Dreidimensionale Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks Passive Klarheit geclearte Maus

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine vollständige dreidimensionale Ansicht der Kapillarverteilung in Ovarialfollikeln der Maus zu liefern und ihre Beziehungen aufzuzeigen. Der Eierstock ist ein essentielles Organ in der Fortpflanzung und in der Endokrinologie. Zählen Sie die verschiedenen Entwicklungsstadien des Follikels und der somatischen Zellen.

Darüber hinaus zeigt der Eierstock im Gegensatz zu anderen Organen keine wiederholte Verzweigung der Funktionseinheit. Das lokale Gefäßsystem kann zusammen mit dem Nervensystem auch in der Lage sein, bei erwachsenen Frauen in jedem Menstruationszyklus große Veränderungen zu erfahren. Die Anwendung der passiven Klarheit im Eierstock ermöglicht es uns, die Gesamtverteilung und die Verbindung zwischen diesen Zellen und Follikeln im Eierstock zu sehen.

Der wichtigste Schlüssel dieser Messung besteht darin, dass sie die geringsten Auswirkungen auf den Eierstock hat und für die Reinigung verschiedener Marker verantwortlich ist. Durch die Rekonstruktion des mikroskopischen Bildes haben wir eine Karte des Eierstocks erstellt. Einige Details der Gefäße, Neuronen und Follikel sind deutlich zu erkennen.

Für die Bildanalyse wurden einige Optionen von Imaris verwendet, um die Beziehungen zwischen dem Eierstock und den Strukturen zu bewerten. Bereiten Sie die reichhaltigen Lösungen gemäß der Artikelanleitung vor und bewahren Sie sie auf Eis auf. Betäuben Sie die Mäuse und stellen Sie sicher, dass die Maus nicht auf Zehenkneifen reagiert.

Sprühen Sie Ethanol, machen Sie einen Schnitt im rechten Vorhof und übergießen Sie den linken Ventrikel sofort mit 20 ml eiskaltem PBS mit einer Geschwindigkeit von 10 ml pro Minute, um das Blut auszuspülen. Dann das Tier mit der gleichen Geschwindigkeit mit kalter Hydrogellösung übergießen. Sammeln Sie sowohl die Eierstöcke als auch die Gebärmutter, um die Integrität der Eierstockmorphologie zu erhalten.

Übertragen Sie die getrennten Eierstöcke in die kalte Hydrogellösung. Entfernen Sie unter einem Stereomikroskop das Fettgewebe um den Eierstock. Für ein besseres Ergebnis der Gewebefixierung empfehlen wir die Entfernung des Schleimbeutels der Eierstöcke.

Bewahren Sie die Eierstöcke drei Tage lang in Hydrogel-Lösung auf. Übertragen Sie nach drei Tagen die Eierstöcke in ein Glasröhrchen und füllen Sie das Röhrchen mit frischer Hydrogellösung. Spannen Sie den Parafilm über die Oberseite des Schlauchs und wickeln Sie dann einen weiteren Parafilm um den Hals des Schlauchs.

Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen zwischen dem Parafilm und der Hydrogellösung befinden. Stellen Sie das Glasröhrchen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius auf einen Shaker-Inkubator, bis sich das Gel bildet. Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Gel um die Eierstöcke herum mit einem Papierfilter.

Geben Sie die Eierstöcke in eine 15-ml-Tube und füllen Sie die Tube mit 10 ml Reinigungslösung. Stellen Sie das Röhrchen mindestens zwei Monate lang bei 37 Grad Celsius auf einen Shaker-Inkubator. Wechseln Sie die Clearing-Lösung in den ersten drei Tagen jeden Tag und dann wöchentlich, bis der Eierstock frei ist.

Alle Immunfärbeverfahren werden bei 37 Grad Celsius auf einem Shaker durchgeführt. Waschen Sie zuerst den Eierstock 24 Stunden lang in PBST. Zweite Inkubation des Eierstocks in einem mit PBST verdünnten Primärantikörper für zwei Tage.

Drittens, waschen Sie die primären Antikörper mit PBST-Puffer ab. Viertens: Inkubieren Sie den Eierstock zwei Tage lang mit dem gewünschten Sekundärantikörper in PBST. Fünftens: Waschen Sie die Sekundärantikörper mit PBST ab.

Sechstens: Übertragen Sie den Eierstock in eine Brechungsindex-Matching-Lösung für die RI-Homogenisierung. Überprüfen Sie die visuelle Transparenz, wenn der Eierstock vollständig geklärt ist, kann er abgebildet werden. Bereiten Sie zunächst eine saubere Schüssel mit Glasboden vor.

Mache einen Spachtelzylinder und forme ihn in Form eines Hufeisens. Drücken Sie die äußere Kante fest auf den Objektträger, um einen geschlossenen Raum zu schaffen. Die Höhe des Kitts sollte etwas höher sein als die des Eierstocks.

