Name: Stereotaktische Atlas-geführte Laser Capture Microdissection Hirnregionen von traumatischen Verletzungen betroffen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Lernen Sie die stereotaktische Laser Capture Microdissection zur Isolierung spezifischer Hirnregionen nach traumatischer Verletzung. Diese Methode ermöglicht präzise molekulare Analysen von Gen- und microRNA-Expression in Rattenhirngewebe.

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Wir würden gerne Elizabeth Sumner für ihre Hilfe, die Bearbeitung dieser Handschrift zu erkennen. Finanzierung für dieses Projekt war Teil von The Moody Project für Translationale traumatische Verletzungen Hirnforschung und RO1NS052532 HLH geboten.

Hinweis: alle Tierversuche sind durch die institutionelle Animal Care and Use Committee der University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas genehmigt, wie von den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Nutzung der Versuchstieren (8. Auflage, National Research Council).
 1. Gewebe Sammlung, Region Identifikation und Berandungen <ol><li>Thema Erwachsene, Männlich, Sprague-Dawley Ratten, etwa sechs Wochen alt und 250-300 g, experimentelle Flüssigkeit Percussion Verletzungen, wie in Shimamura Et al. beschrieben. 4.</li> <li>Twenty-Four Stunden nach experimentellen TBI einschläfern menschlich die Tiere indem man sie in eine Kammer mit einer Isofluran-Konzentration von 4 % bis tief narkotisiert. Tod durch Enthauptung zu gewährleisten, Verbrauchsteuern die Gehirne und sofort einfrieren in Pulverform Trockeneis. Store Gehirne in einem Gefrierschrank-80 ° C eingefroren, bis schneiden.</li>
	<li>Vor keinem LCM-Verfahren, die transkriptionelle Analyse beinhaltet alle Oberflächen mit RNase Reinigungsmittel beseitigen, um das Risiko für Verschmutzungen und RNA-Abbau reinigen. 
	Hinweis: Diese Reinigung umfasst die Nutzfläche für Färbung, der Kryostat wo Gewebe geschnitten ist, und die Gegend um das LCM-Gerät.</li>
	<li>Das Hirngewebe von Lagerung und Ort abzurufen, in einem Kryostaten gekühlt bis-20 ° C. zulassen, das Gehirn, um auf die Temperatur der Kryostat Kammer für ~ 10 min. equilibrate</li>
	<li>Stellen die Gehirn ventralen Seite nach oben auf eine Gaze Blatt auf der Oberseite der Kryostat-Bühne. Mit einer Rasierklinge sauber, RNase-freie schneiden Sie den hinteren Teil nur rostral an das Kleinhirn (gespeichert oder verworfen) und das Teil nur anterior Optik Chiasmus (Och).</li>
	<li>Ort eine kleine Menge der optimale Arbeitstemperatur (OCT) Medium in zwei separaten Cryomolds. Legen Sie das Gehirn (mit dem frontalen Verein Kortex (FrA) und dem Nucleus Accumbens Kern (AcbC)) in die Cryomolds vorderen Seite nach unten. Fügen Sie ausreichend OCT-Medium, um das Gewebe zu bedecken.
	<ol><li>Wiederholen Sie diesen Schritt mit dem Gehirngewebe mit dem Hippocampus (Hp) und suprachiasmatischen Kern (SCN).</li>
		<li>OCT Mittel-und komplett für ~ 20 min in der Kryostat einfrieren lassen.</li>
	</ol></li> <li>Einmal die Gewebe und OCT Medium vollständig gefroren sind, drücken Sie eine kleine Menge von OCT auf eine Montage-Kopf und drücken Sie die gefrorenen Cryomolds, enthält das Gewebe auf den Montage-Kopf. Ermöglichen das OAT komplett gefrieren, so dass die Form, die das Gewebe enthält sicher am Kopf befestigt ist.</li>
	<li>Der Kopfaufsatz an der speziellen Halterung zu sichern und die Schraube festziehen. Anpassen den Schnittwinkel in Bezug auf die Kryostat-Klinge mit den Hebeln der Anpassung zu gewährleisten, Querschnitte gleichmäßig.</li>
	<li>Setzen die Schnittdicke bis 30 µm. Wenn die Gewebe-Block mit der FrA und AcbC schneiden, zum ersten Mal schneiden bis Großhirnrinde ersichtlich ist und dann Start sammeln.</li>
	<li>Abschnitte unter Bezugnahme auf die Ratte Gehirn Atlas- 12, Abschnitt und sammeln Gehirn durch sanftes Auflegen Raumtemperatur Polyethylen Napthalate (PEN) Membran Folien auf der geschnittenen Gewebe für die FrA bis der sekundäre motorische Kortex (M2 ) bei Bregma 5,16 mm erreicht ist.
	<ol><li>Visuell gewährleisten Einhaltung gleiten durch die Prüfung, wenn Gewebe und ÜLG auf Folie vollständig geschmolzen sind. Speichern Sie alle Folien mit Gewebeschnitten im Kryostaten bis beflecken.</li>
	</ol></li> <li>Weiter schneiden, bis die vordere Kommissur (Aca) sichtbar und in einem kompletten Kommissur unter die jetzt offensichtlich lateralen Ventrikel (LV) bei Bregma 1.80 mm vereint.</li>
	<li>Sammeln Abschnitte bis die LVs angezeigt Verbindung mit Aca am Bregma 0,84 mm.</li>
	<li>Schnitt für die FrA und AcbC abgeschlossen, Block montiert Gewebe zu entfernen und ersetzen Sie durch den Block mit HP und SCN.</li>
	<li>Abschnitt bis die Och am Bregma-0,480 mm, abgeflacht ist wenn der dritte Ventrikel (3V) erkennbar wird.</li>
	<li>Sammeln Abschnitte für den SCN ab diesem Zeitpunkt bis Bregma-0,720 mm, beginnt die supraoptischen Decussation (Sox). 
	Hinweis: Es möglicherweise notwendig, sammeln mehr Gewebeschnitte während der Och wie die SCN einfach übergangen wird.</li>
	<li>Für HP Sammlung sind Abschnitt bis die Hörner des Granulat Zelle dentate Gyrus (GrDG) Schicht sichtbar offensichtlich am Bregma-3,000 mm.</li>
	<li>Sammeln Abschnitte bis der hippocampal Unterfelder CA in den koronalen Abschnitte am Bregma verschmolzen sind-4,780 mm. Dieses Detail ermöglicht eine komplette Sammlung von Hippocampus unter der Kraniotomie und Verletzungen Website. 
	Hinweis: Wie in früheren Publikationen aus diesem Labor gezeigt, die meisten verletzte Zellen werden innerhalb dieses Bereichs sichtbar und eignet sich für gen oder MicroRNA Expressionsanalyse.</li>
</ol> 2. Färbeprotokoll <ol><li>vor alle färben, waschen Geschirr und Färbung Bereich in einer chemischen Abzugshaube mit RNase-Beseitigung Reinigungsmittel. Dieses Präparat verringert das Risiko der RNA-Abbau durch die Verseuchung.</li>
	<li>Alle Färbung Reagenzien und Lösungen in Nuklease vorzubereiten, freies Wasser.</li>
	<li>Nehmen eine Rack mit Folien in den Kryostaten und Platz in der Dunstabzugshaube gespeichert. Folien für 30 S. Platz erwärmen sie in Färbung Lösungen (mit Nuklease freies Wasser zubereitet) wie folgt zu ermöglichen: 75 % EtOH für 1 min, Nuklease kostenlos Wasser für 1 min, 1 % Cresyl violett für 1 min, Nuklease freies Wasser für 30 s, Nuklease freies Wasser für 30 s , 95 % EtOH für 30 s, 100 % EtOH für 30 s, 3 min Xylol und Xylol für 3 min.</li>
