Name: Dreidimensionale Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks Passive Klarheit geclearte Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Lernen Sie die passive CLARITY-Methode zur dreidimensionalen Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks bei der Maus. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung von Kapillarnetzwerken in intakten Ovarien.

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Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem chinesischen Sonderfonds für Postdocs (Nr. 2014T70392, YF), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81673766, YF), der neue Lehrer Grundieren Fonds, das Zuoxue Fundament der Fudan-Universität und die Entwicklung Projekt der Shanghai Peak Disziplinen-Integrative Medizin (20150407).

Alle Verfahren im Zusammenhang mit tierischen Themen folgen die Richtlinien der Tier-Ethik-Kommission am Shanghai Medical College, Fudan-Universität (Zulassungsnummer 20160225-013).
1. Vorbereitung des Eierstocks Transparent Maus
<ol><li>
Vorbereitung der Lösungen
	<ol>
<li>Bereiten Sie Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Lösung (1 M, pH 7.6) mit 0,1 % Triton x-100 (PBST). Um 1 L 10 X PBS-Stammlösung zu machen, mischen Sie 87 g NaCl, 3,1 g NaH2PO4 · 2H2O, 28,7 g Na2HPO4 ·12H2O. dH2O 1 L und Rühren ~ 2 h. anpassen auf pH 7.4 mit 1 N NaOH und bei Raumtemperatur lagern. Diese Stammlösung 10 X 1/10 verdünnen mit dH2O und dann 0,1 % Triton x-100 mit PBS-Puffer.</li>
		<li>Hydrogel-Lösung (pH 7,5) durch Vermischungen 4 % (wt/Vol) Paraformaldehyd (PFA) Lösung, 4 % (wt/Vol) Acrylamid, 0,05 % (wt/Vol) Bisacrylamide und 0,25 % (wt/Vol) VA-044-Initiator in bidestilliertem Wasser auf Eis zubereiten.</li>
		<li>Bereiten Sie die Clearing-Lösung (pH 8,5) durch das Mischen von 200 mM Natrium Borat Puffer, 4 % (wt/Vol) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) in bidestilliertem Wasser enthält.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transcardial Perfusion und Eierstock Vorbereitung
	<ol>
<li>Halten Sie alle Lösungen auf Eis, während alle Verfahren.</li>
		<li>Erwachsene weibliche Wildtyp C57BL/6 Maus mit eine intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (0,35 mg/kg) Lösung zu betäuben. Sobald es keine Zehe-Prise Reaktion zeigt, ist die Maus richtig betäubt.</li>
		<li>Verwendung Klebeband, die Maus mit Gliedmaßen zu beheben ausgestreckt auf einem flachen Hartschaumplatten.</li>
		<li>Setzen Sie das Herz durch einen Schnitt auf dem Xiphoid-Prozess durch die Brust, Haut und Knochen, mit einer Schere.</li>
		<li>Einen Einschnitt in das Tier rechten Vorhof, und dann Durchspülen des linken Ventrikels mit 20 mL eiskaltes 1 X PBS mit 10 mL/min.</li>
		<li>Durchspülen Sie das Tier mit mindestens 20 mL Hydrogel-Lösung mit 10 mL/min.</li>
		<li>Einschneiden der Haut über den Bauch entlang der Medioventral Linie mit einer Schere, die die ganze Enterocoelia macht, und den Darm entfernen. Sammeln Sie die Eierstöcke sowie der Gebärmutter, die Integrität der Eierstöcke Morphologie.</li>
		<li>Entfernen Sie das Fettgewebe um den Eierstock unter dem Mikroskop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Entgasung
	<ol>
<li>Legen Sie die Eierstöcke in 10 mL Hydrogel Lösung bei 4 ° C zur Fixierung für 3 Tage.</li>
		<li>Übertragen Sie des Eierstocks in einer 5-mL-Tube und füllen Sie das Rohr mit Hydrogel-Lösung. Dehnen Sie Parafilm über der Oberseite des Rohres zu und dann wickeln Sie Parafilm um den Hals des Rohres. Achtung: Sicherstellen Sie, dass keine Luftblasen zwischen den Parafilm und der Hydrogel-Lösung gibt.</li>
		<li>Legen Sie das Rohr auf einen Shaker im Inkubator bei 37 ° C für maximal 3 h erlauben das Hydrogel zu polymerisieren.</li>
		<li>Entfernen Sie der Eierstöcke aus dem Gel mit einem Spatel und entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Gel aus um den Eierstock durch Tissue-Papier. Waschen Sie der Fruchtknoten viermal mit 1 X PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passive clearing
	<ol>
