Name: In Situ MHC-Tetramer Färbung und Quantitative Analyse zur Bestimmung der Lage, Fülle und Phänotyp der Antigen-spezifische CD8-T-Zellen in den Geweben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Lernen Sie die In-situ-MHC-Tetramer-Färbung zur Lokalisierung, Quantifizierung und Phänotypisierung antigen-spezifischer CD8-T-Zellen in Geweben. Diese Methode ermöglicht räumliche Analysen immunologischer Prozesse.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von Public Health Service Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

1. 1. Tag: frisches Gewebe schneiden und primäre Inkubation <ol><li>Verwendung eines Skalpells frische Gewebe in kleine (ca. 0,5 cm breit von 0,5 cm groß) Stücke schneiden. Separat kleben Sie jedes Gewebe, einem Kolben und eingebettet in PBS mit 3-5 mL 4 % Low-Melt Agarose. Kennzeichnen Sie den Kolben mit der Gewebe-Informationen mit einem Aufkleber. Legen Sie es in ein gekühltes Halter in einem Eiskübel zu festigen.</li>
	<li>Schalten Sie das Mikrotom und setzen die Dicke der Querschnitte 200 µm. Installation einer Rasierklinge auf dem Mikrotom und legen Sie den Kolben mit Gewebe in der Badewanne Mikrotom montiert.</li>
	<li>Bereiten Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Heparin (PBS-H) durch Zugabe von 100 µg/mL oder 18,7 U/mL Heparin, PBS, die RNA zu bewahren und ISH Anwendungsmöglichkeiten stromabwärts zu ermöglichen. Füllen Sie das Mikrotom-Bad, für das eingebettete Gewebe mit 100-120 mL gekühlten, sterile PBS-H. PBS-H Eiswürfel hinzufügen, um das Bad, die Temperatur bei 0 - 2 ° C. Start Mikrotom und Schneiden des Gewebes in 200 µm Abschnitte. 
	Hinweis: Es ist wichtig, dass das Gewebe gekühlt auf Eis, zelluläre Aktivität im Gewebe zu minimieren und da frische Gewebe ist leichter zu Abschnitt, wenn sie gekühlt wird. PBS allein kann verwendet werden, wenn es keine Pläne für nachgeschaltete ISH.</li>
	<li>Alternativ für Gewebe, die nicht gut mit einem Mikrotom (z.B., Darm und Lunge), Schneiden verwenden ein Skalpell oder einer Rasierklinge, schneiden Sie das Gewebe in dünne Streifen als möglichst nahe an 200 µm.</li>
	<li>Beschriften Sie den Deckel des 24-Well-Zellkultur-Platten mit den experimentellen Probeninformationen und legen Sie die Gewebe-Kammern in den entsprechenden Vertiefungen. Verwenden ein Pinsel in den Abschnitten zu einer Gewebe-Kammer übertragen in den Brunnen einer Gewebekultur 24-Well-Platte mit 1 mL PBS-H. gekühlt 
	Hinweis: Wiederverwendbaren Kammern sollten vor Einleitung Färbung vorgenommen werden. Gewebe-Kammern können erfolgen mit einem 14 mL Polypropylen Rundboden Snap-Cap Rohr und Drahtgeflecht. Verwenden Sie eine scharfe Rasierklinge ein 14 mL Polypropylen Rundboden Snap-Cap Rohr unten abgeschnitten. Schneiden Sie das Drahtgeflecht in einem Kreis um das Loch an der Unterseite des Rohres zu passen. Hitze der Wire Mesh Kreis mit dem Bunsenbrenner, bis es glühend ist. Setzen Sie Wire Mesh Kreis sehr schnell ab und schieben Sie den Schlauch auf das Netz. Überprüfen Sie, dass das Drahtgeflecht ist sicher an der Unterseite des Rohres befestigt und dann vorsichtig die Spitze des Rohres an der 3 mL-Marke mit einer scharfen Rasierklinge abgeschnitten. Legen Sie bis zu 3 Gewebeschnitte in jedes Gewebe Patronenlager oder bis zu 1 cm 2 des Gewebes pro Bohrloch. Halten Sie mindestens einen leeren Brunnen zwischen Brunnen mit verschiedenen Antikörper Kombinationen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.</li>
	<li>Gehen Sie zu den primären Tetramer und Antikörper Färbung unmittelbar nach Abschluss der Übertragung alle Zuschnitte in die Gewebe-Kammern. Halten Sie die Abschnitte unter Wasser und in 1 mL PBS-H stets gekühlt.</li>
	<li>Brüten die Gewebeschnitte Übernachtung mit 0,5 µg/mL FITC konjugiert, Peptid beladenen MHC-ich Tetramers im PBS-H mit 2 % normalem Ziegenserum (NGS) verdünnt. Maus oder andere-Kaninchen-Antikörper gegen extrazelluläre Epitope des Interesses an dieser Inkubation enthalten (z. B. Ratte Anti-CD8 Antikörper verdünnt 1: 500 im PBS-H mit 2 % NGS). Legen Sie 1 mL der verdünnten Antikörper in jede Vertiefung. 
