Name: Elektrophysiologische Aufzeichnung von Drosophila Trichoid Sensilla in Reaktion auf Odoranten der niedrigen Volatilität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Erfahren Sie die elektrophysiologische Aufzeichnung von Drosophila-Trichoid-Sensilla bei der Reaktion auf niedrigvolatile Odoranten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Pheromonantworten in vivo.

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Wir danken Ye Zhang für die Hilfe mit den Musterspuren und Tin Ki Tsang für die Hilfe mit den Bildern. Diese Arbeit wurde von einem Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award und einem NIH Grant (R01DC015519) an C.-YS und NIH Zuschüsse (R01DC009597 und R01DK092640) an JWW unterstützt

1. Vorbereitung der Hardware für at4 Aufnahme <ol><li> Zur Herstellung von Elektroden mit Aluminosilikatglas-Kapillaren (OD 1,0 mm, ID 0.64 mm) ein Pipetten-Puller-Instrument verwenden. Stumpfen Sie die Spitze der Referenzelektrode leicht mit einem Paar feiner Pinzette, um das Einsetzen in den Clypeus der Fliege zu erleichtern ( dh eine abgerundete Platte an der Vorderseite des Fliegenkopfes, über den Mundstücken). HINWEIS: In dieser Studie wurden 7 Tage alte WT-Männer (Berlin) verwendet. Verwenden Sie die AHL-Salzlösung 14 als Elektrolyt für beide Elektroden. </li><li> 1 l AHL durch Mischen von 900 ml destilliertem Wasser mit 6,312 g NaCl, 0,373 g KCl, 0,337 g NaHCO 3 , 0,1120 g NaH 2 PO 4 , 1,892 g Trehalose ּ 2 H 2 O, 3,4423 g Saccharose, 1,192 g HEPES und 8,2 ml 1 M MgCl 2 . Mit destilliertem Wasser das Gesamtvolumen auf 1 L bringen. Den pH-Wert mit 1 N NaOH auf 7,4 bringen und die Lösung mit a. SterilisierenVakuum-angetriebenes Filtersystem. Zur Langzeitlagerung die AHL-Aliquote bei 4 ° C aufbewahren. HINWEIS: Konsequente Lieferungen von Palmitoleinsäure sind abhängig von der Gleichmäßigkeit der Patronen. Es ist entscheidend, dass jede Patrone reproduzierbar zusammengebaut wird. </li><li> Mit einer Rasierklinge 0,9 cm von der Spitze einer 200 μl Pipettenspitze entfernen, um den ersten Patronenabschnitt zu erzeugen, der 4,1 cm misst; Beziehen sich auf die in Abbildung 1A angegebenen Abmessungen. Benutzen Sie eine weitere 200 μl Pipettenspitze und entfernen Sie 1,7 cm und 1,5 cm von der Spitze und der Basis, um den zweiten Patronenabschnitt zu erzeugen, der 1,8 cm misst ( Abbildung 1A ). Verwenden Sie ein Lineal, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. </li><li> Verwenden Sie einen ⅛ &quot;Lochpuncher, um Scheiben aus Filterpapier zu schneiden. </li><li> Verwenden Sie eine Pinzette, um eine Filterpapierscheibe an der Spitze des zweiten Patronenabschnitts zu platzieren. Visuell bestätigen, dass es eine Öffnung in der Patronenspitze gibt, durch die Luft hindurchtreten kann. </li><li> Befestigen Sie die ersten und zweiten Patronenabschnitte wie in Abbildung 1A gezeigt . Winkeln Sie den zweiten Patronenabschnitt nach unten, um das quadratische Ziel auf die Präparation zu erleichtern ( Abbildung 1B ). </li><li> Verbinden Sie die Patrone mit dem Geruchsabgaberohr, das auf einem Mikromanipulator montiert ist. HINWEIS: Mit dieser Konstruktion kann die Patrone nach außen geschwenkt werden, um den Austausch zu erleichtern ( Abbildung 1C ). </li><li> Setzen Sie den konstanten befeuchteten Luftstrom auf 2 l / min in einem Massenregler und der Riechstofffluss auf 500 mL / min in einem anderen Massenkontroller. </li><li> Verwenden Sie die Software (siehe Tabelle der Materialien ), programmieren Sie die Prozedur, um einen 500 ms Geruch puff zu verabreichen. </li></ol> 2. Vorbereitung von Palmitoleinsäure-Geruchslösungen zur Lieferung