<li>Tauchen Sie den Eierstock in 10 mL der Clearing-Lösung. Schütteln Sie bei 80 u/min bei 37 ° C zu den Clearing-Prozess zu starten.</li>
		<li>In der ersten Woche wechseln Sie die Lösung alle 3 Tage. Aktualisieren Sie nach einer Woche die Clearing-Lösung einmal wöchentlich bis zu den Eierstöcken deutlich wird. Dieser Prozess dauert in der Regel ca. 2-3 Wochen. Hinweis: Der Eierstock kann direkt Immunostained oder in verstaubar Natriumazid (0,02 %) mit PBS-Puffer bei 4 ° C für mehrere Wochen vor Immunostaining.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Immunostaining
<ol><li>Waschen Sie den Eierstock zweimal in PBST am 1. Tag bei 37 ° C auf einem Boston-Shaker.</li>
	<li>Inkubieren Sie der Fruchtknoten auf einem Shaker in primären Antikörper/PBST Lösung (Tabelle 1) am Tag 2-3 bei 37 ° c In der Arbeit präsentierten hier die primäre Antikörper Thrombozyten Endothelzellen Adhäsionsmolekül 1 (CD31) und Tyrosin-Hydroxylase 01:10 und 01:50 in PBST, bzw. verdünnt. Achtung: Wenn zwei oder mehr Arten von primären Antikörper verwendet werden, stellen Sie sicher gibt es verschiedene tierische Quellen.</li>
	<li>Die primären Antikörper mit PBST Puffer bei 37 ° C am Tag 4 auf einem Boston-Shaker abwaschen.</li>
	<li>Inkubieren Sie den Eierstock mit der gewünschten Sekundärantikörper in PBST am Tag 5-6 bei 37 ° C in einen Shaker geben. In der hier vorgestellten Arbeit wurden der Sekundärantikörper Alexa Mehl 488 für Tyrosin-Hydroxylase und Alexa Mehl 594 für CD31 01:50 in PBST verdünnt.</li>
	<li>Abwaschen der Sekundärantikörper mit PBST Puffer bei 37 ° C am Tag 7 in einen Shaker geben.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gewebe in Brechungsindex für Brechungsindex Homogenisierung am 8. Tag passende Lösung. Legen Sie das Gewebe auf einem Papier mit Gitternetzlinien seine visuelle Klarheit zu überprüfen, indem Sie überprüfen, ob die Gitternetzlinien gesehen werden können. Sobald das Gewebe vollständig geklärt ist, kann es abgebildet werden.</li>
	<li>Machen Sie einem Kitt Zylinder, der nur Umgebung könnte das Gewebe in einer Hufeisenform Formen Sie und drücken Sie die äußeren Grat fest auf einen Glasobjektträger um einen versiegelten Raum zu bilden. Die Höhe der Kitt sollte ein wenig größer als der Fruchtknoten.</li>
	<li>Legen Sie die geklärten Eierstock vorsichtig in die Mitte der Kitt und fügen Sie Brechungsindex, die passende Lösung. Eine Glasboden Gericht über den Kitt fest und verwenden Sie Kitt, um die Schale zu fixieren.</li>
</ol>(3) konfokalen Mikroskopie
<ol><li>Für die Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop, im Bereich "Ni-E" wählen Sie das Objektiv (in diesem Fall Wasser eintauchen 25 X Objektiv, 1.1-NA, 2 mm-WD) mit der richtigen Arbeitsabstand (in diesem Fall 2,0 mm).</li>
	<li>
Wählen Sie im Bereich "Acquisition" die Anzahl der Kanäle. Hier die verwenden Sie drei Kanäle.
	<ol>
<li>Verwenden Sie zuerst die Registerkarte "Auge Port" "und die XY-Controller Joystick das Gewebe in die Mitte des Feldes verschieben, indem die Überprüfung durch das Mikroskop Okulare.</li>
		<li>Nach dem Ausschalten der Auslöser Licht, klicken Sie auf "live"-Fenster anpassen "Laser-Energie", "HV (Gain)" und "Offset" für jeden Kanal separat. Höhere Laserleistung und HV führen zu höheren Signale und höhere Versatz kann die Hintergrundgeräusche reduzieren.</li>
		<li>Wählen Sie die richtige "Scan-Größe" und "Count". Verwenden Sie eine Scangröße von 1024 x 1024 µm2 und eine Anzahl von 4 bis 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Klicken Sie nach der Einstellung der Bildqualität für die Definition der Tiefe des Gewebes im Bereich "Z-Intensität-Korrektur", und nach Auffinden der Linse auf die oberste Schicht des Eierstocks (in der Mitte des Gewebes) und die Übernahme für die oberste Schicht anpassen auf das "Plus" Taste, um die oberste Schicht zu definieren.
	<ol>
<li>Unten Sie das Objektiv nach und legen Sie die entsprechenden HV und Laserleistung für die Unterseite des Gewebes und fügen Sie die niedrigste Schicht Informationen in die Z-Intensität-Korrektur-Tabelle hinzu. Klicken Sie auf ", ND", die Einstellung mit dem "ND Erwerb" Panel zu synchronisieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
