Laborprotokoll für genetische Darm Inhaltsanalysen der aquatischen Makroinvertebraten Using gruppenspezifische rDNA Primer

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Untersuchungen der trophischen Ökologie, insbesondere anhand von Feldproben, zu verbessern. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Ökologie des Nahrungsnetzes zu beantworten, wie z. B. den Einfluss invasiver Arten auf trophische Interaktionen. Der Hauptvorteil besteht darin, dass die Integration trophischer Analysen für genau die gleichen Proben mehr Zeit in Anspruch nimmt und von praktisch jedem Ökologen angewendet werden kann.

Obwohl wir diesen Ansatz etabliert haben, um einen Einblick in den Beutekonsum von aquatischen Verbrauchern zu erhalten, kann er auch für andere Zwecke verwendet werden, z. B. zur Bestimmung der Artenzusammensetzung in benthischen Makroinvertebratenproben. Das Verfahren wird von Christian Sodemann, einem Techniker aus unserem Labor, vorgeführt. Um dieses Experiment zu starten, übertragen Sie zuvor präparierten Raubtier-Magen-Darm-Trakt in ein zwei Milliliter Safe-Lock-Reaktionsröhrchen mit 440 Mikrolitern Salzextraktionspuffer

Frieren Sie die Proben sofort bei minus 20 Grad Celsius bis zur DNA-Extraktion ein. Nachdem Sie die Proben aus dem Gefrierschrank entnommen haben, beginnen Sie die DNA-Extraktion, indem Sie mit einer Pinzette eine Fünf-Milliliter-Edelstahlperle in jedes Probenröhrchen geben, und lassen Sie die Proben dann zum Auftauen bei Raumtemperatur auf dem Labortisch liegen. Mit einer Kugelmühle werden die Proben eine Minute lang bei 15 Hertz homogenisiert.

Nachdem Sie die Proben kurz heruntergeschleudert haben, fügen Sie den Proben 90 Mikroliter 10 % SDS und fünf Mikroliter 10 Milligramm Proteinase K pro Milliliter hinzu. Anschließend werden die Proben gründlich vortexen und bei 60 Grad Celsius unter ständigem Schütteln bei 400 U/min auf einem ThermoMixer eine Stunde lang inkubiert. Um die Lyse weiter zu fördern, wirbeln Sie die Proben während dieser Inkubation alle 10 Minuten vortexen.

Nach einer kurzen Zentrifugationsdrehung pipettieren Sie 350 Mikroliter fünfmolares Natriumchlorid in die Proben. 30 Sekunden bis eine Minute lang vortexen, um die Proben vollständig zu mischen. Dann zentrifugieren Sie bei 16, 200 mal g bei fünf Grad Celsius für 40 Minuten.

Eines der wichtigsten Dinge bei der Entnahme der Proben aus der Zentrifuge ist daher zu vermeiden, dass sich Kügelchen bewegen und das Pellet stören, das alle Partikel enthält, die schrittweise entfernt werden müssen. Füllen Sie anschließend etwa 600 Mikroliter Überstand vorsichtig in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen um und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Fügen Sie 600 Mikroliter eiskaltes Isopropanol hinzu und drehen Sie das Röhrchen einige Male vorsichtig um.

Bei minus 20 Grad Celsius über Nacht lagern. Nachdem Sie die Proben aus dem Gefrierschrank genommen haben, zentrifugieren Sie sie bei 16.200 g bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, achten Sie darauf, dass das Kügelchen nicht verloren geht, und trocknen Sie das Rohr vorsichtig mit einem Seidenpapier ab.

Waschen Sie diese DNA-haltigen Pellets, indem Sie 200 Mikroliter 70%iges eiskaltes Ethanol hinzufügen und dann 10 Minuten lang bei 16.200 g bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und verwenden Sie fusselfreies Seidenpapier, um die Tube vorsichtig zu trocknen. Entfernen Sie schließlich mit einer 10-Mikroliter-Pipette, die auf acht Mikroliter eingestellt ist, vorsichtig den restlichen Überstand und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören.

Trocknen Sie das Pellet, bis das gesamte Ethanol verdampft ist. Dann 50 bis 100 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzufügen, kurz vortexen und über Nacht bei vier Grad Celsius stehen lassen, um das Pellet aufzulösen. Um die Funktionsfähigkeit der hier entnommenen DNA-Proben zu überprüfen, testen Sie jede von ihnen mittels PCR mit universellen Primer-Sets, die für die jeweilige Lebensmittelquelle geeignet sind.

Beginnen Sie mit der Zugabe von Primern, dNTP-Mischung, Reaktionspuffer, Taq-DNA-Polymerase und gereinigtem Wasser in ein 1,5- oder 2,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen und Vortexen der Standardreaktionsmischung. Übertragen Sie nun für jede DNA-Probe einen Mikroliter des entsprechenden DNA-Extrakts in neun Mikroliter des Standardreaktionsgemisches innerhalb einer PCR-Platte. Schließen Sie die Platte, legen Sie sie in den Thermocycler und starten Sie das PCR-Programm.

Verwenden Sie nach der abgeschlossenen PCR-Reaktion eine Mini-Zentrifuge mit einem Kurzlauf, um die PCR-Produkte herunterzuschleudern. Mischen Sie dann drei Mikroliter jedes PCR-Produkts mit einem Mikroliter sechsfach beladenem Farbstoff. Laden Sie diese Proben in Gelschlitze eines zuvor vorbereiteten Agarosegels.

Laden Sie 1,5 Mikroliter einer DNA-Leiter mit 100 Basenpaaren als Größenstandard in einen Schlitz des Gels. Schließen Sie den Deckel des Elektrophoresegeräts, schließen Sie es an eine Stromversorgung an und lassen Sie das Gel 35 Minuten lang mit 100 Volt pro Zentimeter laufen. Entfernen Sie nach dem Elektrophoreselauf das Gel und legen Sie es für ca. 10 Minuten in ein zuvor vorbereitetes Färbebad.

