet die Anzahl der Zellen isoliert im Vergleich zu der Anzahl der Zellen isoliert von den frischen Hoden Hoden verglast/erwärmt.</li>
</ol>

<ol><li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research%3A+Importance%2C+impact%2C+status%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Hauptziel dieser Studie war Anpassung die Nadel ultra-schnelles Kühlungs Verfahren entwickelt für Vögel und Säugetiere Arten10,11,12 , die Kryokonservierung von Fisch Hoden (Zebrafisch als Modell eingetaucht Organismus). Die meisten der bisherigen Studien zur Kryokonservierung von Zebrafisch genetischer Ressourcen konzentrierten sich in erster Linie auf Kryokonservierung von Zebrafisch Sperma2,</...

Neue Trends in Wissenschaft und Biotechnologie führten zur Schaffung von Tausenden von mutierten Neuanlagen von Mäusen, Drosophila, Zebrafisch und andere Arten als Modellorganismen im Biomedizin und anderen Wissenschaften1verwendet. Darüber, wie neue Technologien entwickelt und zur Verfügung stehen, die Nummern der mutierten Linien ständig steigen2. Dies führt zu der Notwendigkeit für eine sichere Lagerung der genetischen Ressourcen über die gemeinsame Praktiken Brutkolonien zu halten. Als eine Methode, die sichere Lagerung von genetischen Ressourcen für eine unbestimmte Zeit ermöglicht, Kryokonservierung bietet viele Vorteile, wie Erweiterung der Paarungszeit, umgeht die Notwendigkeit für die kontinuierliche Wartung der Brutbeständen, und es mehr Kosten ist - und Arbeit-effiziente2.
Protokolle für die Kryokonservierung von Spermien entwickelte sich während der letzten mehrere Jahre2,3,4 bieten die Möglichkeit für erfolgreiche Speicherung von Zebrafisch männliche Erbgut. Kryokonservierung von Eizellen oder Embryonen in den Fischen ist jedoch noch nicht möglich aufgrund ihrer komplexen Struktur und große Mengen von Eigelb Material. Vor kurzem, die Praxis der Transplantation von primordialen Keimzellen (PGCs) oder spermatogonial Stammzellen (SSCs) bietet einen Bypass um diese Barriere durch die Entwicklung in funktionale Spermien und Eizellen nach Transplantation5. Kryokonservierung von SSCs bietet daher eine neue Grenze in der Erhaltung der seltenen und wertvollen genetischen Ressourcen.
Obwohl Kryokonservierung viele Vorteile bietet, erzeugt die langsame Geschwindigkeit Gefrierprozess mehrere Bedingungen, die zu Zelle Schaden2führen können. Dazu gehören intrazelluläre und extrazelluläre Eisbildung, Dehydrierung und Kryoprotektivum Toxizität. Intrazelluläre Eis schädigt die Zellen, extrazelluläre Eis führen zu mechanischen Zerkleinerung von Zellen, während die Diffusion von Wasser aus den Zellen während langsamen Rate Einfrieren zu Dehydrierung6führen kann. Vor kurzem wurde Verglasung als eine Technik, die verhindert, die negativen Auswirkungen der Eisbildung dass in der Konservierung von Fisch Gameten7,8,9angewendet. Es stellt einen ultra-schnellen Kühltechnik, durch die die internen und externen Medien in eine amorphe/Glaszustand verwandeln, ohne kristallisieren in Eis7,10. Erfolgreiche Verglasung der Hoden und Eierstöcke Gewebe hat Vogelgrippe und Säugetier Arten10,11,12, in Fisch, sowie Möglichkeiten für seine Anwendung womit belegt.
In dieser Studie stellen wir die Nadel eingetaucht Verglasung (NIV) Verfahren für die Kryokonservierung der gesamten Zebrafisch Hoden. Wir zeigen eine zuverlässige Methode für die Isolierung von Zebrafisch Frühphasen-Keimzellen ohne Verunreinigungen und eine Kryokonservierung Prozess, der relativ hohe Mengen an Frühphasen-Keimzellen mit einer geringen Präsenz von anderen Zellen, vor allem Spermien ergibt. Nach bestem Wissen und gewissen ist dies die erste Studie, die ein detailliertes visualisiertes Protokoll für ultra-schnelle Kühlung von Fisch Gonaden Gewebe und Zebrafisch Keimbahnzellen zu demonstrieren. Reproduzierbarkeit der Methode zeigt sich darüber hinaus in fünf verschiedenen Zebrafisch-Stämme: AB Wildtyp, Casper (Roy- / -; Perlmutt- / -), Leopard (Leot1/t1), Wasa [Tg (vas::eGFP)] und Wilms Tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgene Linie.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz media (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Ergänzt mit L-Glutamin</td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tricain-Methansulfonat (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Dihydrat</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Propylenglykol</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Reanal</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Phospat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tabletten zur Herstellung von 200 ml PBS-Lösung</td></tr></tbody></table>

