Dreidimensionale Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks Passive Klarheit geclearte Maus

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, eine vollständige dreidimensionale Ansicht der Kapillarverteilung in den Eibläschen der Maus zu liefern und deren räumliche Beziehungen darzustellen. Der Eierstock ist ein wesentliches Organ in der Fortpflanzung und der Endokrinologie. Zählen Sie jeweils die verschiedenen Entwicklungsstadien der Eibläschen sowie die somatischen Zellen.

Außerdem zeigt der Eierstock im Gegensatz zu anderen Organen keine wiederholte Verzweigung der funktionellen Einheit. Das lokale Gefäßsystem kann gemeinsam mit dem Nervensystem bei jedem Menstruationszyklus bei erwachsenen Frauen erhebliche Veränderungen durchlaufen. Die Anwendung der passiven Klärung im Eierstock ermöglicht es uns, die gesamte Verteilung und die Verbindungen zwischen diesen Zellen und Follikeln im Eierstock sichtbar zu machen.

Der wichtigste Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass es die geringste Wirkung auf den Eierstock hat und für die Klärung verschiedener Marker verantwortlich ist. Durch die Rekonstruktion des mikroskopischen Bildes haben wir eine Karte des Eierstocks erstellt. Einige Details der Blutgefäße, Neuronen und Follikel können deutlich beobachtet werden.

Zur Bildanalyse wurden einige Funktionen von Imaris verwendet, um die Beziehungen zwischen dem Eierstock und den Strukturen zu bewerten. Bereiten Sie die Perfusionslösungen gemäß der Artikelanleitung vor und stellen Sie sie auf Eis. Betäuben Sie die Mäuse und vergewissern Sie sich, dass keine Zehenquetschreflexantwort beim Tier vorhanden ist.

Spritzen Sie Ethanol, setzen Sie einen Einschnitt in das rechte Atrium und spülen Sie sofort das linke Ventrikel mit 20 ml eiskaltem PBS mit einer Geschwindigkeit von 10 ml pro Minute aus, um das Blut zu entfernen. Anschließend spülen Sie das Tier mit kalter Hydrogel-Lösung mit der gleichen Geschwindigkeit durch. Sammeln Sie die Eierstöcke sowie den Uterus, um die Integrität der ovariellen Morphologie zu bewahren.

Überführen Sie die separierten Eierstöcke in die kalte Hydrogel-Lösung. Entfernen Sie unter einem Stereomikroskop das Fettgewebe um den Eierstock herum. Für ein besseres Ergebnis der Gewebefixierung empfehlen wir, die Ovarialbursa zu entfernen.

Die Ovarien drei Tage lang in Hydrogel-Lösung belassen. Nach drei Tagen die Ovarien in ein Glasröhrchen überführen und das Röhrchen mit frischer Hydrogel-Lösung auffüllen. Eine Parafolien-Schicht über das Ende des Röhrchens spannen und anschließend eine weitere Parafolie um den Hals des Röhrchens wickeln.

Stellen Sie sicher, dass keine Blasen zwischen dem Parafilm und der Hydrogellösung vorhanden sind. Stellen Sie das Glasröhrchen zwei Stunden lang auf einen Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius, bis sich ein Gel gebildet hat. Entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Gel um die Eierstöcke herum mit einem Filterpapier.

Legen Sie die Eierstöcke in ein 15-ml-Röhrchen und füllen Sie das Röhrchen mit 10 ml Klärungslösung. Stellen Sie das Röhrchen für mindestens zwei Monate in einen Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius. Wechseln Sie die Klärungslösung in den ersten drei Tagen täglich und anschließend wöchentlich, bis die Eierstöcke durchsichtig geworden sind.

Alle Immunfärbungen werden bei 37 Grad Celsius auf einem Schüttler durchgeführt. Zuerst wird das Ovar 24 Stunden lang in PBST gewaschen. Anschließend wird das Ovar zwei Tage lang in der mit PBST verdünnten Primärantikörper-Lösung inkubiert.

Drittens spülen Sie die primären Antikörper mit PBST-Puffer ab. Viertens inkubieren Sie das Ovar mit dem gewünschten sekundären Antikörper in PBST für zwei Tage. Fünftens spülen Sie die sekundären Antikörper mit PBST ab.

Sechstens überführen Sie den Eierstock in eine Brechungsindex-anpassende Lösung zur RI-Homogenisierung. Überprüfen Sie die optische Transparenz; wenn der Eierstock vollständig geklärt ist, kann er abgebildet werden. Bereiten Sie zunächst eine saubere Glasbodenkulturbox vor.

Formen Sie einen Kittzylinder und gestalten Sie ihn zu einer Hufeisenform. Drücken Sie die Außenkante fest auf einen Objektträger, um einen abgedichteten Raum zu erzeugen. Die Höhe des Kitts sollte etwas höher sein als die des Ovars.