	Hinweis: Vorsicht bei der Auswahl der CD8-Antikörper, wie einige verbessern können und einige MHC Tetramers Bindung an T-Zell-Rezeptoren 4 , 21 hemmen können. Die Ratte Anti-Human CD8 Antikörper hier beschriebenen ist instabil und manchmal etwas schwache Färbung ergibt. Es dient hier zur dreifachen bezeichnen, denn es das einzige nicht-Kaninchen ist und -Maus-CD8-Antikörper, dass gefärbten Rhesus Makake CD8 T-Zellen getestet.</li>
	<li>1 mL der Lösung pro Bohrloch für Primärantikörper und alle nachfolgenden Inkubationen verwenden, und führen Sie diese und alle nachfolgenden Inkubationen bei 4 ° C, mit den Platten auf einem schaukelnden Plattform. 
	Hinweis: Gewebe sollte frei im Raum schweben.</li>
</ol> 2. Tag 2: Fixierung und sekundäre Inkubation <ol><li>Abschnitt zweimal mit 1 mL gekühlten PBS-H 20 min waschen nach der primären Inkubation jedem Waschgang. Tun Sie dies durch die Übertragung der Gewebe-Kammern zu einer verschiedenen 24-Well-Zellkultur-Platte mit 1 mL gekühlten PBS-H in den entsprechenden Vertiefungen. 
	Hinweis: Achten Sie darauf, Inhalte aus einem experimentellen Probe in ein anderes tropft beim Wechsel zwischen Gewebe Kammern. Für alle nachfolgenden Inkubationen und Waschungen ähnlich übertragen Sie die Gewebe-Kammer auf einen sauberen Teller mit der entsprechenden Lösung. Achten Sie darauf, die Abschnitte in den Gewebe-Kammern zu überwachen, während des Verfahrens um sicherzustellen, dass die Abschnitte nicht zu den Seiten der Gewebe Kammern stecken zu tun. Wenn sie sie zurück in die Lösung, drücken wollen,.</li>
	<li>Befestigen Sie die Abschnitte mit 1 mL frisch PBS-gepufferte 4 % Paraformaldehyd für 2 h bei Raumtemperatur (nicht über fix). Waschen mit kaltem PBS-H zweimal für 5 min. 
	Achtung: Paraformaldehyd ist giftig; Tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung. 
	Hinweis: Ggf. Antigen-Retrieval und Permeabilisierung ist intrazellulären Epitope erkennen Antigene können abgerufen werden durch Kochen in den Abschnitten in 0,01 Mol Harnstoff nach der Fixierung von Paraformaldehyd.</li>
	<li>In den Abschnitten in Kultur 24-Well-Platten mit 0,01 Mol Harnstoff und diese Platten in einem Mikrowellenherd. Kochen Sie in den Abschnitten drei Mal für ca. 10 s jeweils für insgesamt 30 s. 
	Hinweis: Seien Sie sehr vorsichtig, wie kochendes kann die Lösung erzwingen, dass die Abschnitte aus dem Brunnen. In diesem Fall verwenden Sie einen Pinsel in den Abschnitten von den Seiten der Kammer Gewebe oder aus dem Deckel der Platte in den Boden der Kammer entsprechende Gewebe zurückzudrängen.</li>
	<li>Vor, die Sekundärantikörper Inkubation, permeabilize und blockieren die Gewebeschnitte von brüten sie in blockierende Lösung mit PBS-H, 0,3 % Waschmittel (PBS-H-T) und 2 % NGS auf einer Wippe für 1 h bei 4 ° c führen nachfolgende Antikörper Inkubationen mit PBS-H-T/2% NGS.</li>
	<li>Für die sekundäre Inkubation, die Abschnitte in den Gewebe-Kammern an Brunnen mit Kaninchen Anti-FITC Antikörper verdünnt 1: 10.000 in PBS-H-T/2% NGS übertragen. Über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Perform Gegenfärbung mit Maus Anti-CD20-Antikörper verdünnt 1: 200 in PBS-H-T/2% NGS. Für diese Option Abrufen der Epitope bei Bedarf, die Zellen zu durchdringen und vor diese Inkubation zu blockieren, wie oben beschrieben.</li>
</ol> 3. 3. Tag: Tertiäre Inkubation <ol><li>nach der zweiten Inkubation, waschen Sie die Abschnitte dreimal in PBS-H bei 4 ° C für mindestens 20 min.</li>
	<li>Durchführen eine endgültigen Inkubation mit dem entsprechenden Eindringmittel beschriftet Antikörper (z. B. Ziege Anti-Kaninchen konjugiert grüngelb, Ziege Anti-Ratte konjugierten viel roten Farbstoff und Ziege Anti-Maus konjugierten grünen Farbstoff Antikörper verdünnt 1:5 000, 1:5, 000 und 1:2, 000, bzw. in PBS-H-T/2% NGS). Über Nacht inkubieren. 