kryokonservierung von zebrafisch-spermatogonien durch ganze hoden nadel eingetaucht, ultra-schnelle abkühlung

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Aktuelle Trends in Wissenschaft und Biotechnologie führen zur Schaffung von Tausenden von Neubaustrecken in Modellorganismen, wodurch die Notwendigkeit für neue Methoden zur sicheren Aufbewahrung von genetischen Ressourcen über die gemeinsame Praktiken Brutkolonien zu halten. Das Hauptziel dieser Studie war die Nadel anpassen Verglasung (NIV) Verfahren um ganze Zebrafisch Hoden Ovarialgewebe eingetaucht. Kryokonservierung von Frühphasen-Keimzellen von ganzen Hoden NIV bietet Möglichkeiten für die Lagerung von Zebrafisch genetische Ressourcen, vor allem, da sie nach der Transplantation zu männlichen und weiblichen Gameten heranreifen können. Hoden wurden herausgeschnitten, fixiert auf einer Akupunktur-Nadel, in zwei Cryoprotective Medien (Gleichgewichtherstellung Lösung mit 1,5 M Methanol und Propylen-Glykol 1,5 M; und Verglasung Lösung mit 3 M Dimethyl Sulfoxid und 3 M Propylenglykol) equilibriert, und stürzte sich in flüssigem Stickstoff. Proben wurden in einer Reihe von drei konsequente Erwärmung Lösungen erwärmt. Die wichtigsten Vorteile dieser Technik sind (1) das Fehlen von Spermien nach der Verdauung der erwärmte Hoden und erleichtert so die nachgelagerte Manipulationen; (2) Ultra-schnelle Kühlung ermöglicht die optimale Belichtung der Gewebe zu flüssigem Stickstoff, also die Maximierung der Kühlung und reduziert die benötigte Konzentration der Kryoprotektanten, wodurch sich ihre Toxizität; (3) synchron Exposition von mehreren Hoden Kryoprotektanten und flüssigem Stickstoff; und (4) Wiederholbarkeit durch den Erhalt der Lebensfähigkeit von über 50 % in fünf verschiedenen Zebrafisch-Stämme nachgewiesen.

Im Durchschnitt der Zahl der Frühphasen-Keimzellen isoliert von einem einzigen frischen Zebrafisch Hoden variiert zwischen 40.000 und 200.000 Zellen abhängig von der Größe des Fisches. Als frische Zebrafisch Hoden in allen 5 Stämme zu verdauen, waren frühen Keimzellen nicht die einzigen Zellen in der Zellsuspensionen (Abbildung 2). Neben dem Frühstadium Keimzellen fanden sich zahlreiche Spermien sowie. Auf der anderen Seite gab es weit weniger Spermien nach d...

Das Hauptziel dieser Studie war die Nadel anpassen Verglasung (NIV) Verfahren um ganze Zebrafisch Hoden Ovarialgewebe eingetaucht. Darüber hinaus wurde die Reproduzierbarkeit der Methode in fünf verschiedenen Zebrafisch-Sorten getestet.

