Stereotaktische Atlas-geführte Laser Capture Microdissection Hirnregionen von traumatischen Verletzungen betroffen

Das übergeordnete Ziel dieses Laser-Capture-Mikrodissektionsprotokolls besteht darin, Zellen aus bestimmten Hirnregionen, die von einer traumatischen Hirnverletzung betroffen sind, für die molekulare Analyse zu sammeln. Ich bin Doktor Helen Hellmich. Mein wissenschaftlicher Assistent Harris Weisz, der hier an der medizinischen Fakultät der University of Texas im Programm für Humanpathophysiologie und Translationale Medizin studiert, wird demonstrieren, wie wir Laser-Capture-Mikrodissektionsmethoden in unseren Studien zu Hirnverletzungen einsetzen.

Diese Methode könnte dazu beitragen, die Mechanismen und Folgen von SHT-induzierten Veränderungen in diskreten Hirnregionen wie dem frontalen Kortex, der exekutive Funktionen steuert, aufzuklären. Und der Hippocampus, der für gedächtnisabhängige Prozesse wichtig ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Auswirkungen eines Krankheitsprozesses auf mehrere diskrete Gehirnregionen oder einzelne Zelltypen desselben Gehirns untersuchen können.

Reinigen Sie vor jedem LCM-Verfahren, das eine Transkriptionsanalyse umfasst, alle Oberflächen mit RNace und eliminierendem Reinigungsmittel, um das Risiko einer Kontamination und eines RNA-Abbaus zu verringern. Holen Sie das Hirngewebe aus dem Lager. Und in einen auf minus 20 Grad Celsius gekühlten Cyrostat geben.

Lassen Sie das Gehirn etwa zehn Minuten lang auf die Temperatur der Kryostatkammer ausgleichen. Legen Sie das Gehirn mit der Bauchseite nach oben auf ein Mulltuch auf dem Kryostatentisch. Schneiden Sie mit einer sauberen RNA-Rasierklinge den hinteren Teil gerade rostral zum Kleinhirn und den Teil knapp vor dem Chiasma opticum ab.

Geben Sie eine kleine Menge des Mediums mit optimaler Schnitttemperatur in zwei separate Kryoformen. Platzieren Sie das Gehirn, das den frontalen Assoziationskortex und den Kern des Nucleus accumbens enthält, mit der Innenseite nach unten in eine Kryoform. Fügen Sie ausreichend OCT-Medium hinzu, um das Gewebe zu bedecken.

Wiederholen Sie diesen Schritt mit dem Stück Hirngewebe, das den Hippocampus und den suprachiasmatischen Kern enthält. Lassen Sie das OCT-Medium für ca. 20 Minuten im Kryostaten vollständig einfrieren. Sobald das Gewebe und das OCT-Medium vollständig gefroren sind, drücken Sie eine kleine Menge OTC auf einen Montagekopf.

Drücken Sie ein gefrorenes Kryomold auf den Montagekopf und lassen Sie das OCT vollständig einfrieren, so dass die Form, in der sich das Gewebe befindet, sicher am Kopf befestigt ist. Befestigen Sie die Kopfbefestigung an der Trennhalterung und ziehen Sie die Schraube fest. Stellen Sie den Schnittwinkel in Bezug auf die Kryostat-Klinge mit den Einstellhebeln ein, um sicherzustellen, dass die Abschnitte gleichmäßig geschnitten werden.

Stellen Sie die Schnittdicke auf 30 Mikrometer ein. Beim Durchtrennen des Gewebeblocks, der den Hippocampus und den SEN enthält, wird geschnitten, bis das Chiasma opticus bei einem Bregma von 0,48 Millimetern abgeflacht ist. Wenn das dritte Ventrikul sichtbar wird. Von diesem Punkt aus werden dann Schnitte für das REM entnommen, indem Sie bei Raumtemperatur vorsichtig Objektträger aus Polyethylennapthalat auf das geschnittene Gewebe legen.

Stellen Sie visuell sicher, dass das Gewebe am Objektträger haftet, indem Sie bestätigen, dass das Gewebe und das OTC vollständig auf dem Objektträger geschmolzen sind. Lagern Sie alle Objektträger mit Gewebeschnitten bis zur Färbung im Kryostaten. Stoppen Sie die Entnahmeabschnitte bei einem Bregma von 0,72 Millimetern, wenn die supraoptische Kreuzung beginnt.

Für die Hippocampus-Entnahme wird geschnitten, bis die Hörner der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus bei Bregma 3,00 Millimeter sichtbar sind. Es werden Schnitte gesammelt, bis die CA-Unterfelder des Hippocampus in den koronalen Abschnitten bei einem Bregma von 4,78 Millimetern verschmolzen sind. Dies ermöglicht eine vollständige Entnahme des Hippocampus unter der Kraniotomie und der Verletzungsstelle.

Waschen Sie vor dem Färben das gesamte Geschirr und den Fleckenbereich in einem chemischen Abzug mit RNase-entfernendem Reinigungsmittel. Nehmen Sie das Seitengestell vom Kryostaten und setzen Sie es in den Abzug ein. Lassen Sie die Objektträger 30 Sekunden lang erwärmen.