In die "ND-Übernahme" panel, erste Reihe, die die Anzahl der Scan-Schritte. Dann kreuzen Sie die Registerkarten "Z" und "Großbild".
	<ol>
<li>Gehen Sie zum Fenster "Große Bild", die Größe des Feldes nach der Grenze des Gewebes mit Hilfe von Gewebe Visualisierung durch die Okulare zu definieren. Gehen Sie zurück zum Fenster "ND Erwerb" geben Sie die Größe des Scanbereichs ("Felder") und wählen die Überlappung zwischen 10 % und 15 %.</li>
		<li>Klicken Sie auf "Run Z Korrektur", nicht "Run jetzt", um automatisch die richtige HV, Laserleistung und Offset für jede Schicht gesetzt, und warten auf das Bild, um zu verarbeiten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) 3D-Rekonstruktion der einzelnen Follikel und ihre Vasculatures
<ol><li>Erstens verwenden Sie ImageJ5 , um die ursprünglichen NIS-Datei zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Bild" und wählen Sie "Farbe" und die "Split-Kanäle". Dann klicken Sie auf "Datei" und speichern Sie die Kanäle separat als TIFF-Datei Reihe mithilfe der "Bild-Sequenzen" Option in "Save as".</li>
	<li>Verwenden Sie Imaris, um eines der Baureihe TIFF-Datei zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Bearbeiten" und wählen Sie "Add Channels", den Rest der Kanäle hinzuzufügen. Den Namen und die Farbe des Kanals können auf den Registerkarten "Display-Einstellung" geändert werden. Die Dicke des Gewebes kann im Bereich "Bildeigenschaften" in der Dropdown-Liste unter "Bearbeiten" korrigiert werden müssen.</li>
	<li>Klicken Sie für die 3D Zuschneiden der fertigen Bilder und Entfernung der überschüssigen Teile auf die Schaltfläche "Bearbeiten" und wählen Sie "Ernte 3D". Die Größe des Feldes kann durch die Grenze zu ziehen.</li>
	<li>
Um die Schiff-Signale mit der Filamente Algorithmus im Bedienfeld "Surpass" zu rekonstruieren, klicken Sie auf "Filamente" zum Erstellen einer neuen Filament und klicken Sie auf weiter.
	<ol>
<li>Um die größte und die dünnste Durchmesser zu definieren, gehen Sie zum Fenster "Scheibe" und finden Sie die Ablaufverfolgung Schiff zu. Der Abstand wird automatisch im Feld "Maß" indem Sie zwei Punkte auf die maximale Breite des Schiffes auswählen angezeigt.</li>
		<li>Gehen Sie zurück zum Fenster "Surpass" und geben Sie die gemessenen Breite und klicken Sie auf weiter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passen Sie die Anfangs- und Saatgut Punkt-Schwelle. Wählen Sie im Bereich "Kamera" "Select". Wenn einige der automatisch erzeugten Kugeln entfernt werden müssen, drücken Sie die Umschalttaste und klicken Sie auf den Punkt. Durch die Auswahl "Navigate" und bewegen Sie die Maus, kann die Struktur gedreht werden, um sicherzustellen, dass die richtigen Punkte wurden beibehalten, und klicken Sie dann auf weiter.</li>
	<li>Wählen Sie den höchsten Schwellenwert für den lokalen Kontrast und klicken Sie auf weiter. Nicht wählen Sie "Erkennen Dornen", und weiterhin die Rekonstruktion des Zylinders Blutgefäß abzuschließen. Die Farbe kann bearbeitet werden, indem Sie auf die Registerkarte "Farbe". Die statistischen Daten können im Bereich "Statistik" des rekonstruierten Filaments extrahiert werden. Im Bereich "Bearbeiten" können überflüssige Teile entfernt werden. Hinweis: Andere Algorithmen können für die Messung des Volumens des gesamten Follikel oder follikulären Wände verwendet werden. In der hier vorgestellten Arbeit wurden die Eizellen der Autofluoreszenz der beiden Sekundärantikörper geprägt. Wegen der großen Menge von Daten war ein Workstation-Server für die Datenanalyse verwendet.</li>
</ol>5. statistische Analyse
Hinweis: Analyse der Bilddaten werden vorgestellt, wie ± Standardfehler bedeutet.
<ol><li>Führen Sie Vergleiche zwischen den Follikeln mit unabhängigen Stichproben t-Test aus und verwenden Sie Pearson Korrelation Test Korrelationskoeffizienten von follikulären Wand- und Kapillarlänge zu vergleichen. Legen Sie einen Wert von P < 0,05 als Grenze für statistische Signifikanz.</li>
</ol>