	Hinweis: an dieser Stelle kann die Inkubationszeit bis zu drei Tage lang bei Bedarf erweitert werden. Halten Sie die Abschnitte vor Licht geschützt werden, indem man die Platten in Alufolie während dieser incuBallungsraum Schritt und danach jeweils Licht Fluorophore stillt.</li>
</ol> 4. Tag 4: Montage der Abschnitte <ol><li>waschen in den Abschnitten drei Mal im PBS-H für mindestens 20 min. 
	Hinweis: Wenn nachgeschaltete ISH 19 planen, befestigen Sie die Abschnitte in 4 % Paraformaldehyd für 1 h Tetramers und Antikörpern im Ort zu sichern und dann waschen Sie die Abschnitte zweimal mit PBS-H 5 min. 
	Achtung: Paraformaldehyd ist giftig; Tragen geeigneten persönlichen Schutzausrüstung.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Pinsel in den Abschnitten auf einen Objektträger übertragen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht zu viel Gewebe zu stecken. Bestreichen Sie jeden Abschnitt mit Glycerol/Gelatine, 4 mg/mL n-Propyl Gallat oder ein anderes Eindeckmittel mit einem Fluorophor Konservierungsmittel enthalten. Decken Sie mit einem Deckgläschen.</li>
	<li>Speichern die Folien in einem lichtgeschützt Folie Behälter bei-20 ° c spülen die Gewebekultur-Platten und entfernen Sie die Etiketten auf den Deckeln mit Alkohol. 
	Hinweis: Die Platten können wiederverwendet werden.</li>
</ol> 5. Erwerb von Confocal Mikroskop-Bilder <ol><li>Capture hochauflösende Bilder mit einem konfokalen Mikroskop, mit dem entsprechenden Laser und Filter für jede Fluorophor ( Abbildung 1A und B). 
	Hinweis: In diesem Beispiel ein confocal Mikroskop (siehe die Tabelle der Materialien) diente. Bilder wurden gesammelt mit dem 561 nm Laser bei 20 % Leistung für die grünlichen gelb beschriftet antigenspezifischen T-Zellen, der 488 nm Laser bei 10 % Leistung für Grün beschriftet B CD20 exprimierenden Zellen und 640 nm-Laser bei 15 % Leistung für CD8 T-Zellen weit rot gekennzeichnet. 20 X Objektiv und einer numerischen Apertur von 0,8 dienten.</li>
	<li>Sammeln sequenziell Z-Serie auf 3 µm (oder andere) Abständen in den drei Kanälen in mehreren Feldern 800 x 800 Pixel. Erstellen Sie eine Montage aus den erfassten Bereichen ( Abbildung 1 -E). Jede Montage Bild basierend auf den Informationen der entsprechenden Folie benennen und speichern Sie für die Analyse.</li>
	<li>Führen quantitative Bildanalyse mithilfe der jeweiligen confocal Mikroskop Analyse und Quantifizierung Software oder ImageJ.</li>
</ol> 6. Quantitative Bildanalyse Hinweis: Quantitative Bildanalyse mit confocal Mikroskop Analyse und Quantifizierung Software erreicht werden kann oder mittels ImageJ-Software. Hier, ImageJ diente als Beispiel.
<ol><li>Open a konfokale Montage durch Ziehen an den ImageJ-Fenster ( Abbildung 2A). 
	Hinweis: ImageJ kann direkt öffnen, Montagen von vielen verschiedenen konfokalen Mikroskopen gesammelt. Wenn die Montage von ImageJ direkt geöffnet werden kann, exportieren die ausgewählten Z-Scan als TIFF-Datei zu öffnen Sie it.</li>
	<li>Den ausgewählten Z-Scan für die Analyse zu duplizieren (&#34; Bild &#34;-&#62; &#34; doppelte &#34;) ( Abb. 2 b).</li>
	<li>Die verschiedenen Kanäle aufgeteilt (&#34; Bild &#34;-&#62; &#34; Farbe &#34;-&#62; &#34; Kanäle teilen &#34;) ( Abbildung 2).</li>
	<li>Zeichnen den ROI für die Quantitative Analyse in der entsprechende Kanal sein Ziel und Hinzufügen des ROI-Managers durch Drücken &#34; T &#34; auf der Tastatur. Messen Sie den Bereich. 
	Hinweis: Die ROI-Manager von ImageJ zeigt das Gebiet in µm 2 ( Abb. 2D).</li>
	<li>Fluoreszenz Helligkeit und Kontrast des Kanals zu analysierenden anpassen (&#34; Bild &#34;-&#62; &#34; Adjust &#34;-&#62; &#34; Helligkeit/Kontrast &#34;) ( Abb. 2E).</li>
	<li>Glätten den ROI auf das Bild (&#34; ROI-Manager &#34;-&#62; &#34; Flatten &#34;) ( Abb. 2F).</li>
	<li>Quantifizieren die positive Zellen in das Bild mit der &#34; multi-Point &#34; Tool ( Abbildung 2).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