	<li>Ermöglichen das Rack nicht mehr als 10 min bei Raumtemperatur in der Dunstabzugshaube an der Luft trocknen. Alternativ legen Sie Regale in eine Rnase-freie Vakuum Exsikkator zum schnelleren Trocknen. Sobald getrocknet, gehen Sie sofort zum LCM.</li>
</ol> 3. Stereotaktische Atlas geführte Laser Capture Microdissection mit dem LCM-System <ol><li>vor Beginn jedes LCM-Verfahren zur RNA-Analyse, wischen Sie den Abholort und die Gegend um das Gerät mit RNase-Beseitigung von Reinigungsmittel und 100 % EtOH.</li>
	<li>Drehen Sie den ein-/Ausschalter auf der IR-Laser Erzeugungseinheit vor dem Einschalten Mikroskop Basis, und lassen Sie das System zu initialisieren, bevor Software vom Desktop aus gestartet wird. 
	Hinweis: Wenn nicht in dieser Reihenfolge abgeschlossen, die Software nicht erkennen das Mikroskop.</li>
	<li>Sobald die Software gestartet und die Initialisierung Schritte durchlaufen, drücken Sie die &#34; derzeit &#34; Button in der Software &#34; Setup Panel. &#34; die modulare Bühne bewegt sich in Position, wo LCM Makro Kappen und Folien können geladen und off-loaded.</li>
	<li>Legen Sie die Stift Membran Folien in die Halterungen (bis zu drei gleichzeitig) mit satiniertem Rand nach rechts vor. 
	Hinweis: Wenn in der Halterung in der falschen Ausrichtung platziert, die Software möglicherweise nicht richtig erkennen, die gewünschte IR oder UV-Schneidbereich.</li>
	<li>Klicken Sie auf die &#34; Mem &#34; Kontrollkästchen in der &#34; Kappe und Folienbereich Umgang mit &#34; neben der jeweiligen Folie (d.h., A, B oder C). Dieser Schritt bezeichnet, wenn die Folie eine Membran-Glas-Folie ist. Klicken Sie auf die gewünschte Folie zuerst erfasst werden.</li>
	<li>, Die Kamera ein gekacheltes Bild für Gewebe-Standort und Ausrichtung für GAP Praktika zu machen wählen Sie &#34; Bild &#34; auf die Symbolleiste und wählen Sie &#34; erwerben Übersicht. &#34; 
	Hinweis: Wenn der Benutzer vertraut mit dem Gewebe gesammelt ist, dieser Schritt ausgelassen werden durch Verwendung der manuellen Scrollball zur Positionierung der &#34; Region Mitte &#34; für Sammlung.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger über den Bereich auf der gekachelten Bildern (oder relative Position ohne gekacheltes Bild), der rechten Maustaste und wählen Sie &#34; Ort Cap bei Region Zentrum. &#34; die Software findet automatisch eine Kappe über der ausgewählten Position.</li>
	Wählen Sie eine Position aus <li>. 
	Hinweis: Um sicherzustellen, dass die IR-Laser richtig ausgerichtet ist und holt nur Bereiche, in denen Flecken von der Software gelegt werden muss es, bevor Sie fortfahren befinden.
	<ol>
		<li>Umzug in ein Gebiet im Rahmen der GAP, wo kein Gewebe vorhanden ist. Klicken Sie &#34; ich &#34; in der &#34; Microdissect Tools Bereich &#34; und wählen Sie die &#34; IR Locate &#34; Registerkarte ". Im Bereich Brandschutz einen IR-Test shot um zu beurteilen, wo die IR-Laser schießt und die Größe des Spots.</li>
		<li>Mit dem Cursor in der Mitte IR vor Ort und wählen Sie Rechtsklick &#34; gelegen IR Spot. &#34; 
		Hinweis: Größe und Intensität der IR-Strahl können geändert werden, durch die manuelle Veränderung der &#34; Leistung, Durchmesser oder Dauer &#34; unter jeder Punktgröße Designator oder durch Verschieben der gleitenden Skala am unteren Rand des Dialogfelds. Einige Testaufnahmen müssen entlassen werden, um korrekte Punktgröße zu gewährleisten. Der IR-Laser muss jeder beim nächsten Einschalten die Position der Kappe Änderungen oder Folien sind neu gefunden werden.</li>
		<li>Für UV schneiden, lokalisieren den UV-Laser durch die Auswahl der &#34; UV-Locate &#34; Registerkarte im Dialogfeld ". 
		Hinweis: Weil der UV-Laser und die IR-Laser im Einklang bewegen, gibt es keine Notwendigkeit, ständig den UV-Laser jedes Mal wieder zu finden die Position geändert wird.</li>
	</ol></li> <li>Wählen Sie die &#34; Freihandzeichnen &#34; option in der &#34; wählen Sie Tools-Bereich &#34;. Mit einem Touchscreen-Stift, zeichnen Sie im Umkreis der Region des Interesses während darauf achten, nicht den Kontakt zwischen dem Touchscreen und dem Stift Kopf verlieren. Achten Sie darauf, die Anfangs- und Endpunkte miteinander zu verbinden. 
	Hinweis: IR-Spots werden festgelegt werden automatisch durch die Software, aber der Benutzer kann wählen, legte sich zusätzliche Spots zu gewährleisten, das Gewebe ist an der Kappe eingehalten, nachdem UV schneiden durchgeführt worden ist.</li>
	<li>Für FrA Sammlung, führen Sie eine grobe Laser Erfassung der kortikalen Gewebe bis zu wenn die M2-Kortex am Bregma 5,16 mm steht. 
	Hinweis: Dieses Detail kann geändert werden, so dass nur bestimmte Teile des FrA oder bestimmte Zelltypen gesammelt werden.</li>
	<li>Für AcbC Sammlung, Laser Capture eine Gegend in der Nähe in der Nähe der RH. 
	Die Kern und Schale von der AcbC verschiedene Funktionen und sind physiologisch einzigartig. Daher ist es wichtig, die Gehirn-Atlas so nah wie möglich zu folgen. Es empfiehlt sich, sammeln von nicht weiter vorbei an Bregma 0,84 mm, wie die beiden Subregionen zu eng mit einander verbunden werden.</li>
	<li>Für Hp Sammlung, Laser erfassen die CA 1, 2 und 3 hippocampal Unterfelder beginnend am Bregma 3,00 mm und mit vollständig ausgebildeten GrDG als eine physische Wahrzeichen für morphologische Identifikation. 
	Hinweis: Für die Zwecke dieser Studie, sammeln Sie keine Vergangenheit Bregma-4,780 mm, die optisch als Punkt abgegrenzt werden können, wenn die Hp Unterfelder verschmolzen sind und ventral zeigen. Dieser Bereich wurde gewählt, da am meisten verletzt Neuronen können entdeckt werden, direkt nach der Verletzung Seite 6.</li>
	<li>Für SCN Sammlung zuerst visuell identifizieren die dicht gepackten Kerne, die dorsale, die Och sitzen und dann sammeln.</li>
	<li>Nach Sammlung von Regionen (siehe oben), LCM-Makro-Kappen zum Verschieben der &#34; QC Position &#34; und inspizieren für Einhaltung der komplette Gewebe optisch dadurch UV geschnitten Gewebe an der Membran befestigt ist. Schnell setzen Sie die Kappe Ontoan RNase-freie 0,5 mL dünnen ummauerten Reaktionsgefäß mit 100 µL der Zelle Lysis Puffer.</li>
	<li>Vortex Proben kurz zu gewährleisten komplette Lyse bei-80 ° c lagern Zu diesem Zeitpunkt LCM kann angehalten und Proben aufbewahrt bis zur nachgelagerten Genomanalyse 6.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