Kryokonservierung von Zebrafisch-Spermatogonien durch ganze Hoden Nadel eingetaucht, ultra-schnelle Abkühlung

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

Die Kryokonservierung ermöglicht die Lagerung lebender Zellen und Gewebe bei tiefen Temperaturen über einen unendlichen Zeitraum, zumindest aus menschlicher Sicht. Vitrifizierung ist eine Form der Kryokonservierung, bei der eine ultrarapiden Abkühlung in einen glasartigen, amorphen Zustand erfolgt, ohne Bildung von kristallinem Eis und ohne die damit verbundenen Schäden. In diesem Video stellen wir das Protokoll zur Vitrifizierung ganzer Zebrafisch-Testes vor, das deren sichere Lagerung ermöglicht, bis sie später als Quelle von Keimzellen für die Transplantation in geeignete Empfänger verwendet werden.Das derzeitige Vitrifikationsprotokoll weist einen wesentlichen Vorteil gegenüber den Langsamschritt-Gefrierprotokollen im Hinblick auf die Manipulation von Keimstammzellen auf. Und zwar sterben die Spermatozoen nach der Vitrifizierung und dem Aufwärmen ab und werden entfernt, sodass sie in der Zellsuspension nicht vorhanden sind. Daher ist nach dem Aufwärmen keine Isolierung von Keimzellen erforderlich.Und das erleichtert die nachgeschalteten Manipulationen leicht. Töten Sie den Fisch, indem Sie ihn in eine Schale mit 200 Milligramm pro Liter MS-222 bei pH 7 geben. Stellen Sie vor Fortsetzung der Dissektion sicher, dass die Kiemenbewegungen aufgehört haben, und warten Sie mindestens 10 Minuten ab diesem Zeitpunkt, um den Tod durch Hypoxie zu gewährleisten.Trocknen Sie den Fisch, indem Sie ihn mit einem Papiertuch abtupfen, und legen Sie ihn auf die Bauchseite auf eine Präparationsunterlage. Schneiden Sie zuerst die Bauch- und Brustflossen ab, um die Dissektion zu erleichtern. Schneiden Sie die Haut horizontal am Bauch des Fisches zwischen den Brustflossen ein und schneiden Sie entlang des Bauches durch Haut und darunterliegende Muskulatur bis zur Afterflosse.Öffnen Sie die Körperhöhle des Fisches und heften Sie die linke und rechte Körperwand mit Nadeln auf der Präparationsunterlage fest. Die Hoden befinden sich oberhalb der Verdauungsorgane auf beiden Seiten der Schwimmblase. Um Kontaminationen zu vermeiden, nehmen Sie die Verdauungsorgane nicht heraus, sondern schieben Sie sie vorsichtig zur Seite und entnehmen Sie die Hoden von der gegenüberliegenden Seite.Die Hoden sind mit der Körperwand verbunden, daher vorsichtig entfernen und das verbindende Peritoneum mit einer Mikroschere durchschneiden. Zusätzlich, um Kontaminationen zu vermeiden, sterilisieren Sie die Hoden zuerst, indem Sie sie zwei Sekunden lang in 70 % Ethanol geben, und legen Sie sie anschließend auf eine mit Eis gekühlte 96-Well-Platte in L-15. Markieren Sie die Nadeln entsprechend der Probenart mit geeigneten Beschriftungen und bereiten Sie die Equilibrierungs- und Vitrifizierungslösungen vor.