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<li>Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-mount+approach+for+accurate+quantitative+and+spatial+assessment+of+fetal+oocyte+dynamics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice.</a> Biol Reprod. 93 (113), (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In der aktuellen Studie präsentieren wir 3D imaging um die Beziehungen zwischen den Kapillaren und einzelnen wachsenden Follikel zu bewerten. In unserer bisherigen Arbeit mit dem gleichen Protokoll 9haben wir die Rollen von großen Gefäßsystem, Wechselwirkungen zwischen Follikel und der Position der Follikel in den Eierstöcken intakt Maus untersucht. Die passive Klarheit Ansatz erlaubt uns, Mikro und Makro-Vasculatures, Folliculogenesis und die Zusammenhänge zwischen der Corpora Lutea und Follikel ...

Die Follikel ist die strukturelle und funktionelle Grundeinheit des Eierstocks, und seine Entwicklung bezieht sich stark auf das Gefäßsystem innerhalb des Eierstocks. Blutgefäße versorgen, Ernährung und Hormone zu den Follikeln und somit eine wichtige Rolle für das Wachstum und die Reifung der Follikel1.
Eine Kombination von Technologien, einschließlich selektive Blutgefäß Marker, transgenen Mausmodellen und pharmazeutische Entwicklung, haben unser Wissen über Eierstockkrebs vaskulären Netzwerken, Angiogenese und die Funktion der Blutgefäße im erhöht Folliculogenesis. Der Fruchtknoten ist als aktives Organ bekannt, weil es verschiedenen Geweben und vaskulären Netzwerken während Folliculogenesis und Ovulation umbaut. Solche aktiven Umbau in der Größe und Struktur der Schiffe ist erforderlich für die biologische Funktion der Entwicklung und der Rekrutierung Follikel.
Traditionelle histologische und Histomorphometric Methoden mit Eierstockkrebs Abschnitte und Immunolabeling der Blutgefäße beschränken sich auf zweidimensionale (2D) Bilder2. Mit der Entwicklung von dreidimensionalen (3D) Rekonstruktion Technologien, 2D-Bilder Gewebe Scheiben können überlappt werden, um eine 3D-Struktur zu machen, aber diese Methode hat noch einige Einschränkungen – Schneiden des Gewebes zerstören die Mikrostrukturen, einige Teile der Gewebe sind oft fehlen, und bedeutende Arbeit engagiert sich bei der Herstellung von 3D Rekonstruktionen aus Bilder von Scheiben. Gesamte Gewebe 3D-Bildgebung mit konfokalen Mikroskopie kann viele dieser Beschränkungen überwinden, aber diese Methoden beschränken sich auf die Bewertung der Angiogenese in der embryonalen Eierstock-3. Mit ganzen Gewebe clearing-Methoden wie Klarheit4 können Sie die Lautstärke visualisierte um diese Probleme postnatale und Erwachsenen Eierstöcke und solche Methoden bieten optische Freiraum des Eierstocks ohne strukturelle Verformungen. Bildgebung der 3D Architektur der intakten Eierstöcke bietet eine genaue Bilddatenbank für Bildanalyse-Software, wie z. B. die Imaris-Software-Paket in dieser Arbeit verwendet.
Umbau des Eierstocks im gesamten Erwachsenenalter ist Teil eines dynamischen physiologischen Systems, und dadurch dem Eierstock ein hervorragendes Modell für Untersuchungen über die Regulierung der Angiogenese. Darüber hinaus kann die Bewertung der Rolle der Eierstöcke Blutgefäße unter pathologischen Bedingungen des weiblichen Fortpflanzungssystems wie PCO-Syndrom oder Eierstockkrebs durch ganze Eierstockgewebe Bildgebung untersucht werden. Die Entwicklung der passiven Klarheit-Methode und die Verwendung von modernen Bildanalyse-Software haben detaillierte Rauminformationen über die Beziehungen zwischen Blutgefäßen und ovarielle Strukturen wie Follikel zur Verfügung gestellt.