LCM ist für molekulare Studien über das Gehirn von Säugetieren eine wesentliche Technik geworden. Dieser Artikel zeigt, dass durch die Kombination der IR und UV-Laser Schneiden im LCM System genomische Veränderungen in jeder Region das Gehirn von Säugetieren erfassen kann. Diese Regionen sind mit konventionellen LCM-kompatiblen Flecken wie Cresyl violett oder Hämatoxylin und Eosin identifizierbar. Die Geschwindigkeit des Laser-Capture-Prozess und Leistungsfähigkeit LCM auf dickeren 30 µm Bereiche auf Stift Membran Folien ermöglicht nicht nur ausreichende Mengen von Zellproben zu erhalten, sondern auch RNA von LCM Proben geeigneter Qualität für alle Arten von nachgelagerten zu isolieren genomische Analyse; Diese Analysen umfassen Microarrays16, PCR-Arrays17und quantitative Echtzeit-PCR-18.
Unsere Daten liefern eine Begründung für Studien, die LCM Gewebe zu nutzen. Wir finden, dass MiR-15 b hochreguliert in den Hippocampus und Cortex (Abbildung 4) aber herunterreguliert in dem Nucleus Accumbens und möglicherweise biologisch relevant für das Verständnis der unterschiedlichen Auswirkungen der TBI im Gehirn. Eine frühere Studie vorgeschlagen, dass Erhöhungen der kortikale neuronale Anfälligkeit für Verletzungen durch Überexpression von mehreren MiRNAs entstehen, die pro-überleben Gene, wie Bcl-219negativ regulieren. Ziel-Scan Analyse zeigt Bcl-2 unterliegt auch MiR-15 b; so, unsere Daten deuten darauf hin eine mechanistische Erklärung dafür, warum bestimmte Regionen des Gehirns (d. h., FCx) selektiv für TBI anfällig sein kann. Es ist wichtig zu erinnern, die meisten Gene werden durch mehrere MiRNAs geregelt und korrelierenden Veränderungen in jedem ein MiRNA zu einem bestimmten Ziel-gen ist schwierig. Diese Daten zeigen, dass bestimmte Veränderungen im gen und MicroRNA Ausdruck als Biomarker der Region-spezifischen Hirnschäden verwendet werden können. In der Tat, wir nutzen derzeit diese Daten in Studien Wirkstoffe mit antidepressive Eigenschaften wie neue neuroprotektive differentiell gen und MicroRNA Ausdruck in den Gehirnregionen verbunden mit neuropsychiatrischen Störungen beeinflussen können. Eine Einschränkung unserer Studie ist, dass während der mehrere Schritte der Folie Verarbeitungsverfahren für LCM RNA Integrität beeinträchtigt werden kann. Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur Verringerung des Risikos der RNA-Abbau. Eine weitere Einschränkung ist die relativ kleine Stichprobengröße für die statistische Berechnung verwendet. In Zukunft sollten Studien, Erhöhung der Stichprobengröße die Auswirkungen der Gene und MiRNA Ausdruck Unterschiede zwischen den einzelnen Tieren verringern.
Der Vorteil der LCM ist in translational genomischer Studien mit Tiermodellen der Krankheit beim Menschen und kranke Gewebe20,21,22,23realisiert. Ohne die Fähigkeit, spezifische Zellpopulationen zu erfassen wäre die transcriptional Profile der verschiedenen Gehirnregionen eine unerkennbar und düster Mischung von vielen Zelltypen. Mit LCM Methoden im Gehirn Verletzungen Studien führte zur derzeitigen Bemühungen, Gehirn Region spezifische Biomarker zu beschreiben und zu verstehen, wie sie korrelieren mit zirkulierenden Biomarkern der TBI.

