Pflanzenanalysen Promoter: Identifizierung und Charakterisierung der Root Knoten bestimmten Promoter in die Gartenbohne

Behaarte Wurzeln werden verwendet, um transformierte Wurzeln in Phaseolus mit einem Reporterkonstrukt zu erhalten. Die dabei entstehenden transgenen Wurzeln werden verwendet, um die Expression des Reportergens zu untersuchen. Promotorexpressionsstudien sind entscheidend, um die raumzeitlichen Expressionsmuster von Genen zu verstehen.

Heute werden wir die Methoden zur Induktion von Haarwurzeln demonstrieren und Promotor-Expressionsmuster in transgenen Haarwurzeln unter symbiotischen Bedingungen mit Wurzelknöllchen in Phaseolus untersuchen. Estrada-Navarrete und Kollegen haben zuvor das Agrobacterium rhizogenes induzierte Haarwurzelsystem in Phaseolus etabliert. Die derzeitige Methode wird dazu beitragen, die Dauer der Induktion der Haarwurzel zu beschleunigen und dadurch die Vielseitigkeit des Systems zu verbessern.

Mein Kollege Manoj-Kumar Arthikala und die Studentinnen Alma Leticia und Brenda Mariana aus meinem Labor werden die Verfahren demonstrieren. Durchsuchen Sie zunächst die NIN-Gensequenz in der Phaseolus vulgaris-Genomdatenbank von Phytozome und wählen Sie die erforderliche Sequenzlänge vorgelagert zum ATG aus. Design der Oligonukleotide nach der entsprechenden Promotorsequenzanalyse.

Frisch präparierte genomische DNA von Phaseolus dient als Vorlage für die PCR-Amplifikation der Promotorsequenz. Bereiten Sie den PCR-Mastermix mit High-Fidelity-Taq-Polymerase und Standard-PCR-Komponenten zusammen mit den zuvor entwickelten Oligonukleotiden vor. Aliquotieren Sie den Mastermix in 2-ml-PCR-Röhrchen und führen Sie die Promotorfragmentamplifikation in einem Thermocycler und mit einem geeigneten Programm durch.

Trennen Sie das PCR-Produkt elektrophoretisch auf einem 1,2%Agarose-Gel. Visualisieren Sie das NIN-Fragment, das bei 700 Basenpaaren unter UV-Transillumination amplifiziert wird. Excisieren, eluieren und klonen Sie das Fragment in den Gateway-Eingabevektor pENTR/D-TOPO-Vektor gemäß den Standardanweisungen.

Transformieren Sie zwei Mikroliter des Reaktionsgemisches in kompetente E.coli-Zellen bei 42 Grad Celsius für 50 Sekunden und plattieren Sie die transformierten E.coli auf LB, ergänzt mit 50 Milligramm Kanamycin pro Liter. Züchten Sie die plattierten Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Führen Sie eine PCR-Reaktion für Plasmide durch, die aus zufällig ausgewählten E.coli-Kolonien unter Verwendung von M13-Oligonukleotiden isoliert wurden.

Das Fragment bei 1024 Basenpaaren sollte auf positive Klone hinweisen. Führen Sie die LR-Reaktion zwischen dem positiven Eingangsklon und dem binären Zielvektor durch. Wandeln Sie zwei Mikroliter Reaktionsgemisch in E.coli um und wählen Sie die Kolonien mit 100 Milligramm Spectinomycin pro Liter bei 37 Grad Celsius aus.

Amplifizieren Sie die Plasmide mit NIN-spezifischen Oligonukleotiden. Der positive Klon sollte bei 700 Basenpaaren amplifizieren. Sequenzieren und überprüfen Sie die Richtigkeit des Klonfragments.

Mobilisieren Sie das NIN-Promotorkonstrukt in elektrokompetente K599 Agrobacterium rhizogenes Zellen. Und noch einmal: Bestätigen Sie den Klon mit promotorspezifischen Oligonukleotiden. Schwefelsterilisieren Sie die Samen von Phaseolus vulgaris und keimen Sie auf sterilen, nassen Filterpapieren zwei Tage lang im Dunkeln bei 28 Grad Celsius.

Verteilen Sie 150 Mikroliter Agrobacterium rhizogenes-Zellen mit NIN-Konstrukt und Kontrollvektor auf LB-Platten mit Spectinomycin-Selektion. Lass die Kultur über Nacht bei 28 Grad Celsius wachsen. Entzünden Sie Phaseolus-Sämlinge und kratzen Sie die Zellen von Agrobacterium rhizogenes mit einer gebogenen Spitze von 200 Mikrolitern aus der Platte.

Und mit einem ml sterilem, destilliertem Wasser in das Eppendorf Tube resuspendieren. Sammeln Sie Agrobacterium rhizogenes-Zellen in einer drei ml-Spritze und setzen Sie die Phaseolus-Sämlinge in ein zuvor vorbereitetes Röhrchen-Setup ein. Die Hypokotyle der gekeimten Samen mit der Nadelspitze leicht einstechen und gleichzeitig die Zellen des Agrobacterium rhizogenes injizieren.

sollte darauf geachtet werden, dass die Nadel nicht durch das Hypokotyl geht. Halten Sie die injizierten Sämlinge in einer Wachstumskammer bei 28 Grad Celsius mit 16 Stunden Licht- und acht Stunden dunkler Photoperiode. Der Kallus an den verwundeten Hypokotylen sollte fünf bis sieben Tage sichtbar sein.

Entfernen Sie nach zwei Wochen die Hauptwurzel, indem Sie den Stiel zwei Zentimeter unterhalb der behaarten Wurzeln abschneiden und in Töpfe mit sterilem Vermiculit umpflanzen. Beimpfen Sie die Pflanzen gleichzeitig mit einem ml Rhizobium tropici, um die Knötchenbildung zu induzieren. Stellen Sie sicher, dass Sie die Rhizobium-Kultur bei OD 600 auf 6 verdünnen.

Halte die Pflanzen in einer Wachstumskammer bei 28 Grad Celsius, 16 Stunden Licht und acht Stunden dunkler Photoperiode und bewässere sie mit B- und D-Lösung. Um die raumzeitlichen Expressionsmuster des NIN-Promotors zu untersuchen, wird die Probenahme zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt. Nehmen Sie die Pflanzen heraus, ohne die Wurzeln zu beschädigen, und waschen Sie die Wurzeln ohne Vermiculit-Flecken.

Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip die Wurzeln aus NIN und Kontrollpflanzen aus und fahren Sie mit der histochemischen GUS-Färbung fort, indem Sie die Proben 16 Stunden lang im Dunkeln in GUS-Assay-Puffer bei 37 Grad Celsius inkubieren. Betrachten Sie die GUS-gefärbten Wurzeln unter dem Stereo- und Verbundmikroskop. Dieses Bild zeigt die Rhizobium-induzierte NIN-Promotorexpression in den Primärwurzeln.

Die Expression von NIN-Promotoren konnte auch in Rhizobium-infizierten Wurzelhaarzellen beobachtet werden. Darüber hinaus kann die GUS-Expression in verschiedenen Stadien der Wurzelknöllchenentwicklung dokumentiert werden. In den Vektorkontrollstämmen wurde keine GUS-Expression gesehen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für das Design Ihrer Promotor-Konstrukte und die Untersuchung der Promotor-Expressionsmuster in transgenen Haarwurzeln von Phaseolus haben. Dieses System könnte weiter ausgebaut werden, um die Promotor-Expressionsmuster unter anderen symbiotischen und pathogenen Interaktionen in Phaseolus und auch anderen Eudikotyledonen zu untersuchen.