<table><tbody><tr><td>Acrylamid</td><td>Vetec</td><td>v900845</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845</td></tr><tr><td>Alexa Mehl 488 (Verdünnung 1:50)</td><td>Life Technologies</td><td>A11039</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039</td></tr><tr><td>Alexa Mehl 594 (Verdünnung 1:50)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td>https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>Bisacrylamid</td><td>Amresco</td><td>172</td><td>http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx</td></tr><tr><td>Schwarzwandige Glasbodenschale (Willco-Schale)</td><td>Ted Pella</td><td>14032</td><td>http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall</td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10004818</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818</td></tr><tr><td>Dinatriumhydrogenphosphat-Dodecahydrat (Na2HPO4 12H2O)</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10020318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318</td></tr><tr><td>FocusClear</td><td>Celexplorer</td><td>FC-102</td><td>http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>http://www.parafilm.com/products</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sinopharm Chemikalie Reagenz</td><td>80096618</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618</td></tr><tr><td>PECAM1/CD31, Thrombozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekül 1 (Verdünnung 1:10)</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html</td></tr><tr><td>Photoinitiator VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10019318</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318</td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat (NaH2PO4 2H2O)</td><td>Sinopharm chemisches Reagenz</td><td>20040718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>30166428</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>10019718</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td>30188928</td><td>http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928</td></tr><tr><td>Tyrosinhydroxylase (TH, Verdünnung 1:50)</td><td>Abcam</td><td>ab76442</td><td>http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html</td></tr></tbody></table>

dreidimensionale rekonstruktion der vaskulären architektur des eierstocks passive klarheit geclearte maus

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Der Fruchtknoten ist das wichtigste Organ des weiblichen Fortpflanzungssystems und ist unerlässlich für die Produktion von weiblichen Gameten und für die Steuerung des endokrinen Systems, aber die strukturellen Zusammenhänge und dreidimensionale (3D) Gefäßsystem Architekturen von der Eierstöcke sind nicht gut beschrieben. Um die 3D Verbindungen und Architektur der Blutgefäße im Eierstock intakt zu visualisieren, ist der erste wichtige Schritt, den Eierstock optisch klar zu machen. Um Gewebe Schrumpfung zu vermeiden, wir nutzten das Hydrogel Fixierung-basierte passive Klarheit (klar Lipid ausgetauscht Acrylamid-hybridisiert Rigid Imaging / Immunostaining/In Situ-Hybridisierung-kompatible Gewebe Hydrogel) Protokoll Methode um ein intaktes Eierstock zu löschen . Immunostaining, erweiterte multiphoton confocal Mikroskopie und 3D-Rekonstruktionen Bild wurden dann für die Visualisierung der ovariellen Gefäße und follikulären Kapillaren verwendet. Mit diesem Ansatz, wir zeigten eine signifikante positive Korrelation (P < 0,01) zwischen der Länge des follikulären Kapillaren und Volumen der follikulären Wand.

Wir haben die passive Klarheit-Methode in eine schnelle und einfache Methode für passive Eierstock clearing-unter Wahrung der follikulären und vaskulären Architektur und Erlangung der höchsten Fluoreszenzsignal von beschrifteten Marker von Schiffen und Follikel angepasst. Die 3D Architektur des follikulären Gefäßsystems wurde durch Immunostaining für CD31, ein Marker für die Endothelzellen6bestimmt. CD31 Färbung in den Eierstöcken erwachsener Mäuse wurde verfolgt, ...

Hier präsentieren wir eine Anpassung der passiven Klarheit und 3D-Rekonstruktion Methode zur Visualisierung der Eierstöcke Gefäßsystem und follikulären Kapillaren in intakten Maus Eierstöcke.

Dreidimensionale Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks Passive Klarheit geclearte Maus