Das Gehirn von Säugetiere ist erstaunlich komplex und heterogen mit Hunderten bis Tausenden von Zelle Arten1. In der Tat, Studien am Menschen haben gezeigt, dass in Regionen wie dem frontalen Kortex, strukturelle und funktionelle Unterschiede in weißen und grauen Substanz spiegeln sich in unterschiedlichen und voneinander abweichenden transcriptional Profile2. Gehirn Heterogenität wurde ein großes Hindernis für die Genexpressionsdaten zu interpretieren und auf dem Gebiet der Hirn-Trauma. Diese Mehrdeutigkeit in präklinischen Studien führte anschließend zu Hunderten gescheiterten klinischen Behandlungen für Gehirn-Verletzung-3.
Wir verwenden Laser Capture Microdissection (LCM) Methoden, um Schädelhirntrauma (SHT) zu studieren-induzierte gen Dysregulation in der Ratte Gehirn4, mit Schwerpunkt auf der Hippocampus, eine Hirnregion, die für lernen und Gedächtnis5unerlässlich. Die Fähigkeit, laser-Erfassung und Analyse der Genexpression in sterben und Überleben der Neuronen gibt uns ein besseres Verständnis der Rolle der SCND im Genausdruck in den Ausgang (neuronale überleben) nach TBI6. LCM-Techniken haben auch für die Erforschung der Auswirkungen von TBI auf hippocampal Neuronen, beim Vergleich von jungen und alternden Mäusen7 oder Ratten8bewährt.
In neueren Studien untersuchten wir andere Hirnregionen Ratte negativ beeinflusst von TBI, mit einem Fokus auf Bereiche in Ratten und menschlichen TBI Patienten, die mit leitender Funktion (d. h. frontalen Kortex9) und TBI Komorbiditäten verbunden sind; Diese Begleiterkrankungen sind Depressionen (d.h. Nucleus Accumbens10) und zirkadiane Rhythmusstörungen (suprachiasmatischen Kern11). In früheren Studien, Huusko und Pitkanen12 und Drexel Et al. 13 verwendet LCM zur Genexpression in den Thalamus und Hypothalamus Untersuchung. Unsere Studie baut auf diesen früheren Beobachtungen und umfasst vier anderen Gehirnregionen. Um die regionsspezifischen molekulare Veränderungen nach TBI zu studieren, war es notwendig, Know-how bei der Ermittlung und Beschaffung Zelltypen in diesen Regionen mit einem LCM-System gewinnen. Die UV-schneiden und Infrarot (IR) Laser ermöglichen präzise Mikrodissektion von gewünschten Hirnregionen. Hier beschreiben wir, wie wir verwenden dieses LCM-System, geleitet von stereotaktischen Koordinaten in der Ratte Gehirn Atlas14, um zu identifizieren und laser-Erfassung vier Ratte Hirnregionen, die differentiell durch die experimentelle Flüssigkeit-Percussion Gehirn Verletzungen Methode betroffen sind 4.

<table><tbody><tr><td>Arcturus Laser Capture Mikrodissektionssystem</td><td>Angewandte Biosysteme (Life Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalysator</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus PEN Membran Glasobjektträger&nbsp;</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0522</td><td></td></tr><tr><td>Capsure LCM Caps</td><td>Applied Biosystems (Life Technologies)</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Xylol (histologische Qualität)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof (histologische Qualität)</td><td>UTMB Apotheke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous Micro- Kit</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Gene Expression Primer/Sonden Angewandte</td><td>Biosysteme (Life Technologies)</td><td>4331182</td><td></td></tr><tr><td>Taqman microRNA Expression Primer/Sonden</td><td>Angewandte Biosysteme (Life Technologies)</td><td>A25576</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 96 System</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaktische atlas-geführte laser capture microdissection hirnregionen von traumatischen verletzungen betroffen