IST in Kombination mit IHC stellt ein wesentliches Instrument für die Erkennung, Charakterisierung und Quantifizierung der Antigen-spezifische CD8 T-Zellen in nativen Umgebungen mit dem Kontext von anderen Zellen und Gewebestrukturen. Hier beschrieben wir detaillierte Verfahren für IST kombiniert mit IHC, gefolgt von quantitativen Bildanalyse zu bestimmen, die Lage, die Fülle und den Phänotyp der Antigen-spezifische CD8 T-Zellen in den Lymphknoten von Rhesus-Makaken. Ähnliche Färbung kann für Mensch, Maus oder andere Art...

T-Zellen sind entscheidend für viele immunologische Prozesse, einschließlich der Erkennung und Beseitigung von Virus-infizierten Zellen, verhindert Autoimmunität, Unterstützung bei der B-Zellen und Plasma-Zelle Produktion von Antikörpern und Aufspüren und eliminieren von Krebszellen. Die Entwicklung von Peptid/MHC Klasse I Tetramer Färbung des Antigen-spezifische CD8 T-Zellen1 und die neuere Entwicklung der MHC Klasse II Tetramer Färbung von CD4-T-Zellen-2 durch Durchflusszytometrie revolutioniert unsere Fähigkeit zu studieren und zu verstehen, die Immunbiologie der T-Zellen. Während äußerst nützlich für die Bestimmung der Menge und der Phänotyp der antigenspezifischen T-Zellen, lässt die Durchflusszytometrie nicht für den Nachweis von räumliche Lokalisation der antigenspezifischen T-Zellen auf andere Zellen und Strukturen in den Geweben, und aktuelle Disaggregation Techniken, die T-Zellen zu extrahieren benötigt für Durchflusszytometrie Wirksamkeit in nicht-lymphatischen Gewebe3begrenzt haben.
Wir und andere entwickelten Methoden mit Peptid beladenen MHC Klasse I und Klasse II Tetramer oder Multimer Reagenzien, Antigen-spezifische CD8 und CD4-T-Zellen im Gewebe4,5,6,7, beflecken 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. these IST Methoden ermöglichen die Bestimmung der Lage, die Fülle und den Phänotyp der Antigen-spezifische CD8 und CD4-T-Zellen in den Geweben und bieten eine Möglichkeit, diese Zellen im Vergleich zu anderen Zellen und Strukturen im Gewebe zu erkennen. Unsere Fraktion wird intensiv genutzt, MHC-ich Tetramer beflecken, zum studieren Human Immunodeficiency Virus (HIV)- und simian Immunodeficiencyvirus (SIV) - spezifischen CD8 T-Zellen im lymphatischen, genitalen und rektalen Gewebe um ein Verständnis von HIV und SIV Immunpathogenese und Korrelate des erfolgreichen Impfung Strategien14,15,16,17zu identifizieren. Darüber hinaus entwickelten wir auch eine Technik, die kombiniert IST mit in Situ Hybridisierung (ISH) zu lokalisieren und zu quantifizieren, Virus-spezifischen CD8 T-Zellen und Virus-infizierten Zellen in Geweben und zu bestimmen, die in Vivo -Effektor-zu-Zielwerte 18 , 19.
Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Peptid beladenen MHC-ich Tetramers Antigen-spezifische CD8 T-Zellen in frischen Gewebeschnitten zu Gegenfärbung Gewebe mit IHC beflecken und Zellen mit bestimmten Phänotypen in bestimmte Gewebe Fächer zu quantifizieren. Diese Verfahren sind die gleichen wie in unseren kürzlich erschienenen Publikation von Li Et Al., verwendet wurden, in denen wir die Lage, der Fülle und der Phänotyp der SIV-spezifische T-Zellen im lymphatischen Gewebe während chronische SIV-Infektion bei Makaken20bestimmt.
Für dieses Verfahren sind frische Gewebe geschnitten und über Nacht inkubiert mit Peptid beladenen MHC-ich Tetramers konjugiert zu Fluorescein Thiocyanat Moleküle (FITC). Sie sind dann in Paraformaldehyd fixiert. Nach der Fixierung des Gewebes, ist das Signal von der MHC-Tetramers verstärkt mit Kaninchen Anti-FITC Antikörper und inkubiert mit Gewebekulturen tagged Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, die das Signal von der gebundenen Tetramers weiter zu verstärken. IHC dient in Verbindung mit IST Antigen-spezifische T-Zellen und umgebenden Zellen zu charakterisieren. Antikörper, die Epitope auf der Oberfläche von Zellen oder in den Extrazellulärraum zu erkennen sind in der primären Inkubation mit dem Tetramers enthalten. Antikörper, die intrazellulären Epitope erkennen erfordern Durchdringung der Zellwand vor dem beflecken. Die gefärbten Gewebeschnitten sind abgebildet mit einem konfokalen Mikroskop und mittels konfokale Software analysiert. Markierte Zellen werden mit der konfokalen Mikroskopie Software oder ImageJ quantifiziert. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um im wesentlichen Antigen-spezifische CD8 T-Zellen in jedem Gewebe für die MHC färben-ich Tetramers stehen zur Verfügung.

