In Situ MHC-Tetramer Färbung und Quantitative Analyse zur Bestimmung der Lage, Fülle und Phänotyp der Antigen-spezifische CD8-T-Zellen in den Geweben

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Position, die Häufigkeit und den Phänotyp von antigenspezifischen CD8-positiven T-Zellen in interessierenden Geweben zu bestimmen. Diese Methode hilft, schnelle Fragen zu CD8-T-Zellen zu beantworten, indem sie die Möglichkeit bietet, praktisch jede antigenspezifische CD8-T-Zelle und jedes Gewebe zu lokalisieren, zu quantifizieren und zu phänotypisieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Bestimmung der räumlichen Verteilung von antigenspezifischen CD8-positiven T-Zellen im Vergleich zu anderen Zellen und Strukturen innerhalb von Geweben von Interesse ermöglicht.

Die Prozedur mit Shengbin Li wird von Gwantwa Mwakalundwa vorgeführt. Schneiden Sie am ersten Tag des Eingriffs das frische Gewebe mit einem Skalpell in etwa 0,5 x 0,5 Zentimeter große Stücke. Hier ist Milzgewebe von Rhesusaffen dargestellt.

Kleben Sie jedes Gewebefragment separat in die Mitte der Oberseite eines Kolbens und betten Sie die Proben in drei bis fünf Milliliter warme, 4%ige niedrigschmelzende Agarose in PBS ein. Beschriften Sie die Kolben mit den relevanten Gewebeinformationen. Legen Sie dann die Proben in einen gekühlten Halter in einen Eiskübel.

Wenn der Agar erstarrt ist, schalten Sie das Mikrotom ein und stellen Sie die Dicke auf 200 Mikrometer ein. Führen Sie nach dem Einsetzen einer neuen Rasierklinge die Kolben in das Mikrotombad ein. Füllen Sie das Mikrotombad mit 100 bis 200 Millilitern frisch zubereitetem PBS-H und fügen Sie PBS-H Eiswürfel hinzu, um die Temperatur zwischen null und zwei Grad Celsius zu halten.

Nachdem Sie 200-Mikrometer-Schnitte erhalten haben, entfernen Sie mit einem Pinsel den Agar, der jeden Abschnitt umgibt, und überführen Sie die Proben in einzelne Gewebekammern innerhalb einzelner Vertiefungen einer 24-Well-Gewebekulturplatte, die einen Milliliter gekühltes PBS-H enthält. Wenn alle Proben entnommen wurden, inkubieren Sie die Gewebeschnitte über Nacht in einem Milliliter fitter konjugierter, peptidbeladener MHC-Tetramere der Klasse 1, verdünnt in PBS-H, ergänzt mit 2 % normalem Ziegenserum bei vier Grad Celsius unter Schaukeln. Am nächsten Morgen wird jede Gewebekammer 20 Minuten lang in einzelne Vertiefungen einer neuen 24-Well-Platte mit einem Milliliter frisch gekühltem PBS-H überführt.

Nach der zweiten Wäsche fixieren Sie die Abschnitte in einem Milliliter frischem 4%-Paraformaldehyd für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Gefolgt von zwei fünfminütigen Wäschen in kaltem PBS-H. Übertragen Sie die Schnitte in eine neue 24-Well-Platte mit 0,01 molaren Harnstoff und erhitzen Sie die Schnitte dreimal für jeweils etwa 10 Sekunden, bis der Harnstoff kocht.

Um die Proben zu permeabilisieren und zu blockieren, inkubieren Sie die Schnitte in einer PBS-H-haltigen Blocklösung, die mit einem 0,3 %igen Triton x100-Reinigungsmittel und 2 % normalem Ziegenserum auf einer Wippe eine Stunde lang bei vier Grad Celsius ergänzt wird. Am Ende der Inkubation werden die Gewebekammern in einzelne Vertiefungen einer neuen 24-Well-Platte überführt, die einen Milliliter Lösung enthält, die den Kaninchen-Anti-FITC-Antikörper, den Maus-Antihuman-CD-Antikörper und den Ratten-Antihuman-CD3-Antikörper enthält. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei vier Grad Celsius unter Schaukeln.