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

Die Fähigkeit, bestimmte Gehirnregionen von Interesse zu isolieren kann im Gewebe Dissoziation Techniken behindert werden, die nicht ihre räumliche Verteilung beibehalten. Solche Techniken neigen auch potenziell gen Expressionsanalyse, weil der Prozess selbst Expressionsmuster in einzelnen Zellen verändern kann. Hier beschreiben wir eine Lasermethode Erfassung Mikrodissektion (LCM) um gezielt bestimmte Gehirnregionen betroffen Schädelhirntrauma (SHT) durch die Verwendung einer modifizierten Nissl (Cresyl violett) Färbung, Protokoll und der Leitung von einer Ratte Gehirn Atlas zu sammeln. LCM bietet Zugriff auf Hirnregionen in ihren systemeigenen Positionen und die Fähigkeit anatomische Landmarken zur Identifizierung der einzelnen spezifischen Regionen verwenden. Zu diesem Zweck wurde zuvor LCM verwendet, Gehirn Region spezifische Genexpression in TBI zu untersuchen. Dieses Protokoll ermöglicht die Auseinandersetzung mit der TBI-induzierte Veränderungen im gen und MicroRNA Ausdruck in verschiedenen Hirnregionen innerhalb der selben Tier. Die Grundsätze dieses Protokolls können geändert und auf eine Vielzahl von Studien, die genomische Ausdruck in anderen Krankheit und/oder Tiermodellen angewendet werden.