<table><tbody><tr><td>MHC-I-Monomer</td><td>NIH Tetramer Core Facility</td><td></td><td>Materialien für die MHC-Tetramer-Aufbereitung</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>Materialien für die MHC-Tetramer-Aufbereitung</td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Low Melt</td><td>Agarose Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>SLBL6391V</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>J.T.Baker</td><td>4204-05</td><td></td></tr><tr><td>Glyceringelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>n-Propylgallat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>Antikörper instabil, eingefrorenes Aliquot</td></tr> <tr>zum Einmalgebrauch verwenden<td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>Vector</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-m-A488 (1:2.000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rb-Cy3 (1:5.000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>106232</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rat-Cy5 (1:5.000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5.000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>Kompresstom: VF-300 Microtome</td><td>Precisionary Instruments, LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>Quick Set Instant Adhesive</td><td>Loctite</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Gewebekulturplatten mit flachem Boden</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger Globe</td><td>scienfitic Inc.</td><td>#1321</td><td></td></tr><tr><td>Rasierer Klinge</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Feder Einweg-Skalpell</td><td>Feder Sicherheitsrasierer Co. Ltd.</td><td>Nr. 21</td><td></td></tr><tr><td>Runder Pinsel #2</td><td>PRINCETON ART & BÜRSTE CO.</td><td>4350R</td><td>Kann je nach Bedarf mit einem Rasierer getrimmt</td></tr><tr><td>werden Konfokalmikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ mhc-tetramer färbung und quantitative analyse zur bestimmung der lage, fülle und phänotyp der antigen-spezifische cd8-t-zellen in den geweben