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, eine vollständige dreidimensionale Ansicht der Kapillarverteilung in den Eibläschen der Maus zu liefern und deren räumliche Beziehungen darzustellen. Der Eierstock ist ein wesentliches Organ in der Fortpflanzung und der Endokrinologie. Zählen Sie jeweils die verschiedenen Entwicklungsstadien der Eibläschen sowie die somatischen Zellen.Außerdem zeigt der Eierstock im Gegensatz zu anderen Organen keine wiederholte Verzweigung der funktionellen Einheit. Das lokale Gefäßsystem kann gemeinsam mit dem Nervensystem bei jedem Menstruationszyklus bei erwachsenen Frauen erhebliche Veränderungen durchlaufen. Die Anwendung der passiven Klärung im Eierstock ermöglicht es uns, die gesamte Verteilung und die Verbindungen zwischen diesen Zellen und Follikeln im Eierstock sichtbar zu machen.Der wichtigste Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass es die geringste Wirkung auf den Eierstock hat und für die Klärung verschiedener Marker verantwortlich ist. Durch die Rekonstruktion des mikroskopischen Bildes haben wir eine Karte des Eierstocks erstellt. Einige Details der Blutgefäße, Neuronen und Follikel können deutlich beobachtet werden.Zur Bildanalyse wurden einige Funktionen von Imaris verwendet, um die Beziehungen zwischen dem Eierstock und den Strukturen zu bewerten. Bereiten Sie die Perfusionslösungen gemäß der Artikelanleitung vor und stellen Sie sie auf Eis. Betäuben Sie die Mäuse und vergewissern Sie sich, dass keine Zehenquetschreflexantwort beim Tier vorhanden ist.Spritzen Sie Ethanol, setzen Sie einen Einschnitt in das rechte Atrium und spülen Sie sofort das linke Ventrikel mit 20 ml eiskaltem PBS mit einer Geschwindigkeit von 10 ml pro Minute aus, um das Blut zu entfernen. Anschließend spülen Sie das Tier mit kalter Hydrogel-Lösung mit der gleichen Geschwindigkeit durch. Sammeln Sie die Eierstöcke sowie den Uterus, um die Integrität der ovariellen Morphologie zu bewahren.Überführen Sie die separierten Eierstöcke in die kalte Hydrogel-Lösung. Entfernen Sie unter einem Stereomikroskop das Fettgewebe um den Eierstock herum. Für ein besseres Ergebnis der Gewebefixierung empfehlen wir, die Ovarialbursa zu entfernen.Die Ovarien drei Tage lang in Hydrogel-Lösung belassen. Nach drei Tagen die Ovarien in ein Glasröhrchen überführen und das Röhrchen mit frischer Hydrogel-Lösung auffüllen. Eine Parafolien-Schicht über das Ende des Röhrchens spannen und anschließend eine weitere Parafolie um den Hals des Röhrchens wickeln.Stellen Sie sicher, dass keine Blasen zwischen dem Parafilm und der Hydrogell&ouml;sung vorhanden sind. Stellen Sie das Glasr&ouml;hrchen zwei Stunden lang auf einen Sch&uuml;ttelinkubator bei 37 Grad Celsius, bis sich ein Gel gebildet hat. Entfernen Sie vorsichtig das &uuml;bersch&uuml;ssige Gel um die Eierst&ouml;cke herum mit einem Filterpapier.Legen Sie die Eierstöcke in ein 15-ml-Röhrchen und füllen Sie das Röhrchen mit 10 ml Klärungslösung. Stellen Sie das Röhrchen für mindestens zwei Monate in einen Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius. Wechseln Sie die Klärungslösung in den ersten drei Tagen täglich und anschließend wöchentlich, bis die Eierstöcke durchsichtig geworden sind.Alle Immunfärbungen werden bei 37 Grad Celsius auf einem Schüttler durchgeführt. Zuerst wird das Ovar 24 Stunden lang in PBST gewaschen. Anschließend wird das Ovar zwei Tage lang in der mit PBST verdünnten Primärantikörper-Lösung inkubiert.Drittens spülen Sie die primären Antikörper mit PBST-Puffer ab. Viertens inkubieren Sie das Ovar mit dem gewünschten sekundären Antikörper in PBST für zwei Tage. Fünftens spülen Sie die sekundären Antikörper mit PBST ab.Sechstens überführen Sie den Eierstock in eine Brechungsindex-anpassende Lösung zur RI-Homogenisierung. Überprüfen Sie die optische Transparenz; wenn der Eierstock vollständig geklärt ist, kann er abgebildet werden. Bereiten Sie zunächst eine saubere Glasbodenkulturbox vor.Formen Sie einen Kittzylinder und gestalten Sie ihn zu einer Hufeisenform. Drücken Sie die Außenkante fest auf einen Objektträger, um einen abgedichteten Raum zu erzeugen. Die Höhe des Kitts sollte etwas höher sein als die des Ovars.Bewegen Sie den Ovar vorsichtig in die Mitte und