Nehmen Sie abschließend das Gel aus dem Färbebad, legen Sie es auf ein Geldokumentationssystem und visualisieren Sie es gemäß der Anleitung. Um den Gehalt an Raubtierdarm zu analysieren, verwenden Sie zuvor vorbereitete Arbeitslösungen des DNA-Extrakts. Führen Sie separate PCR-Reaktionen für jedes der 16 beutegruppenspezifischen Primer-Sets durch.

Nehmen Sie eine Positivkontrolle mit DNA aus einer Probe der jeweiligen Beutegruppe und eine Negativkontrolle mit DNA der Raubtierart auf. Es ist entscheidend, die Zuordnung der Probe innerhalb jeder PCR-Platte genau zu dokumentieren, um zu vermeiden, dass verschiedene Proben beim Laden auf eine Sequenzierplatte für den Nachweis eines Zuteilungssequenzierers gepoolt werden und letztendlich die falschen Ergebnisse einer Verbraucherperson zugewiesen werden. Führen Sie dann die PCR-Reaktionen mit demselben Protokoll wie zuvor beschrieben durch, angepasst an die spezifische Annealing-Temperatur und die Zyklusnummer für jedes verwendete Primer-Set.

Um die amplifizierten Fragmente in diesen PCR-Reaktionen nachzuweisen, führen Sie automatisierte Fragmentanalysen in zwei Chargen A und B durch. Bereiten Sie eine Mischung vor, die die Probenladelösung (SLS) und den jeweiligen Größenstandard für jede Charge enthält. Tauen Sie anschließend die zuvor gefrorenen PCR-Produkte der acht PCR-Reaktionen auf, die zur jeweiligen Charge gehören, und stellen Sie sicher, dass sie im Dunkeln aufbewahrt werden. Verwenden Sie eine Minizentrifuge mit kurzer Auflage, um sie herunterzuschleudern.

Auf eine Sequenzierplatte wird die Anzahl der Wells, die der Anzahl der zu analysierenden Proben entspricht, mit 22 Mikrolitern der jeweiligen Standardmischung der SLS-Größe für jede Probe beladen. Laden Sie dann jeweils einen Mikroliter PCR-Produkt von jeder der acht PCR-Reaktionen in die jeweiligen Vertiefungen der Platte. Verwenden Sie als Nächstes eine Mini-Plattenzentrifuge, um diese Mischung vorsichtig zu schleudern.

Bedecken Sie danach jede Vertiefung mit einem Tropfen Mineralöl. Füllen Sie dann die Reaktionsvertiefungen einer Pufferplatte mit 250 bis 300 Mikrolitern DNA-Trennpuffer. Verwenden Sie die Kapillarsequenzer-Software, um ein Sample-Setup gemäß den Anweisungen des Herstellers zu erstellen.

Stellen Sie sicher, dass die Zuordnung der Proben innerhalb des Probenaufbaus mit der Probenzuordnung in der Sequenzierplatte übereinstimmt und dass der Probenaufbau die Methode enthält, die für die Verarbeitung der jeweiligen Charge geeignet ist. Bei der Analyse der Ergebnisse ist es wichtig, das Elektropherogramm jeder Probe visuell erneut zu überprüfen und jeden Peak, der für jeden Marker-Primer-Satz separat aufgerufen wurde, zu bestätigen/zu bestätigen und nicht aufgerufene Peaks einzufügen, die den Kriterien eines manuell gesetzten Marker-Primers entsprechen, oder falsche Peaks zu löschen. Nach der Durchführung von Fütterungsexperimenten zur Bestimmung der Wirksamkeit von gruppenspezifischen Primer-Sets, die für die in diesem Protokoll durchgeführten PCR-Analysen etabliert wurden, wurden die PCR-Ergebnisse mit DNA aus dem Gastrointestinaltrakt des Raubtiers mittels Agarose-Gelelektrophorese sowie Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP) analysiert.

Die Agarose-Gelelektrophorese zeigte einzelne Banden doppelsträngiger DNA, die zwischen den verschiedenen untersuchten Beutetieren nicht unterschieden werden konnten. Im Gegensatz dazu gelang es der SSCP-Elektrophorese, die verschiedenen Beutearten zu unterscheiden, indem die Darminhaltsproben mit den Referenzproben verglichen wurden. Die DNA, die nach dem Fütterungsexperiment aus dem Darm der Wassermilbe extrahiert wurde, wurde in verschiedenen Zeiträumen nach dem Verzehr der Beute sequenziert.

Von einer bis 50 Stunden nach der Fütterung waren die relativen Mengen der nachgewiesenen Beute-DNA signifikant reduziert. DNA, die aus dem invasiven Flohkrebs Dikerogammarus villosus darm extrahiert wurde, wurde unter Verwendung von 16 gruppenspezifischen Primersätzen, die in diesem Protokoll beschrieben werden, auf Makroinvertebraten-Beutetier-DNA getestet. Nur 16% des Darminhalts von D.villosus waren positiv für DNA, die zu einem der 16 Ziel-Beutetaxa gehörte.

Darüber hinaus wurde in mindestens einer Probe DNA von 12 getesteten Beutetaxa gefunden, während DNA von vier Taxa nie nachgewiesen wurde. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, sicherzustellen, dass die verwendeten Primer spezifisch für die Taxa in Ihrem System sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre Forschung zu trophischen Interaktionen erweitern können, indem Sie die in Ihrem Labor routinemäßig verwendeten Methoden durch genetische Analysen ergänzen.