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T-Zellen sind entscheidend für viele immunologische Prozesse, einschließlich der Erkennung und Beseitigung von Virus-infizierten Zellen, verhindert Autoimmunität, Unterstützung bei der B-Zellen und Plasma-Zelle Produktion von Antikörpern und Aufspüren und eliminieren von Krebszellen. Die Entwicklung der MHC-Tetramer Färbung von antigenspezifischen T-Zellen durch Durchflusszytometrie analysiert revolutioniert unsere Fähigkeit zu untersuchen und verstehen die Immunbiologie der T-Zellen. Während äußerst nützlich für die Bestimmung der Menge und der Phänotyp der antigenspezifischen T-Zellen, bestimmen nicht Durchflusszytometrie die räumliche Lokalisation der antigenspezifischen T-Zellen auf andere Zellen und Strukturen im Gewebe und aktuellen Disaggregation Techniken. zum Extrahieren der T benötigt Zellen für Durchflusszytometrie Wirksamkeit in nicht-lymphatischen Geweben eingeschränkt haben. In situ MHC-Tetramer Färbung (IST) ist eine Technik, T-Zellen zu visualisieren, die spezifisch für Antigene von Interesse im Gewebe sind. In Kombination mit Immunhistochemie (IHC) bestimmen IST die Fülle, Standort und Phänotyp der Antigen-spezifische CD8 und CD4-T-Zellen in den Geweben. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Flecken und Antigen-spezifischen CD8 T-Zellen, mit bestimmten Phänotypen befindet sich in bestimmte Gewebe Fächer aufzählen. Diese Verfahren sind die gleichen, die wir in unserem kürzlich erschienenen Publikation von Li Et Al., unter dem Titel verwendet "Simian Immunodeficiency Virus-produzierenden Zellen im Follikel werden teilweise unterdrückt durch CD8 Zellen+ In Vivo." Die beschriebenen Methoden sind breit anwendbar, weil sie verwendet werden, können um zu lokalisieren, Phänotyp, und im wesentlichen Antigen-spezifischen CD8 T Zelle für die MHC-Tetramers in jedem Gewebe vorliegen, zu quantifizieren.

Abbildung 1 veranschaulicht die konfokale Bilder mit einem konfokalen Mikroskop zu sammeln. Abbildung 2 veranschaulicht quantitative Bildanalyse mit ImageJ. Abbildungen 3 und 4 zeigen Vertreter, dass Bilder von Lymphknoten Gewebe aus einem SIV Rhesus-Makaken gebeizt mit MHC Tetramers, CD8-Antikörper und CD20-Antikörper infiziert, und dienen dazu, die Spezifität der MHC-Tetramer Färbung zeigen. <s...