Übertragen Sie die Hoden in eine größere Mehrfach-Platte oder Schale und befestigen Sie drei oder mehr Hoden, abhängig von der Nadelgröße, an einer sterilen Akupakunadel. Zunächst platzieren Sie die Hoden auf gekrümmten Pinzetten. Setzen Sie die Nadelspitze in die Mitte des Hodens und ziehen Sie den Hoden vorsichtig mit der Pinzette nach oben.Nachdem Sie die Hoden punktiert haben, ziehen Sie sie vorsichtig nach oben in Richtung der Nadelspitze. Stellen Sie sicher, dass die Hoden voneinander getrennt sind und nicht abfallen oder nach unten rutschen. Legen Sie die Nadeln mit den fixierten Hoden in ein Tubulator-Eppendorf-Röhrchen, das mit L-15 bis zur Vitrifizierung bei 25 Grad gefüllt ist.Die Lagerzeit sollte eine Stunde nicht überschreiten. Übertragen Sie die Nadel mit den Testes in die Equilibrierungslösung und inkubieren Sie fünf Minuten bei 25 Grad. Übertragen Sie die Nadel in die Vitrifizierungslösung und inkubieren Sie 30 Sekunden bei 25 Grad.Entfernen Sie die Nadel aus der Vitrifizierungslösung. Saugen Sie die restliche Lösung vorsichtig und schnell mit einem sterilen Papiertuch ab. Achten Sie darauf, dass die Hoden nicht am Papiertuch haften bleiben oder herunterfallen.Stellen Sie die Nadel schnell in flüssigen Stickstoff in einer Styroporschachtel. Halten Sie die Nadel fünf bis zehn Minuten lang in flüssigem Stickstoff in einer geschlossenen Styroporschachtel. Kühlen Sie eine geöffnete 4,5-Milliliter-Kryoröhre und deren Verschluss in derselben Schachtel vor. Nach fünf bis 10 Minuten jede Nadel unter der Oberfläche von flüssigem Stickstoff in ein separates Kryoröhrchen überführen und das Kryoröhrchen verschließen. Das Kryoröhrchen auf einen Metallträger setzen und so schnell wie möglich in den Kryobankbehälter bringen. Die Proben bis zur weiteren Verwendung in einer Behälterlagerbox aufbewahren.Wärmen Sie jede Nadel einzeln auf. Alle Wärmebehandlungslösungen sollten 25 Grad betragen. Trennen Sie das Kryoröhrchen vom Metallträger und tauchen Sie es in flüssigen Stickstoff, der in einer Styroporschachtel gelagert ist.Öffnen Sie die Kryoröhre mit einer Pinzette im flüssigen Stickstoffdampf und geben Sie die Nadel in den flüssigen Stickstoff frei. Überführen Sie die Nadel sehr schnell in die erste Aufwärmösung und inkubieren Sie sie eine Minute lang. Achten Sie darauf, die Nadel rasch zu überführen, um ein Erwärmen an der Luft während des Transfers zu verhindern.Überführen Sie die Nadel in die zweite Aufwärmösung und inkubieren Sie drei Minuten lang. Überführen Sie die Nadel in die dritte Aufwärmösung und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Lösen Sie die Hoden von der Nadel, indem Sie sie mit gebogenen Pinzetten nach unten verschieben.Legen Sie jeden erwärmten Hoden einzeln in eine separate Vertiefung, die mit 250 Mikrolitern L-15 ergänzt durch 10 % FPS gefüllt ist. Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen gemäß der Probe beschriftet sind. Bewahren Sie die Mehrfachbrutschale auf Eis auf, bis alle Proben erwärmt sind und bis zur weiteren Verarbeitung.Die Dissoziationslösung für jede Probe in separaten 2-Milliliter-Röhrchen jeweils 500 Mikroliter herstellen. Die Röhrchen entsprechend dem Code der Probe beschriften. Die hergestellte Dissoziationslösung fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Gebe das erwärmte Gewebe in die Verdauungslösung und zerschneide es durch mindestens 30 Schnittbewegungen mit einer kleinen Schere in kleine Stücke. Inkubiere das Gewebe 90 Minuten lang auf einer schüttelnden Platte bei 24 Grad. Stoppe den Verdauungsvorgang durch Zugabe von 400 Mikrolitern L-15 und 100 Mikrolitern 10 % FBS.Lösen Sie die Lösung kurz an und inkubieren Sie sie eine Minute lang bei Raumtemperatur. Filtern Sie die erhaltene Lösung durch 50-Mikron-Filter in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Beschriften Sie die Röhrchen entsprechend. Zentrifugieren Sie die filtrierte Lösung 10 Minuten lang bei 200 × g und 25 Grad. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 20 µL L-15, ergänzt mit 10 % FPS. Schütteln Sie das Röhrchen manuell, bis das Pellet vollständig gelöst ist.Die Zellsuspension bis zur weiteren Verwendung auf Eis oder bei vier Grad lagern. Fünf Mikroliter Zellsuspension und fünf Mikroliter einer 0,4 %igen Trypanblau-Lösung in einer entsprechend beschrifteten 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen vermischen. Falls andere Volumina verwendet werden, sicherstellen, dass das Verdünnungsverhältnis von eins zu eins beibehalten wird.Die Suspension für eine bis drei Minuten bei 25 Grad inkubieren. Überprüfen Sie die Vitalität jeder Probe in einem Hämozytometer unter dem Mikroskop. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen, die nicht mit Trypanblau angefärbt sind, in 15 Feldern.Berechnen Sie die Gesamtanzahl der Zellen in 20 Mikroliter der Zellsuspension. Die Suspension ist nun bereit für jegliche nachgeschaltete Anwendung. Im Durchschnitt variiert die Anzahl der aus einem einzelnen frischen Zebrafischtetstis isolierten Keimzellen zwischen 40.000 und 200.000 Zellen, abhängig von der Größe des Fisches.Bei allen in dieser Studie verwendeten Zebrafisch-Linien führte das vorliegende Vitrifizierungsprotokoll zu durchschnittlichen Überlebensraten von 50 % und höher. Dies deutet auf eine günstige Überlebensfähigkeit und Wiederholbarkeit des vorgestellten Protokolls hin. Bei der Verdauung frischer Zebrafisch-Testes in allen fünf Stämmen fanden sich neben Keimzellen im Frühstadium auch zahlreiche Spermatozoen.Nach der Verdauung von kryo-konservierten Hoden war die Anzahl der Spermatozoen deutlich geringer, was darauf hindeutet, dass sie dieses Vitrifizierungsprotokoll nicht überleben und höchstwahrscheinlich während des Verdauungsprozesses eliminiert werden. Das in dieser Studie vorgestellte Vitrifizierungsprotokoll mit Nadeleintauchung bietet mehrere Vorteile bei der Kryokonservierung von Hodengewebsstücken. Erstens können mehrere Gewebestücke an einer Nadel befestigt werden, sodass sie gleichzeitig Kryoprotektiva und flüssigem Stickstoff ausgesetzt werden können.Außerdem ermöglicht diese Methode, dass sehr geringe Mengen von Kryoprotektiva an den Gewebestücken haften. Dadurch können höhere Abkühl- und Aufwärmraten verwendet werden. Ein wesentlicher Vorteil besteht darin, dass Spermatozoen diesen Protokollschritt nicht überleben, wodurch am Ende die Zellsuspensionen angereichert an Spermatogonien sind, was nachfolgende Anwendungen erleichtert.Doch eine Sache, die berücksichtigt werden muss, ist die Möglichkeit einer Kreuzkontamination über Stickstoff. Daher sollte flüssiger Stickstoff bei Verwendung dieser Methode nicht wiederverwendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dies ist ein High-Throughput-Spermien Kryokonservierung Protokoll für Zebrafisch. Sperma kryokonserviert mit diesem Protokoll hat einen Durchschnitt von 25% der Fruchtbarkeit in späteren vitro-Fertilisation und ist über viele Jahre stabil.