Im Schaltplan dargestellt in Abbildung 1 veranschaulicht die gesamten Arbeitsablauf von Atlas geführte LCM von bestimmten Gehirnregionen und nachgelagerte Analyse Anwendungsmöglichkeiten. Diese Studie konzentriert sich auf vier Hirnregionen mit TBI Pathophysiologie und zur Entwicklung der Begleiterkrankungen: FrA, AcbC, SCN und Hp. Eine Einschränkung, die von bestimmten Gehirnregionen in LCM vorhanden ist, dass anatomische Standorten oft durch einen Mangel an definierte Grenzen verdeckt sind, wie in Abbildung 2 (A, D, G, J)gesehen werden kann. Die Verwendung eines Gehirn-Atlas zu führen-Schnitt und laser-Erfassung bestimmter Regionen verringert die Gefahr einer Kontamination der Probe mit Hirnregionen als das Ziel. Wenn darauf geachtet wird, Gewebe Sehenswürdigkeiten, beim Schneiden und nach Nissl-Färbung folgen, bieten LCM-Technologie eine äußerst konsistente Möglichkeit des Erwerbs von diskreten Populationen von Zellen, Kernen oder Regionen15. Die langfristigen Ziele dieser Studien sind Gene und Micro-RNAs, die potenziell als Surrogat, dienen können nichtinvasive Biomarker der Region bestimmten Hirnverletzung zu identifizieren. Der erste Schritt in dieser Biomarker-Entwicklungs-Pipeline ist die Charakterisierung der gewebespezifischen transcriptional Änderungen nach experimentellen TBI. Diese Daten können dann mit Verletzungen verursachten Veränderungen in zirkulierenden auszahlt korreliert werden.
Die vorgestellten Verfahren wurden optimiert, zur Verringerung des Risikos der RNA-Abbau um RNA Analyse über reverse Transkription von Gesamt LCM-RNS vor quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR) zu ermöglichen. Gesamt-RNS (einschließlich der kleinen und großen RNA-Spezies) wurde mit einem spaltenbasierten Isolationsmethode auf Gewebe, das Laser-eingefangen von einzelnen Gehirnregionen war isoliert. RNA-Integrität, Qualität und Quantität nach Isolierungsmaßnahmen bewerten, wurden RNA-Proben kurz bei 70 ° C denaturiert und laufen auf einem RNA-Analysator. Qualitative Messungen enthalten Peak Amplituden der 18 s und 28 s rRNA Bands ()Abbildung 3(), die Vertreter der allgemeinen Verschlechterung sein können, zu analysieren und anhand der "RNA Integrität" (RIN). Wenn Sie vorsichtig RNase-freie Techniken verwenden, isoliert RNA von LCM Proben in der Regel Ergebnisse in RINs, die reichen von 6-8. Eine niedrigere RIN kann bedeuten schlechten RNA-Qualität und die Genauigkeit der gen- und MicroRNA Expressionsanalyse möglicherweise verringern kann. Umgekehrt kann eine höhere RIN Vertrauen in die Gültigkeit der Ergebnisse der RNA-Analyse verbessert werden.
RT-qPCR erfolgte mittels Primer/Sonden-Sets für einzelne Gene und Micro-RNAs (Abbildung 4). Ca. 1 ng von Gesamt-RNS war umgekehrt in cDNA umgeschrieben und bereits verstärkt, bevor qPCR laut Protokoll des Herstellers durchgeführt wurde. Verletzungsbedingte Gene untersucht in dieser Studie gehörten BCL2 verbunden X, Apoptose-Regler (Bax), B-Zell-CLL/Lymphom-2 (Bcl-2), Caspase-3, Apoptosis-Related Cystein Peptidase (Casp3) , Brain Derived Neurotrophic Factor (Bdnf) und CAMP Responsive Element Binding Protein 1 (Creb). MiR-15 b wurde ausgewählt, weil sich gezeigt hat, nach experimentellen TBI in einzelnen sterbenden Neuronen verändert werden. Es wurde auch experimentell überprüft und Bioinformatically vorausgesagt gen Ziele mit pro-Überlebensfunktionen (unveröffentlichte Daten). Normalisierte Falte-Änderung-Verhältnisse wurden durch Vergleich gen und MicroRNA Ausdruck in TBI Tiere und naiv-Steuerungen mit Normalisierung zu einem endogenen gen (Gapdh) oder kleine RNA (U6), bzw. ΔΔCt-Methode berechnet. Eine Falte-Änderung über 1 zeigt eine allgemeine Hochregulation in diesem Gen oder MicroRNA, und umgekehrt, eine Falte niedriger als 1 zeigt eine Herabregulation ändern. Statistische Analyse zeigte signifikanten Veränderungen in der Genexpression zwischen TBI und naiv Kontrolle (p ≤ 0,05), die Region des Gehirns angewiesen waren. Keine nennenswerten Veränderungen in MiR-15 b Ausdruck wurden zwischen die TBI und naiv Steuerung erkannt, aber gab es Entwicklungen in Richtung einer höheren und niedrigeren Ausdruck in einem Gehirn Region abhängigen Mode. Diese Daten deuten darauf hin, dass die weitere Optimierung notwendig, Änderungen in MicroRNA Ausdruck zu beurteilen ist. Es ist auch möglich, die Größe der Stichprobe zu klein, um statistische Signifikanz, teilweise aufgrund der inhärenten Variabilität im Ausdruck zu gewinnen war. Zukünftige Studien werden auch Augenwischerei betrieben Tiere um sicherzustellen, dass gen und MicroRNA Ausdruck Änderungen sind TBI und nicht durch die chirurgische Vorbereitung zurückzuführen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Workflow der Atlas-geführte LCM für nachgeschaltete Genomanalyse. (A-F) Verfahren aus tierischen Vorbereitung zur nachgelagerten qPCR-Analyse: (A) Erwachsenen, männlichen Sprague-Dawley Ratten (~ 6 Wochen alt und mit einem Gewicht von 300 g) betäubt, Fluid Percussion TBI unterzogen und Human eingeschläfert 24 h nach der Verletzung. (B) Serienschnitte (30 µm) frisch gefrorenen Gehirne basieren auf Koordinaten von bestimmten Gehirnregionen (FrA, AcbC, Hp, SCN) aus Paxinos und Watsons The Rattengehirn Atlas. (C) Abschnitte sind feste, Nissl gebeizt (1 % Cresyl violett), dehydriert, und luftgetrocknet. (D). LCM durchgeführt auf Hirnregionen mit einem LCM-System identifiziert. (E) LCM Makro Kappen auf eine RNase-freie 0,5 mL-Tube mit 100 μL der Zelle Lysis Puffer übertragen und bis zur RNA-Isolierung für nachgeschaltete Genomanalyse bei-80 ° c gelagert. RNA kann dann rückwärts transkribiert für gen oder MicroRNA RT-qPCR-Analyse, differentielle Expression der molekularen-Zielen nach TBI und/oder zwischen Hirnregionen von Interesse (F)zu untersuchen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig2.jpg"> 
Abbildung 2: LCM von TBI betroffenen Hirnregionen. Repräsentative Bilder von Gewebeschnitten gesammelt von der ipsilateralen Seite der Verletzung Aufstellungsort mit IR und UV-laser-Funktionen auf dem LCM-System (A-ich). Gewebe wurde geschnitten auf einem Kryostat (30 µm) und auf den Stift Membran Folien gesammelt. Abschnitte wurden dann behoben, Nissl-gefärbt mit Cresyl violett (1 %) und zur Identifizierung von bestimmten Gehirnregionen basierend auf anatomischen Landmarken in Paxinos und Watsons die Ratte Gehirn Atlas verwiesen dehydriert. (A-C) Ein Bereich des frontalen Verein Kortex (FrA) (D-F) Komponenten der CA1, CA2 und CA3 pyramidalen Schichten des Hippocampus (Hp) befindet sich neben der voll ausgebildeten Hörner der Granulat-Schicht dentate Gyrus (GrDG). (G-ich) Ein Bereich des Nucleus Accumbens coRe (AcbC) proximal und rostral an der vorderen Kommissur (Aca). (J-K) Suprachiasmatischen Kern (SCN) rostral zu supraoptischen Chiasmus (Och). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig3.jpg"> 
Abbildung 3. Vertreter-Scans von RNS-Qualität. Vertreter Electropherograms und zugehörigen Gelbilder RNA abgeleitet von LCM gesammelt Gewebe (A-D). Electropherograms und damit verbundenen Gelbilder zeigen intakt RNA anhand der Darstellung der 18 s und 28 s rRNA Gipfeln und Gel-Bands. Diese RNA eignet sich für alle downstream-Anwendungen, einschließlich genomic und Proteomic Analysen. (A) Frontal Verein Kortex (FrA) RNA. RIN 6.1. (B) Hippocampus (Hp) RNA. RIN 4.4. (C) Nucleus Accumbens Kern-RNA (AcbC). RIN 7.3. (D) Suprachiasmatic Nucleus (SCN) RNA. RIN 7.6. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56134/56134fig4.jpg"> 
Abbildung 4. Nachgelagerte Analyse des Gehirns regionsspezifische gen und MicroRNA Ausdruck über RT-qPCR. Einzelnen RT-qPCR für Gene von Interesse (Bcl-2, Bdnf, Casp3, Bax, Creb) und MicroRNA von Interesse (MiR-15 b) erfolgte am Laser erfasst Hirnregionen nach TBI (Hp und AcbC n = 5, FrA n = 4) und im Vergleich zu unverletzt naiven Tieren (n = 4). Analyse von Genen im Zusammenhang mit TBI Pathogenese erfolgte für Hp, AcbC, FCx. Daten als normalisierte Falte Änderung Verhältnisse im Vergleich zu naiv Kontrolle Hirnregionen dargestellt wird (ungepaarten t-Test mit Welch es Korrektur ± SEM; * p ≤ 0,05) (A). Differentielle Expression von MiR-15 b in verschiedenen Gehirnregionen wird als normalisierte Falte Änderungen im Vergleich zur naiven Kontrolle (± SEM) präsentiert (B). Daten vom SCN (n = 2) nicht enthalten. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56134/56134fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Wir beschreiben die Verwendung von Laser Capture Microdissection Proben unterschiedliche Zellpopulationen aus verschiedenen Gehirnregionen für gen- und MicroRNA Analyse zu erhalten. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der unterschiedlichen Auswirkungen von traumatischen Hirnverletzungen in bestimmten Regionen des Gehirns Ratte.