Hier beschreiben wir eine Methode, die kombiniert in Situ MHC-Tetramer Färbung mit Immunohistochemistry, Lokalisierung, Phänotyp und Menge an Antigen-spezifische T-Zellen im Gewebe zu bestimmen. Dieses Protokoll wird verwendet, um die räumliche und phänotypischen Merkmale der Antigen-spezifische CD8 T-Zellen im Vergleich zu anderen Zelltyp und Strukturen im Gewebe zu bestimmen.

In Situ MHC-Tetramer Färbung und Quantitative Analyse zur Bestimmung der Lage, Fülle und Phänotyp der Antigen-spezifische CD8-T-Zellen in den Geweben

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Lokalisation, Häufigkeit und das Phänotyp von antigenspezifischen CD8-positiven T-Zellen in den gewünschten Geweben zu bestimmen. Diese Methode hilft dabei, schnelle Fragen zu CD8-T-Zellen zu beantworten, indem sie eine Möglichkeit bietet, nahezu jede antigenspezifische CD8-T-Zelle in beliebigen Geweben zu lokalisieren, zu quantifizieren und phänotypisch zu charakterisieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die räumliche Verteilung antigenspezifischer CD8-positiver T-Zellen im Verhältnis zu anderen Zellen und Strukturen innerhalb der untersuchten Gewebe bestimmen lässt.Den Vorgang wird gemeinsam mit Shengbin Li Gwantwa Mwakalundwa demonstrieren. Am ersten Tag des Verfahrens schneiden Sie das frische Gewebe mit einem Skalpell in etwa 0,5 × 0,5 cm große Stücke. Hier wird Milzgewebe des Rhesusmakaken gezeigt.Leim jedes Gewebefragment einzeln in die Mitte der Oberseite eines Kolbens und bette die Proben in drei bis fünf Milliliter warmer 4 %igen Low-Melting-Agarose in PBS ein. Beschrifte die Kolben mit den entsprechenden Gewebeinformationen. Danach stelle die Proben in einen gekühlten Halter in einem Eisbe

in-situ-mhc-tetramer-staining-quantitative-analysis-to-determine

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Verfahren zeigt die Reinigung und in vitro Expansion von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen aus ganzen peripheren Blut und deren Visualisierung mit Hilfe der MHC-Klasse II Tetramere. Tetramere erlauben die direkte Visualisierung von T-Zellen mit einem einzigen Antigen-Spezifität und definierte MHC-Klasse II Einschränkung.

Visualizing Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mit MHC Klasse II Tetramere

Eine Technik, die Kombination von in situ-Tetramer-Färbung und in situ-Hybridisierung (ISTH) ermöglicht die Visualisierung, Kartierung und Analyse der räumlichen Nähe von Virus-spezifischen CD8 + T-Zellen, um ihre Virus-infizierte Zielzellen, und die Bestimmung der quantitativen Beziehungen zwischen diesen Immunsystem Effektoren und Targets auf eine Infektion Ergebnisse.

Eine Technik, um gleichzeitig zu visualisieren Virus-spezifische CD8 + T-Zellen und Virus-infizierten Zellen In situ</em

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Peptid: MHC-Tetrameren und magnetische Mikrobeads zur niederfrequenten Populationen von Epitop-spezifischen T-Zellen zu isolieren und zu analysieren durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Untersuchung von endogenen T-Zell-Populationen von...

Peptid: MHC-Tetramer-basierte Anreicherung von Epitop-spezifischer T-Zellen

Das Protokoll zur selbst-reaktiven CD4-T-Zellen erkennen in Gehirn und Herz durch direkte Färbung mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II dextramers hat in diesem Bericht beschrieben. Für Analysen, ist eine zuverlässige Methode, um die Frequenzen von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen in situ aufzuzählen auch entwickelt.