Waschen Sie die Schnitte am dritten Tag dreimal in frischem PBS-H bei vier Grad Celsius für mindestens 20 Minuten pro Waschgang und führen Sie eine abschließende Inkubation mit den entsprechenden fluoreszenzkonjugierten Sekundärantikörpern für bis zu drei Tage lichtgeschützt durch. Spülen Sie die Proben am Ende der tertiären Antikörperinkubation mit drei 20-minütigen Waschgängen in frischem PBS-H und übertragen Sie die Proben aus jeder Gewebekammer mit einem Pinsel auf einen Glasobjektträger. Jeder Abschnitt wird mit Eindeckmedium bestrichen, das mit einem Fluorophor-Konservierungsmittel ergänzt wird, und die Proben werden mit einem Deckglas abgedeckt.

Lagern Sie die Objektträger dann in einem lichtgeschützten Objektträgerbehälter bei 20 Grad Celsius. Legen Sie am Tag der Bildgebung den ersten Objektträger auf den Tisch eines Konfokalmikroskops und wählen Sie für jedes Fluorophor, mit dem die Gewebeprobe markiert wird, die geeigneten Laser und Filter aus. Unter Verwendung des 20-fach-Objektivs wird nacheinander eine z-Serie in Abständen von drei Mikrometern in jedem der Fluorophorkanäle in mehreren 800 x 800 Pixelfeldern erhalten.

Erstellen Sie dann eine Montage der gesammelten Felder und speichern Sie jedes Montagebild mit einem Namen, der auf der entsprechenden Gewebeprobe basiert. In diesen repräsentativen Bildern wird ein Abschnitt, der mit MHC-Tetrameren der Klasse eins gefärbt wurde, die mit einem SIV-Peptid beladen sind, mit einem Schnitt aus demselben Gewebe verglichen, der mit MHC-Tetrameren der Klasse eins gefärbt wurde, die mit einem irrelevanten Peptid beladen waren, was die Spezifität der Tetramerfärbung demonstriert. In diesen Bildern färbten die virusspezifischen T-Zellen, die mit MHC-Tetramer der Klasse eins gefärbt wurden, die mit SIV-Peptid beladen waren, für CD8, einen Marker der T-Zell-Untergruppe, aber nicht für CD20, ein Zelloberflächenprotein, das auf B-Zellen exprimiert wird.

Diese Montage wurde für mehrere konfokale Felder der z-Serie erstellt, die für die Quantifizierung von Tetramer-gefärbten Zellen mit spezifischen Phänotypen und unterschiedlichen anatomischen Kompartimenten auf dem Lymphknoten verwendet wurden. Dieses vergrößerte Bild hebt einen Bereich des Montagelymphknotens hervor, der einen B-Zell-Follikel enthält, der durch IGM-Färbung abgegrenzt wurde. MHC-Klasse-1-Tetramer-gefärbte Zellen, von denen einige den T-Zell-Aktivierungs- und Proliferationsmarker KI67 co-exprimieren, können innerhalb und außerhalb des B-Zell-Follikels nachgewiesen werden.

Diese Färbekombination ermöglicht die Bestimmung des Aktivierungs- und Proliferationsstatus von SIV-spezifischen CD8-positiven T-Zellen sowie deren Lokalisation in sekundären lymphatischen Geweben. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa fünf Tagen abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass frisches Gewebe für eine erfolgreiche Färbung entscheidend ist.

Verarbeiten Sie die Proben innerhalb von 24 Stunden oder weniger nach der Ernte und bewahren Sie sie bis zur Fixierung gekühlt auf. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Tetramerfärbung und Immunhistochemie durchführt, um die Position, die Häufigkeit und den Phänotyp von antigenspezifischen CD8-positiven T-Zellen in interessierenden Geweben zu bestimmen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Infektionserregern äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, um eine Exposition zu verhindern, wie z. B. das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und die Einschränkung der Verwendung von scharfen Gegenständen.