Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, homogene humane induzierte pluripotente Stammzellen zu gewinnen. Diese Methode kann verwendet werden, um humane induzierte pluripotente Stammzellen für viele Zwecke zu gewinnen, einschließlich der Modellierung von Krankheiten, des Wirkstoffscreenings oder zur Gewinnung von Zellen für präklinische Zelltherapiestudien. Der Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es robust ist und homogene Zellen erzeugt, die in einem benutzerfreundlichen, Xeno-freien und vollständig chemisch definierten Kultursystem aufbewahrt werden.

Da humane iPS-Zellen den genetischen Hintergrund des Spendergewebes rekapitulieren und potenziell in jeden krankheitsrelevanten Zelltyp differenziert werden können, bieten sie hervorragende Werkzeuge für die Modellierung von Abschlussarbeiten. Die Biopsiedissektion und die Kolonieentnahme sind komplizierte Verfahren. Wenn Sie sehen, wie sie mit erfahrenen Händen durchgeführt werden, hilft dies beim Verständnis der Verfahren und erleichtert die Wiederholung.

Harriet RonnHolm und Kelly Day, zwei sehr erfahrene Labortechnikerinnen der iPS Core Facility am Karolinska Institutet, werden das Verfahren heute vorführen. Hautbiopsieproben können in PBS plus 1 % Penicillin-Streptomycin bis zu 48 Stunden bei vier Grad Celsius gelagert werden, sollten aber so schnell wie möglich nach der Entnahme verarbeitet werden. Übertragen Sie die Biopsie in eine 35-Millimeter-Schale.

Tauchen Sie die Hautbiopsie 30 Sekunden lang in eine 35-Millimeter-Schale mit zwei Millilitern 70%igem Ethanol. Geben Sie einen Milliliter sterile Hank's Balanced Salt Solution, ergänzt mit 1 % Penicillin-Streptomycin, in eine neue 35-Millimeter-Schale und übertragen Sie die Biopsie in die neue Schale. Übertragen Sie die Biopsie in eine 35-Millimeter-Schale mit vier Millimetern, die mit einem Milliliter frisch zubereiteter 0,1%iger Dispaselösung gefüllt ist.

Schneiden Sie die Hautbiopsie mit sterilen chirurgischen Skalpellen und Pinzetten in ein bis zwei Kubikmillimeter große Stücke. Übertragen Sie die Biopsiestücke mit der Dispaselösung in ein 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie weitere zwei Milliliter Dispase hinzu. Spülen Sie die 35-Millimeter-Schale mit einem Milliliter Dispaselösung und geben Sie die gespülte Lösung in das 15-Milliliter-Röhrchen.

Inkubieren Sie die Biopsie über Nacht bei vier Grad Celsius. Geben Sie am nächsten Morgen vier Milliliter 0,1%ige Kollagenase I in das Röhrchen mit den Biopsiestücken und inkubieren Sie vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Dreißig Minuten vor der Aussaat der Zellen eine Vertiefung in einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte mit einem Milliliter 0,1 % Gelatine in DPBS beschichten.

30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach vierstündiger Inkubation mit Kollagenase zentrifugieren Sie die verdauten Zellen bei 300-mal g für drei Minuten bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie den Verdau in zwei Millilitern Fibroblastenmedium.

Entfernen Sie die Gelatinelösung aus der zuvor vorbereiteten Sechs-Well-Gewebekulturplatte. Übertragen Sie die Zellsuspension einschließlich der verbleibenden Gewebestücke auf die Sechs-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid bei hoher Luftfeuchtigkeit.

Fibroblasten sind bereit, in einen T25-Gewebekulturkolben überführt zu werden, wenn sie zu 80 % konfluierend sind. Fibroblasten an der Passage zwei bis vier sind optimal für die Reprogrammierung, da die Reprogrammierungseffizienz bei Fibroblasten mit niedrigerer Passage im Allgemeinen höher ist. Das Zellkulturmedium wird aus dem Kolben aspiriert und die Zellen mit einem Milliliter DPBS gewaschen.

Aspirieren Sie das DPBS und fügen Sie einen Milliliter 0,5 % Trypsin-EDTA hinzu. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten oder bis die Zellen abgelöst sind. Fügen Sie zwei Milliliter Fibroblastenmedium hinzu, resuspendieren Sie die Zellen und geben Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Bei 300 mal g drei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern Fibroblastenmedium. Nach dem Zählen der Fibroblasten mit einem Hämazytometer säen Sie fünfmal 10 bis zu den vierten Zellen in einer Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte aus.

Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Da das Sendai-Virus am nächsten Tag behandelt wird, setzen Sie das Verfahren in einem ausgewiesenen BSL-2-Labor fort, während Sie die entsprechende persönliche Schutzausrüstung verwenden. Aspirieren Sie das Zellkulturmedium und fügen Sie 250 Mikroliter Sendai-Viruslösung hinzu.

Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie einen Tag vor der Entnahme der Kolonien LN-521-beschichtete 24-Well-Gewebekulturplatten vor. Pipettieren Sie 250 Mikroliter LN-521-Lösung in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte.

Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag aspirieren Sie die LN-521-Lösung aus der einen Vertiefung der 24-Well-Platte und geben Sie 500 Mikroliter E8 in die Vertiefung. Die Verwendung eines Haarnetzes und einer Eingriffsmaske wird empfohlen, wenn Kolonien unter dem Stereomikroskop entnommen werden.

Die Kolonien sind bereit für die Pflückung, wenn sie einen Durchmesser von mehr als einem Millimeter erreichen, scharfe Kanten aufweisen und in homogenen Monolagen wachsen. Wählen Sie keine Kolonien mit unscharfen Rändern und großen, unkompakten heterogenen Zellmassen. Schneide jedes Volk mit einem Skalpell in einem gitterartigen Muster in kleinere Stücke.

Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um die Zellblätter mechanisch von der Schale zu kratzen, und übertragen Sie die Folie dann in eine Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte, die zuvor mit LN-521 beschichtet war. Die Auswahl der Kolonie ist entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls. Wenn du ein paar zusätzliche Kolonien auswählst, kannst du sicherstellen, dass sie sich in ausreichender Anzahl anheften.

Lassen Sie die Zellen 48 Stunden lang anheften, ohne das E8-Medium zu wechseln. Durchlaufen Sie die Zellen enzymatisch, wenn die Kolonien eine Größe von mehr als fünf Millimetern erreicht haben. Aspirieren Sie das Zellkulturmedium aus den Zellen und waschen Sie es mit 250 Mikrolitern DPBS.

Aspirieren Sie das DPBS und fügen Sie 250 Mikroliter Dissoziationsreagenz hinzu. Inkubieren Sie drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Beobachten Sie, dass die Zellen begonnen haben, sich aufzurunden.

Trennen Sie die Zellen von der Platte, indem Sie die Zellen mit Dissoziationsreagenz spülen. Geben Sie 500 Mikroliter E8-Medium in ein 15-Milliliter-Röhrchen und übertragen Sie die Zellen und das Dissoziationsreagenz in das Röhrchen. Bei 300 mal g drei Minuten lang zentrifugieren.

Aspirieren Sie den Überstand aus dem 15-Milliliter-Röhrchen und resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern E8-Medium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer und säen Sie 2,5 bis fünfmal 10 bis die vierten Zellen in eine andere, zuvor vorbereitete LN-521-Vorbeschichtungsvertiefung, die 500 Mikroliter E8-Medium bei Raumtemperatur enthält. ROCK-Inhibitor bis zu einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren zugeben.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Unter Verwendung dieses Protokolls entstehen humane induzierte pluripotente Stammzellkolonien aus transduzierten Fibroblasten etwa am 12. Tag nach der Transduktion. Die Kolonien waren etwa drei bis vier Wochen nach der Transduktion bereit, geerntet zu werden.

Zu den bevorzugten Merkmalen gehören abgeflachte, kompakte Zellmassen, Wachstum als homogene Monoschichten und scharfe Kanten. Diese Hellfeldbilder zeigen eine frühe Passage einer homogenen, vollständig reprogrammierten humanen iPS-Zelllinie im Vergleich zu einer sehr heterogenen Zelllinie. Der Verlust des Sendai-Virus-Vektors wurde durch das Fehlen von Sendai-Virus-Vektor-spezifischen Markern in humanen iPS-Zellen an der Passage 12 im Gegensatz zu humanen iPS-Zellen an der dritten Passage bestätigt.

Die immunzytochemische Färbung abgeleiteter Zellen auf die Pluripotenzmarker OCT4, SSEA-4 und NANOG ergab ein homogen positives Ergebnis. Die mRNA-Expression endogener Pluripotenzgene wurde mittels reverser Transkriptase-PCR gezeigt. Zellkulturen, die teilweise reprogrammierte Zellen enthielten, die keine Pluripotenzfaktoren exprimierten, wurden verworfen.

Das Differenzierungspotenzial humaner iPS-Zellen wurde durch die Bildung von Embryoidkörpern bewertet. Die Echtzeit-PCR nach 21 Tagen Differenzierung des Embryoidkörpers detektierte die mRNA-Expression von Endoderm-, Mesoderm- und Ektoderm-spezifischen Markern, was bestätigte, dass die abgeleiteten humanen iPS-Zellen in der Lage waren, sich zu den drei Keimblättern zu differenzieren. Einmal gemeistert, kann diese Technik mit etwa 22 Stunden praktischer Zeit über einen Zeitraum von etwa 16 Wochen durchgeführt werden.

Die gewonnenen humanen induzierten pluripotenten Stammzellen können in jeden Zelltyp des erwachsenen menschlichen Körpers differenziert werden, um alle für Ihr Forschungsgebiet relevanten Fragen zu beantworten. Wir hoffen, dass Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die notwendigen Schritte zur Gewinnung induzierter pluripotenter Stammzellen aus Hautbiopsien durchführen können.