In-situ-Nachweis autoreaktiver CD4-T-Zellen in Gehirn und Herz Mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Dextramers

Wir beschreiben Ganztier-Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Techniken zur Überwachung der Expansion von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen als Reaktion auf die Immunisierung mit Nanopartikeln in einem Mausmodell der Impfung.

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für das Aufzählen und Rhesusaffe CD8 + T - Zellen gegen das AIDS - Virus zu charakterisieren. Dieser Artikel ist nützlich , nicht nur auf dem Gebiet der HIV Immunologie, sondern auch auf anderen Bereichen der biomedizinischen Forschung , wo CD8 + T - Zell - Reaktionen bekannt sind , Krankheitsverlauf zu beeinflussen.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-spezifischen CD8 + T-Zellen in Rhesusaffen von Peptid-MHC-I Tetramerfärbung

Studium der Tumor Mikroumgebung kann prognostische und prädiktive Biomarker des klinischen Ansprechens auf Immuntherapie identifizieren. Hier präsentiert, ist eine innovative Methode basierend auf in Situ Fluoreszenz multispektralen imaging, zu analysieren und automatisch verschiedene Subpopulationen von CD8 zählen+ T Zellen. Diese reproduzierbare und zuverlässige Technik eignet sich für große Kohorte Analysen.

Gemultiplext Immunfluoreszenz Analyse und Quantifizierung der intratumorale PD-1+ Tim-3+ CD8+ T-Zellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Ex Vivo qualitativen Nachweis von Antigen-spezifischen CD8+ T Zellen. Analyse ist möglich mit einzelnen Zellsuspensionen von Organen oder geringe Mengen von Blut. Ein breites Spektrum an Studiengängen erfordert die Analyse der zytotoxischen T-Zell-Antworten (Impfung und Krebs-Immuntherapie-Studien).

Gleichzeitige Quantifizierung von Anti-Vektor- und Anti-Transgen-spezifische CD8+ T Zellen über MHC Tetramer Färbung nach der Impfung mit viralen Vektoren

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der einzelnen Kette MHC Klasse I komplexe molekulare Interaktionen in menschliche CD8 + T-Zell-Aktivierung zu untersuchen: Generation von veränderter antigenpräsentierende Zellen mit dem Ausdruck einzelne Kette konstruiert, Kultur der menschlichen CD8 + T Zelle Klon und T-Zell-Aktivierung-Experimenten.

Einzelne Kette MHC-Technologie zur Co-Agonismus in menschliche CD8 + T-Zell-Aktivierung zu untersuchen

In diesem Artikel wird ein Protokoll zur manuellen Tyramid-Signalverstärkung (TSA) Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) in Kombination mit Bildanalyse und räumlicher Analyse beschrieben. Dieses Protokoll kann mit formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Schnitten für die Färbung von zwei bis sechs Antigenen pro Objektträger verwendet werden, je nachdem, welcher Objektträgerscanner im Labor verfügbar ist.

Multiplex-Immunfluoreszenz kombiniert mit räumlicher Bildanalyse zur klinischen und biologischen Beurteilung der Tumormikroumgebung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik für den Multiplex-mRNA-Nachweis mit Protein-Imaging-Massenzytometrie in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten.

Dual-modale molekulare Kartographie: Integration der Multiplex-mRNA-Detektion mit der Protein-Imaging-Massenzytometrie

Lernen Sie die In-situ-MHC-Tetramer-Färbung zur Lokalisierung, Quantifizierung und Phänotypisierung antigen-spezifischer CD8-T-Zellen in Geweben. Diese Methode ermöglicht räumliche Analysen immunologischer Prozesse.

In Situ MHC-Tetramer Färbung und Quantitative Analyse zur Bestimmung der Lage, Fülle und Phänotyp der Antigen-spezifische CD8-T-Zellen in den Geweben (Video) | JoVE Journal

In Situ MHC-Tetramer Färbung und Quantitative Analyse zur Bestimmung der Lage, Fülle und Phänotyp der Antigen-spezifische CD8-T-Zellen in den Geweben

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