Stereotaktische Atlas-geführte Laser Capture Microdissection Hirnregionen von traumatischen Verletzungen betroffen

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls zur Laser-Mikrodissektion besteht darin, Zellen aus spezifischen Hirnregionen, die durch eine traumatische Hirnverletzung betroffen sind, für die molekulare Analyse zu gewinnen. Ich bin Doktor Helen Hellmich. Mein wissenschaftlicher Mitarbeiter Harris Weisz, der Student im Programm für Human-Pathophysiologie und Translationale Medizin an der medizinischen Fakultät der University of Texas ist, wird demonstrieren, wie wir Mikrodissektionsverfahren mittels Laser in unseren Untersuchungen zu Hirnverletzungen anwenden.Diese Methode könnte dazu beitragen, die Mechanismen und Folgen von TBI-bedingten Veränderungen in einzelnen Hirnregionen, wie dem Frontalkortex, der die exekutiven Funktionen steuert, und dem Hippocampus, der für gedächtnisabhängige Prozesse wichtig ist, aufzuklären. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Wirkung eines Krankheitsprozesses auf mehrere diskrete Hirnregionen oder einzelne Zelltypen aus demselben Gehirn untersuchen können.Bevor ein LCM-Verfahren durchgeführt wird, das eine transkriptionelle Analyse einschließt, alle Oberflächen mit RNace-Entfernungsdetergens reinigen, um die Gefahr von Kontamination und RNA-Abbau zu verringern. Das Gehirngewebe aus der Lagerung entnehmen und in einen auf minus 20 Grad Celsius gekühlten Kryostaten legen.Lassen Sie das Gehirn etwa zehn Minuten lang die Temperatur der Kryostatkammer annehmen. Legen Sie das Gehirn mit der ventralen Seite nach oben auf ein Gazetuch, das auf der Kryostatplatte liegt. Schneiden Sie mit einer sauberen RNA-Rasierklinge den hinteren Teil unmittelbar kaudal zum Kleinhirn und den Teil unmittelbar kranial zur Optikchiasma ab.Geben Sie eine kleine Menge Schnitttemperatur-Medium (OCT-Medium) in zwei separate Kryoschalen. Legen Sie das Gehirn mit dem frontalen Assoziationskortex und dem Kern des Nucleus accumbens in eine Kryoschale mit der Innenseite nach unten. Fügen Sie ausreichend OCT-Medium hinzu, um das Gewebe zu bedecken.Wiederholen Sie diesen Schritt mit dem Stück Gehirngewebe, das den Hippocampus und den suprachiasmatischen Kern enth&auml;lt. Lassen Sie das OCT-Medium im Kryostaten etwa 20 Minuten lang vollst&auml;ndig einfrieren. Sobald das Gewebe und das OCT-Medium vollst&auml;ndig gefroren sind, dr&uuml;cken Sie eine kleine Menge OTC auf einen Montagekopf.Drücken Sie eine gefrorene Kryoschablone auf den Aufsatzkopf und lassen Sie das OCT vollständig gefrieren, damit die Schablone mit dem Gewebe sicher am Kopf befestigt ist. Befestigen Sie die Kopfhalterung am Schnitttisch und ziehen Sie die Schraube fest. Stellen Sie den Schneidwinkel mithilfe der Verstellhebel relativ zur Kryostatschneide ein, um sicherzustellen, dass die Schnitte gleichmäßig angefertigt werden.Stellen Sie die Schnittdicke auf 30 Mikrometer ein. Schneiden Sie den Gewebeklotz, der das Hippocampus und das SEN enthält, bis die Chiasma optica auf Bregma 0,48 Millimeter abgeflacht ist, wenn das dritte Ventrikel sichtbar wird. Sammeln Sie dann die Schnitte für das REM ab diesem Punkt, indem Sie Polyethylennaphthalat-Membran-Objektträger mit Raumtemperatur vorsichtig auf das geschnittene Gewebe legen.Überprüfen Sie visuell die Haftung am Objektträger, indem Sie bestätigen, dass das Gewebe und das OTC vollständig auf dem Objektträger geschmolzen sind. Lagern Sie alle Objektträger mit Gewebeschnitten im Kryostaten, bis die Färbung erfolgt. Beenden Sie das Sammeln von Schnitten an der Bregma 0,72 Millimeter, wenn die supraventrikuläre Kreuzung beginnt.Für die Sammlung des Hippocampus schneiden Sie, bis die H&ouml;rner der granul&auml;ren Zellschicht des Gyrus dentatus bei Bregma 3,00 Millimetern sichtbar sind. Sammeln Sie Schnitte, bis die CA-Teilfelder des Hippocampus in den koronalen Schnitten bei Bregma 4,78 Millimetern verschmolzen sind. Dies erm&ouml;glicht die vollst&auml;ndige Gewinnung des Hippocampus unterhalb der Kraniotomie- und Verletzungsstelle.Vor der Färbung sämtliches Geschirr und den Färbungsbereich in einer chemischen Abzugshaube mit RNase-eliminierendem Reinigungsmittel waschen. Das Objektträgergestell aus dem Kryostaten nehmen und in die Abzugshaube stellen. Die Objektträger 30 Sekunden lang erwärmen lassen.Färben Sie die Schnitte mit Cresylviolett und klären Sie sie mit Kochsalzlösung. Lassen Sie das Gestell mit den gefärbten Objektträgern nicht länger als zehn Minuten bei Raumtemperatur im Abzug an der Luft trocknen. Nach dem Trocknen unverzüglich mit der LCM fortfahren.Bevor Sie mit einem LCM-Verfahren für die RNA-Analyse beginnen, wischen Sie den Sammelbereich und die Umgebung des Geräts mit einer RNAse-eliminierenden Reinigungslösung und 100 %igem Ethanol ab. Schalten Sie den Netzschalter der Infrarotlaser-Einheit ein, bevor Sie die Mikroskopbasis einschalten, und lassen Sie das System initialisieren, bevor die Software vom Desktop gestartet wird. Sobald die Software hochgefahren ist und ihre Initialisierungsschritte durchlaufen hat, öffnen Sie das Software-Setup-Panel