Bewegen Sie den Ovar vorsichtig in die Mitte und geben Sie Montagemedium hinzu. Setzen Sie eine Deckglasplatte auf die Kittmasse und verwenden Sie zwei Kittstücke, um sie zu befestigen. Wenn der Ovar zum Abbilden bereit ist, kann ein Nikon-Konfokalmikroskop mit 16-facher Objektivvergrößerung ausgewählt werden, um ihn abzubilden.

Für die Bildgebung mit dem konfokalen Mikroskop zuerst das Objektiv im Ni-E-Bedienfeld auswählen. Im Erfassungsbereich die Anzahl der Kanäle auswählen. Zuerst die Eye-Port-Registerkarte und den XY-Controller-Joystick verwenden, um das Gewebe mithilfe der Mikroskopokulare in die Bildmitte zu bewegen.

Zweitens, nachdem das Shutter-Licht ausgeschaltet wurde, klicken Sie auf den Reiter „Live“, um Laserleistung, HV und Offset für jeden Kanal anzupassen. Passen Sie im Bereich Z-Intensitätskorrektur die Aufnahme für die obere Schicht an, klicken Sie auf die Schaltfläche „Plus“, um die obere Ebene zu definieren, bewegen Sie das Objektiv nach unten und stellen Sie geeignete HV-Werte und Laserleistung am unteren Gewebeteil ein, fügen Sie die Informationen zur untersten Schicht hinzu und klicken Sie auf „To ND“, um die Einstellungen mit dem Bereich und der Aufnahme zu synchronisieren. Gehen Sie bei der Aufnahme zunächst dazu über, die Anzahl der Abtastschritte festzulegen.

Klicken Sie auf die Registerkarten Z und großes Bild. Gehen Sie anschließend zum Fenster „Scan großes Bild“, um die Feldgröße entsprechend dem Rand des Gewebes festzulegen. Danach kehren Sie zur ND-Aufnahme zurück, um die Größe der Scanfelder einzugeben und eine Überlappung zwischen 10 und 50 % zu wählen. Klicken Sie dann auf „Z-Korrektur ausführen“ und warten Sie den Bildgebungsprozess ab.

Verwenden Sie zuerst imagic, um die ursprüngliche NIS-Datei zu öffnen. Klicken Sie auf den Bild-Button, wählen Sie Farbe und Anzeigekanäle aus und klicken Sie dann auf Datei, wählen Sie Bildsequenzen aus und speichern Sie diese getrennt als TIFF-Dateien. Zweitens verwenden Sie Imaris, um eine der TIFF-Dateien zu öffnen.

Klicken Sie auf die Schaltfläche „Bearbeiten“ und wählen Sie „Kanäle hinzufügen“, um die restlichen hinzuzufügen. Der Name und die Farbe können in der Anpassung der Anzeige geändert werden. Die Dicke des Gewebes sollte ebenfalls in den Bildeigenschaften korrigiert werden.

Drittens klicken Sie auf die Bearbeitungsschaltfläche und wählen Sie „Crop 3D“, um den überflüssigen Teil abzuschneiden. Klicken Sie zuerst auf die Filamentschaltfläche und danach auf „Weiter“. Gehen Sie zum Slice-Panel, finden Sie ein nachzuzeichnendes Gefäß und den Abstand, kehren Sie dann zum Surpass zurück, geben Sie den statischen Wert ein und klicken Sie auf „Weiter“.

Zweitens passen Sie den Start- und den Sollwert-Schwellenwert an. Wählen Sie im Kamerapanel „Auswählen“, drücken Sie die Umschalttaste und klicken Sie auf den Punkt, um den zusätzlichen Teil zu entfernen. Drittens wählen Sie den höchsten Schwellenwert und klicken Sie auf „Weiter“.

Wählen Sie keine Erkennungspunkte aus und fahren Sie fort. Einige überflüssige Teile können im Bearbeitungsfenster entfernt werden. Die Farbe kann bearbeitet werden, indem auf die Farbe geklickt wird.

Die 3D-Architektur des Eierstock-Gefäßsystems wurde nach Immunfärbung von CD31 untersucht. Die 3D-Struktur kann entweder durch Einzelschnitte oder im Gesamtbild mittels Volumenrendering betrachtet werden. Die CD31-Färbung des adulten, follikulären Gefäßsystems der Maus wurde durchgeführt.

Über die Rekonstruktion der Kapillaren durch die Filamente konnten wir die Beziehung zwischen den einzelnen Follikeln und ihren Kapillaren aufzeigen. Der Eierstock ist, wie eine Frau, stets aktiv und austauschbar. Aufgrund der Einschränkungen der traditionellen histologischen Analyse ist es jedoch sehr schwierig, die Beziehungen zwischen solch komplexen Bestandteilen zu beschreiben.

Die neu entwickelte Methode, passive clarity, könnte uns dabei helfen, die optischen Hindernisse zu überwinden, die Integrität des gesamten Gewebes zu bewahren und funktionelle Hinweise zu liefern.