Bewegen Sie den Eierstock vorsichtig in die Mitte und fügen Sie die Befestigungslösung hinzu. Schieben Sie eine Schüssel über die Spachtelmasse und verwenden Sie zwei Spachtelstücke, um sie zu fixieren. Wenn der Eierstock für die Aufnahme bereit ist, kann das Nikon-Konfokalmikroskop mit 16-fachem Objektiv ausgewählt werden, um ihn abzubilden.

Für die Bildgebung mit dem Konfokalmikroskop wählen Sie zunächst die Linse in der Ni-E-Platte. Wählen Sie in der Panel-Erfassung die Anzahl der Kanäle aus. Verwenden Sie zunächst die Registerkarte "Eye Port" und den Joystick des XY-Controllers, um das Gewebe durch Überprüfung mit Mikroskop-Okularen in die Mitte des Bildfelds zu bewegen.

Zweitens, nachdem Sie das Verschlusslicht ausgeschaltet haben, klicken Sie auf die Registerkarte Live, um die Laserleistung, die HV und den Offset für jeden Kanal anzupassen. Klicken Sie im Bedienfeld Z-Intensitätskorrektur auf die Aufnahme für die obere Schicht anpassen, klicken Sie auf die Plus-Schaltfläche, um die obere zu definieren, bewegen Sie die Linse nach unten und stellen Sie die entsprechende HV- und Laserleistung auf die Unterseite des Gewebes ein und fügen Sie die Informationen zur untersten Schicht hinzu. Klicken Sie auf Auf ND, um die Einstellung mit dem Panel und der Aufnahme zu synchronisieren. Legen Sie bei der Erfassung zunächst die Anzahl der Scanschritte fest.

Klicken Sie auf die Registerkarten Z und großes Bild. Gehen Sie zweitens zum Fenster "Großes Bild scannen", um die Größe des Feldes entsprechend dem Rand des Gewebes zu definieren. Drittens, kehren Sie zur ND-Erfassung zurück, um die Größe der Scanfelder einzugeben und die Überlappung innerhalb von 10 und 50% auszuwählenKlicken Sie dann auf Z-Korrektur ausführen und warten Sie auf den Bildgebungsvorgang.

Verwenden Sie zunächst imagic, um die ursprüngliche NIS-Datei zu öffnen. Klicken Sie auf die Bildschaltfläche, wählen Sie Farbe und Anzeigekanäle, klicken Sie dann auf Datei, wählen Sie Bildsequenzen aus und speichern Sie sie separat als TIFF-Dateien. Zweitens, verwenden Sie Imaris, um eine der TIFF-Dateien zu öffnen.

Klicken Sie auf die Schaltfläche "Bearbeiten" und wählen Sie die Kanäle hinzufügen, um den Rest hinzuzufügen. Der Name und die Farbe können in der Anzeigeanpassung geändert werden. Auch bei den Bildeigenschaften sollte die Dicke des Gewebes korrigiert werden.

Klicken Sie drittens auf die Schaltfläche Bearbeiten und wählen Sie 3D zuschneiden, um das zusätzliche Teil zu schneiden. Klicken Sie zuerst auf die Filament-Schaltfläche und dann auf Weiter. Gehen Sie zum Slice-Fenster, suchen Sie ein Tracing-Schiff und eine Entfernung, kehren Sie dann zum Surpass zurück, geben Sie die statische Angabe ein und klicken Sie auf Weiter.

Passen Sie dann den Start- und Sollwertschwellenwert an. Wählen Sie im Kamerafenster die Auswahl, drücken Sie die Umschalttaste und klicken Sie auf den Punkt, um das zusätzliche Teil zu entfernen. Drittens, wählen Sie den höchsten Schwellenwert und klicken Sie auf Weiter.

Wählen Sie nicht Erkennungspunkte aus, und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Einige überschüssige Teile können im Bearbeitungsfenster entfernt werden. Die Farbe kann durch Klicken auf die Farbe bearbeitet werden.

Die 3D-Architektur des ovaskulären Gefäßsystems wurde nach der Immunfärbung CD31 untersucht. Die 3D-Struktur kann entweder durch Schichten durch andere Schichten oder durch Ganzes durch Volumen-Rendering betrachtet werden. CD 31 ist eine Färbung der follikulären Gefäße adulter Mäuse.

Durch die Rekonstruktion der Kapillaren durch die Filamente konnten wir den Zusammenhang zwischen den einzelnen Follikeln und ihren Kapillaren aufzeigen. Der Eierstock ist, wie eine Frau, immer aktiv und austauschbar. Aufgrund der Einschränkungen der traditionellen histologischen Analyse ist es jedoch sehr schwierig, die Beziehungen zwischen solch komplexen Bestandteilen zu beschreiben.

Die neu entwickelte Methode, die passive Klarheit, kann uns helfen, das optische Hindernis zu überwinden, die Integrität des gesamten Gewebes zu bewahren und die funktionellen Hinweise zu liefern.