und drücken Sie die Taste „Präsentiere Objektträger“.Die modulare Plattform bewegt sich in die Position, in der LCM-Makrokappen und -Objektträger geladen und entladen werden können. Legen Sie bis zu drei Membran-Objektträger mit der mattierten Kante nach rechts in die Halterungen. Wählen Sie den Bereich für Kappen- und Objektträgerhandhabung neben dem jeweiligen Objektträger aus und aktivieren Sie das Kontrollkästchen MEM, um der Software mitzuteilen, dass Membran-Glasobjektträger geladen wurden.Klicken Sie anschließend auf die gewünschte Folie, die zuerst aufgenommen werden soll. Um ein zusammengesetztes Bild zur Gewebelokalisation und -ausrichtung für die Platzierung der Kappen aufzunehmen, wählen Sie im Symbolleiste-Menü Bild aus und danach Übersicht aufnehmen. Bewegen Sie den Cursor über den gewünschten Bereich im zusammengesetzten Bild, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Kappe im Bereichsmittelpunkt platzieren.Die Software setzt automatisch eine Abdeckung über die ausgewählte Position. Nachdem die Infrarot- und UV-Laser lokalisiert wurden, wählen Sie im Auswahlwerkzeugbereich die Option „Freihandzeichnung“. Zeichnen Sie mit Hilfe eines Touchscreen-Stylus entlang des Umfangs des interessierenden Bereichs, wobei darauf zu achten ist, dass stets Kontakt zwischen dem Touchscreen und der Stylusspitze besteht.Stellen Sie sicher, dass Anfangs- und Endpunkte miteinander verbunden werden. Für die Sammlung des Hippocampus führen Sie eine Laser-Mikrodissektion der hippocampalen Teilbereiche CA1, CA2 und CA3 aus, beginnend bei Bregma 3,00 Millimetern, und verwenden die vollständig ausgebildete granuläre Schicht des Gyrus dentatus als morphologisches Orientierungsmarkmal zur Identifizierung. Nach der Sammlung bringen Sie die LCM-Makrokappen in die QC-Position und überprüfen visuell die vollständige Gewebefixierung, indem Sie sicherstellen, dass das mit UV-Licht geschnittene Gewebe an der Membran haftet.Es ist unbedingt erforderlich, dass der UV-Laser den gesamten Geweberand durchtrennt. Andernfalls kommt es zu einer unvollständigen Anheftung des Gewebes an die LCM-Kappe. Danach jede Kappe umgehend in ein RNAse-freies 0,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen mit dünner Wandung geben, das 100 Mikroliter Zelllysepuffer enthält.Vortexen Sie die Proben kurz, um eine vollständige Lyse sicherzustellen, und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis die nachgeschaltete genomische Analyse durchgeführt wird. Die folgenden Abbildungen zeigen repräsentative Bilder von Gewebeschnitten, die von der kontralateralen Seite der Verletzungsstelle mit Infrarot- und UV-Laserfunktionen am LCM-System gesammelt wurden. Dies ist ein Bereich des frontalen Assoziationskortex.Dieses Bild zeigt dieselbe Region nach der Probennahme. Und dies ist das Gewebe auf dem Deckel nach der Probennahme. Dieses Bild zeigt die Bestandteile der CA1-, CA2- und CA3-Parameatal-Schichten des Hippocampus, die neben den voll ausgebildeten Hörnern der granulären Schicht des Gyrus dentatus liegen.Die CA2- und CA3-Regionen wurden gesammelt, und diese Zellpopulationen sind auf der Kappe zu sehen. Hier wurde ein Bereich des Nucleus accumbens, Kern, proximal adrostal zur vorderen Kommissur, gezielt erfasst, der sich zuverlässig auf der Kappe reproduziert hat. Zuletzt wurde der suprachiasmatische Kern, rostral zum suprachiasmatischen Chiasma, nach TBI mittels LCM erfasst.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie verwendet werden, um ein Gehirn in etwa acht Stunden zu bearbeiten. Dazu gehören die Gewebeverarbeitung, Färbung und LCM. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie epigenetische Analysen durchgeführt werden, um Fragen zu Methylierungsmustern oder mikronischen Expressionen zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die LCM an mehreren Gehirnregionen desselben Gehirns durchführt.

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Forschung

JoVE Journal

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Neurowissenschaften

Quelle: Furmanski, O., et al. Kontrolliertes kortikales Wirkungsmodell von Hirnverletzungen bei Mäusen mit therapeutischer Transplantation von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen aus Nervenzellen. J. Vis. Exp. (2019)In diesem Video werden humaninduzierte pluripotente Stammzellen aus Nervenzellen stereotaktisch in die Grenze zwischen grauer Substanz und weißer Substanz des tiefen Kortex in einem Mausmodell für traumatische Hirnverletzungen injiziert. Die transplantierten Zellen...

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Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

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Laser-Nanochirurgie der Kleinhirn-Axone<em&gt; In Vivo</em

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Auslösen Reactive Gliose<em&gt; In Vivo</em&gt; Durch eine Vorderhirn Stab Injury

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Stereotaktische Atlas-geführte Laser Capture Microdissection Hirnregionen von traumatischen Verletzungen betroffen

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