geben Sie Montagemedium hinzu. Setzen Sie eine Deckglasplatte auf die Kittmasse und verwenden Sie zwei Kittstücke, um sie zu befestigen. Wenn der Ovar zum Abbilden bereit ist, kann ein Nikon-Konfokalmikroskop mit 16-facher Objektivvergrößerung ausgewählt werden, um ihn abzubilden.Für die Bildgebung mit dem konfokalen Mikroskop zuerst das Objektiv im Ni-E-Bedienfeld auswählen. Im Erfassungsbereich die Anzahl der Kanäle auswählen. Zuerst die Eye-Port-Registerkarte und den XY-Controller-Joystick verwenden, um das Gewebe mithilfe der Mikroskopokulare in die Bildmitte zu bewegen.Zweitens, nachdem das Shutter-Licht ausgeschaltet wurde, klicken Sie auf den Reiter „Live“, um Laserleistung, HV und Offset für jeden Kanal anzupassen. Passen Sie im Bereich Z-Intensitätskorrektur die Aufnahme für die obere Schicht an, klicken Sie auf die Schaltfläche „Plus“, um die obere Ebene zu definieren, bewegen Sie das Objektiv nach unten und stellen Sie geeignete HV-Werte und Laserleistung am unteren Gewebeteil ein, fügen Sie die Informationen zur untersten Schicht hinzu und klicken Sie auf „To ND“, um die Einstellungen mit dem Bereich und der Aufnahme zu synchronisieren. Gehen Sie bei der Aufnahme zunächst dazu über, die Anzahl der Abtastschritte festzulegen.Klicken Sie auf die Registerkarten Z und großes Bild. Gehen Sie anschließend zum Fenster „Scan großes Bild“, um die Feldgröße entsprechend dem Rand des Gewebes festzulegen. Danach kehren Sie zur ND-Aufnahme zurück, um die Größe der Scanfelder einzugeben und eine Überlappung zwischen 10 und 50 % zu wählen. Klicken Sie dann auf „Z-Korrektur ausführen“ und warten Sie den Bildgebungsprozess ab.Verwenden Sie zuerst imagic, um die ursprüngliche NIS-Datei zu öffnen. Klicken Sie auf den Bild-Button, wählen Sie Farbe und Anzeigekanäle aus und klicken Sie dann auf Datei, wählen Sie Bildsequenzen aus und speichern Sie diese getrennt als TIFF-Dateien. Zweitens verwenden Sie Imaris, um eine der TIFF-Dateien zu öffnen.Klicken Sie auf die Schaltfläche „Bearbeiten“ und wählen Sie „Kanäle hinzufügen“, um die restlichen hinzuzufügen. Der Name und die Farbe können in der Anpassung der Anzeige geändert werden. Die Dicke des Gewebes sollte ebenfalls in den Bildeigenschaften korrigiert werden.Drittens klicken Sie auf die Bearbeitungsschaltfläche und wählen Sie „Crop 3D“, um den überflüssigen Teil abzuschneiden. Klicken Sie zuerst auf die Filamentschaltfläche und danach auf „Weiter“. Gehen Sie zum Slice-Panel, finden Sie ein nachzuzeichnendes Gefäß und den Abstand, kehren Sie dann zum Surpass zurück, geben Sie den statischen Wert ein und klicken Sie auf „Weiter“.Zweitens passen Sie den Start- und den Sollwert-Schwellenwert an. Wählen Sie im Kamerapanel „Auswählen“, drücken Sie die Umschalttaste und klicken Sie auf den Punkt, um den zusätzlichen Teil zu entfernen. Drittens wählen Sie den höchsten Schwellenwert und klicken Sie auf „Weiter“.Wählen Sie keine Erkennungspunkte aus und fahren Sie fort. Einige überflüssige Teile können im Bearbeitungsfenster entfernt werden. Die Farbe kann bearbeitet werden, indem auf die Farbe geklickt wird.Die 3D-Architektur des Eierstock-Gefäßsystems wurde nach Immunfärbung von CD31 untersucht. Die 3D-Struktur kann entweder durch Einzelschnitte oder im Gesamtbild mittels Volumenrendering betrachtet werden. Die CD31-Färbung des adulten, follikulären Gefäßsystems der Maus wurde durchgeführt.Über die Rekonstruktion der Kapillaren durch die Filamente konnten wir die Beziehung zwischen den einzelnen Follikeln und ihren Kapillaren aufzeigen. Der Eierstock ist, wie eine Frau, stets aktiv und austauschbar. Aufgrund der Einschränkungen der traditionellen histologischen Analyse ist es jedoch sehr schwierig, die Beziehungen zwischen solch komplexen Bestandteilen zu beschreiben.Die neu entwickelte Methode, passive clarity, könnte uns dabei helfen, die optischen Hindernisse zu überwinden, die Integrität des gesamten Gewebes zu bewahren und funktionelle Hinweise zu liefern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Diese Studie stellt ein Protokoll für die reversible Gewebe, clearing, Immunostaining, 3D-Darstellung und Analyse von vaskulären Netzwerken im menschlichen Plazenta Zotten Proben in der Größenordnung von 1 bis 2 mm3.

Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Follikel in kultivierten Eierstöcken von jungen Mäusen ohne seriellen Schnitt zu quantifizieren. Mit ganzen Organs Immunfluoreszenz und Gewebe löschen, wird körperliche Schneiden mit optischer Schnitt ersetzt. Diese Methode der Probenvorbereitung und Visualisierung Orgel Integrität bewahrt und automatisierte Quantifizierung bestimmter Zellen erleichtert.

Ganze Mount Immunfluoreszenz und Follikel Quantifizierung der kultivierten Maus Eierstöcke

Eierstöcke Gewebekulturen als Modelle der Follikel Entwicklung, Eisprung und Follikel Atresie einsetzbar und regulatorische Mechanismen der Eierstöcke Dynamiken zeigen.

Ovarian Tissue Culture Phänomene in der Maus Eierstock zu visualisieren

Hier beschreiben, vergleichen und kontrastieren wir zwei verschiedene Techniken für die genaue Follikelzählung von festen Eierstockgeweben der Maus.

Genaue Follikel-Aufzählung in adulten Maus-Ovarien

Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Abbildung ganzer Eierstöcke für quantitative und qualitative Analysen mittels Whole-Mount-Immunfärbung, Multiphotonenmikroskopie sowie 3D-Visualisierung und -Analyse. Dieses Protokoll ermöglicht eine zuverlässige, wiederholbare Verarbeitung mit hohem Durchsatz, die für die Toxikologie, die klinische Diagnostik und genomische Assays der Eierstockfunktion geeignet ist.

Immunfluoreszenz, Clearing und Multiphotonenmikroskopie des gesamten Eierstocks zur quantitativen 3D-Analyse der sich entwickelnden Ovarialreserve in der Maus

Die Perizyten in retinalen Gefäßen wurden durch Immunfluoreszenzfärbung mit Thrombozyten-abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptoren β nach retroorbitaler Injektion von fluoreszierendem Tomatenlektin untersucht. Die markierte Netzhaut wurde weiter mit der Gewebereinigungsmethode behandelt und als Ganzes montiert, um die dreidimensionalen Ansichten der Perizyten, die das retinale Gefäßsystem umgeben, unter einem konfokalen Mikroskop zu visualisieren.

3D-Visualisierung von retinalen vaskulären Perizyten bei Mäusen durch Immunfärbung 

Veränderungen des Blutflusses der Eierstöcke während der präovulatorischen Periode sind für den Eisprung unerlässlich. Die Doppler-Sonographie wurde bei Menschen und Großtieren eingesetzt, um die Hämodynamik und Perfusion der Eierstöcke zu beurteilen. Es wird ein Protokoll für die Anwendung der Doppler-Sonographie zur Beurteilung der ovariellen Hämodynamik während der präovulatorischen und periovulatorischen Phase bei Mäusen vorgestellt.

Doppler-Sonographie zur Live-Bildgebung und Quantifizierung der Gefäßfunktion der Eierstöcke bei Mäusen

Die Hallo-C-Methode ermöglicht unvoreingenommene, genomweite Identifizierung von Chromatin-Wechselwirkungen (1). Hallo-C Paare Ligationssysteme und massiv parallele Sequenzierung. Die resultierenden Daten können verwendet werden, um genomische Architektur auf mehreren Skalen zu studieren: die ersten Ergebnisse identifizierten Features wie Chromosom Gebiete, Segregation von offenen und geschlossenen Chromatin und Chromatin-Struktur an der Megabasen.

Hallo-C: eine Methode, um die dreidimensionale Architektur des Genoms Study.

Erzeugung induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) Linien produziert Linien unterschiedlicher Entwicklungspotenzial, auch wenn sie Standard-Tests für Pluripotenz passieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Mäuse vollständig aus iPS, die die iPSC Linien definiert als die über volle Pluripotenz abgeleitet...

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Wir entwickelten eine Software-Plattform, Imaris Neuroscience, ImarisXT und MATLAB, um die Änderungen in der Morphologie einer undefinierten Form von dreidimensionalen konfokale Fluoreszenz einzelner Zellen aufgenommen zu messen verwendet. Dieser neuartige Ansatz kann verwendet werden, um Veränderungen in der Zellform nach Aktivierung des Rezeptors zu quantifizieren und stellt somit eine mögliche zusätzliches Werkzeug für die Wirkstoffforschung.

Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

Lernen Sie die passive CLARITY-Methode zur dreidimensionalen Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks bei der Maus. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung von Kapillarnetzwerken in intakten Ovarien.

Dreidimensionale Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks Passive Klarheit geclearte Maus

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