Die Abschnitte mit kresylviolett färben und mit Kochsalzlösung klarstellen. Lassen Sie das Gestell mit den fleckigen Objektträgern nicht länger als zehn Minuten bei Raumtemperatur im Abzug an der Luft trocknen. Nach dem Trocknen sofort mit LCM fortfahren.

Bevor Sie mit einem LCM-Verfahren für die RNA-Analyse beginnen, wischen Sie den Entnahmebereich und den Bereich um das Gerät herum mit RNAse eliminierendem Reinigungsmittel und 100 % Ethanol ab. Schalten Sie den Netzschalter an der integrierten Lasererzeugungseinheit um, bevor Sie die Mikroskopbasis einschalten, und lassen Sie das System initialisieren, bevor die Software vom Desktop aus gestartet wird. Sobald die Software gebootet und ausgeführt ist, öffnen Sie die Initialisierungsschritte, öffnen Sie das Software-Setup-Panel und drücken Sie die aktuelle Stage-Taste.

Die modulare Stufe wird in die Position gebracht, in der das LCM-Makro verschlossen und verschoben und be- und entladen werden kann. Legen Sie bis zu drei Stiftmembranfolien mit der mattierten Kante nach rechts in die Halterungen. Wählen Sie den Bereich für die Handhabung von Verschlüssen und Objektträgern neben dem jeweiligen Objektträger aus und klicken Sie auf das Kontrollkästchen MEM, um der Software mitzuteilen, dass Membranglasobjektträger geladen wurden.

Klicken Sie dann auf die gewünschte Folie, die zuerst aufgenommen werden soll. Um ein gekacheltes Bild für die Position des Gewebes und die Ausrichtung für die Platzierung von Kappen aufzunehmen, wählen Sie Bild in der Symbolleiste aus und wählen Sie Übersicht erfassen. Platzieren Sie den Cursor über dem Bereich auf dem gekachelten Bild, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Kappe in der Bereichsmitte platzieren aus.

Die Software platziert automatisch eine Kappe über der ausgewählten Position. Nachdem Sie die Infrarot- und UV-Laser lokalisiert haben, wählen Sie die Option zum Freihandzeichnen im Bereich Werkzeuge auswählen. Zeichnen Sie mit dem Touchscreen-Stift um den Umfang des interessierenden Bereichs herum und achten Sie darauf, den Kontakt zwischen dem Touchscreen und dem Stiftkopf nicht zu verlieren.

Stellen Sie sicher, dass Sie den Anfangs- und Endpunkt miteinander verbinden. Für die Hippocampus-Entnahme werden die Unterfelder des Hippocampus CA1, CA2 und CA3 ab einem Bregma von 3,00 Millimetern mit dem Laser erfasst und die vollständig ausgebildete körnige Schicht des Gyrus dentatus als physikalischer Orientierungspunkt für die morphologische Identifizierung verwendet. Bringen Sie die LCM-Makrokappen nach der Entnahme in die QC-Position und prüfen Sie die vollständige Haftung des Gewebes, indem Sie visuell sicherstellen, dass das UV-geschnittene Gewebe an der Membran befestigt ist.

Es ist zwingend erforderlich, dass der UV-Laser das gesamte Gewebe umschneidet. Andernfalls führt dies zu einer unvollständigen Haftung des Gewebes an der LCM-Kappe. Legen Sie dann jede Kappe schnell in ein RNAse freies, 0,5 Milliliter dünnwandiges Reaktionsröhrchen, das 100 Mikroliter Zelllisuspuffer enthält.

Wirbeln Sie die Proben kurz vor, um eine vollständige Lisus zu gewährleisten, und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis sie für die nachgelagerte Genomanalyse bereit sind. Im Folgenden finden Sie repräsentative Bilder von Gewebeschnitten, die von der epzilateralen Seite der Verletzungsstelle mit Infrarot- und UV-Laserfunktionen auf dem LCM-System aufgenommen wurden. Dies ist ein Bereich des frontalen Assoziationskortex.

Dieses Bild zeigt die gleiche Region nach der Sammlung. Und das ist das Gewebe auf der Kappe nach der Sammlung. Dieses Bild zeigt die Komponenten der parameatalen Schichten CA1, CA2 und CA3 des Hippocampus, die sich neben den voll ausgebildeten Hörnern der Getreideschicht des Gyrus dentatus befinden.

Die CA2- und CA3-Regionen wurden gesammelt und diese Zellpopulationen sind auf der Kappe zu sehen. Hierbei wurde ein Bereich des Kerns des Nucleus accumbens proximal adrostral zur vorderen Kommissur anvisiert und auf der Kappe originalgetreu nachgebildet. Schließlich wurde der suprachiasmatische Kern rostral zum supraoptischen Chiasma mit LCM nach SHT erfasst.

Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um ein Gehirn in etwa acht Stunden zu bearbeiten. Dazu gehören Gewebeverarbeitung, Färbung und LCM. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die epigenetische Analyse, durchgeführt werden, um Fragen zu Methylierungsmustern oder mikronischer Expression zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie LCM an mehreren Gehirnregionen desselben Gehirns durchführen können.