Ein High-Throughput-Methode für Zebrabärblinge Sperma Kryokonservierung und In Vitro Fertilisation

Dies ist ein Verfahren zur Erzeugung gynogenetic diploid Zebrafischembryonen (Embryonen, deren einzige genetische Beitrag kommt von der Mutter) durch die Blockierung der zweiten Reifeteilung unmittelbar nach der Befruchtung mit UV-Licht-inaktivierten Sperma. EP Embryonen sind nicht vollständig homozygot durch Rekombination während der ersten meiotischen Teilung, aber sie sind homozygot überhaupt loci, die nicht von ihrem Zentromer wurden durch Rekombination getrennt.

Machen Gynogenetic Diploid Zebrafisch von Anfang Druck

In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zur Vitrifizierung von entnommenen Kaninchenembryonen im gewünschten Entwicklungsstadium unter Verwendung von Ethylenglykol und Dimethylsulfoxid als Kryoprotektiva und kryogenem Stroh als Trägersystem. Die vitrifizierten Embryonen haben eine hohe Überlebensrate und können über einen längeren Zeitraum bis zur Verwendung gelagert werden.

Vitrifizierung von Kaninchenembryonen mit kryogenem Strohhalm: eine ultraschnelle Kühltechnik zur Konservierung von Kaninchenembryonen für die Langzeitlagerung

Der Zebrafisch ist aufgrund seiner genetischen Ähnlichkeit mit höheren Wirbeltieren ein leistungsfähiges Modellsystem für die Entwicklungsbiologie und die Erforschung menschlicher Krankheiten. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung haploider Zebrafischembryonen, die für Forward-Screening-Strategien verwendet werden können, um rezessive Mutationen in Genen zu identifizieren, die für die frühe Embryogenese essentiell sind.

Die Produktion von Haploid Zebrafischembryonen durch<em&gt; In-vitro-</em&gt; Düngung

Die Verwendung von Zebrafischen für die Herz-Kreislauf-Forschung weitet sich auf die Forschung an erwachsenen Herzen aus. Für diese Anwendungen ist die schnelle und einfache Isolierung von Herzgewebe von entscheidender Bedeutung, um postmortale Veränderungen zu vermeiden und eine ausreichende Anzahl von Proben zu erhalten. Hier beschreiben wir eine schnelle und reproduzierbare Methode zum Präparieren von adulten Zebrafischherzen.

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

Wiederholte Blutentnahme ist notwendig und wichtig in Tierversuchen. Wir haben eine neuartige, nicht-letale und zuverlässige Methode zur wiederholten Blutentnahme von adulten Zebrafischen entwickelt und diese Methode auf die Untersuchung der Blutbiochemie, einschließlich des Glukosestoffwechsels, angewendet.

Wiederholte Blutentnahme für Bluttests in Adult Zebrafisch

Ein modifiziertes Protokoll zur Ploidie Manipulation verwendet einen Hitzeschock eine Ein-Zyklus-Stall in cytokinesis im frühen Embryo zu induzieren. Dieses Protokoll wird in dem Zebrafisch gezeigt, sondern kann auf andere Arten anwendbar.

Ploidy Manipulation von Zebrafischembryonen mit Heat Shock 2 Behandlung

Nukleare Oberflächenausbreitungen sind ein unverzichtbares Werkzeug, um Chromosomenereignisse während der Meiose zu untersuchen. Hier zeigen wir eine Methode zur Vorbereitung und Visualisierung meiotischer Chromosomen während der Prophase I aus Zebrafisch-Spermatozyten.

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

Hier stellen wir eine einfache Methode zur Trennung von Follikelzellen und Eizellen in Zebrafisch-Ovarialfollikel vor, die Untersuchungen der Eierstockentwicklung bei Zebrafischen erleichtern.

Trennung von Follikulärzellen und Oozyten in Denrogarischen Follikel von Zebrafischen

Die CRISPR-Cas-Technologien haben die Genom-Editierung revolutioniert. Das Finden und Isolieren der gewünschten Keimbahnreduktion bleibt jedoch ein großer Engpass. Daher beschreibt dieses Protokoll eine robuste Methode zum schnellen Screening von F0 CRISPR-injizierten Zebrafischspermien auf Keimbahn-Editierungen unter Verwendung von Standard-PCR-, Restriktionsverdauungs- und Gelelektrophoresetechniken.

Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch

Dieses Protokoll beschreibt ein modifiziertes Verfahren zur schnellen Isolierung sauberer Eizellen im Stadium I in Zebrafischen ohne Granulosazellen und bietet damit eine geeignete Methode für die eizellspezifische Forschung.

Schnelle Isolierung von Eizellen im Stadium I bei Zebrafischen ohne Granulosazellen

Erfahren Sie die Kryokonservierung ganzer Zebrafisch-Hoden durch nadeltauchbasierte Vitrifikation. Diese Methode ermöglicht die sichere Lagerung von Keimzellen für Transplantationen und erleichtert die Isolierung von Spermatogonien.

Kryokonservierung von Zebrafisch-Spermatogonien durch ganze Hoden Nadel eingetaucht, ultra-schnelle Abkühlung

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