HINWEIS: Or47b ORNs reagieren sowohl auf cis - als auch auf trans - Palmitoleinsäure. Da Palmitoleinsäure bei R instabil istT, die Lagerbestände werden bei -20 ° C gelagert und innerhalb eines Monats nach dem Öffnen verwendet. Ethanol ist das Lösungsmittel der Wahl für Palmitoleinsäure. <ol><li> Verwenden eines Vortex - Mischers gründlich 10 ul cis- zu mischen oder Palmitoleinsäure Aktien oder Verdünnungen mit 90 &amp; mgr; l 100% Ethanol für zehnfache Reihenverdünnungen in 1,7 ml Mikroröhrchen trans-. Bereiten Sie frische Palmitoleinsäure-Verdünnungen täglich vor Versuchen und Gebrauch innerhalb eines Tages vor. HINWEIS: Für Geruchsstoffe, die in Ethanol nicht löslich sind, wird eine Glasampulle zur Herstellung von Geruchsverdünnungen mit anderen organischen Lösemitteln empfohlen. </li><li> Unter Verwendung einer P10-Mikropipette werden in jeder entsprechenden Patrone 5 &amp; mgr; l cis- Palmitoleinsäure-Lösungen der gewünschten Verdünnungen auf das Filterpapier gegeben. HINWEIS: Die höchste Dosierung (10 -1 ) enthält 450 μg der Verbindung. Für trans- Palmitoleinsäurelösungen gelten stattdessen 4,5 μl, so dass die höchste Dosierung (10 -1 ) auch 450 μg t enthältEr zusammen. </li><li> Um das Lösungsmittel vollständig zu verdampfen, legen Sie die Palmitoleinsäurepatronen in einen Vakuumexsikkator für 1 h bei RT und 7,59 mmHg Druck. HINWEIS: Die Patronen können bis zu 4 h bei RT verwendet werden. </li></ol> 3. Vorbereitung von Drosophila für den reinen Zugang zu den at4 Sensilla für In-vivo- elektrophysiologische Aufnahmen ANMERKUNG: WT-Fliegen (Berlin) werden im Standard-Maismehl-Medium bei 25 ° C im 12:12 Hell-Dunkel-Zyklus aufgezogen. Nach der Eklosion werden die Fliegen durch Geschlecht in Gruppen von zehn getrennt, wobei sie bis 7 Jahre alt sind. Or47b ORNs in männlichen und weiblichen Fliegen reagieren auf Palmitoleinsäure. Zur Vereinfachung werden in der aktuellen Studie nur männliche Fliegen untersucht. <ol><li> Montieren Sie eine Fly-Prep-Folie: Auf einem Glasschieber legen Sie ein Glasdeckel (18 x 18 mm 2 ) auf eine kleine Menge von Modellier-Ton, bilden einen ~ 3 ° Winkel mit der Glasrutsche. Legen Sie doppelseitiges Klebeband auf die innere eDge des Deckglases und auf dem Bereich der Rutsche unmittelbar darunter. Ersetzen Sie mit frischem Klebeband für jeden Tag der Aufnahme ( Abbildung 2A ). </li><li> Benutze einen Fliegenaspirator 15 , um die Fliege des Interesses in den Schlauch zu sammeln und dann eine 200-μl Pipettenspitze über das Ende des Schlauches zu platzieren. Gleichzeitig blättern Sie die Röhre nach vorne, während Sie Luft in die Röhre blasen, um die Fliege zum Ende der Pipettenspitze zu drücken. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um direkt unter dem Körper der Fliege und 2 Köpfe Längen über der Fliege zu schneiden. </li><li> Tamp den Boden der Pipettenspitze mit modellierendem Ton und drückt die Fliege nach oben, bis sowohl die Antennen als auch der Clypeus ausgesetzt sind ( Abbildung 2B ). Um zu vermeiden, die Fliege zu töten, füge nur genug Lehm hinzu, um die Antennen und die Arena zu entlarven, da dies verhindert, dass der Fliegenabdomen zerdrückt wird. Darüber hinaus fügen Sie Ton langsam und sanft, um jede plötzliche Verengung zu verhindern. Vergewissern Sie sich, dass die Fliege am Leben ist, indem Sie auf Antenne prüfenOder Rüsselbewegung. </li><li> Verwenden Sie Pinzette, um die Pipettenspitze zu manövrieren, die die Fliege beherbergt. Orientieren Sie den Kopf so, dass der Clypeus dem Recht des Beobachters gegenüber steht. Stellen Sie die Vorbereitung entlang des Deckglases mit feiner Pinzette ein, bis die laterale Seite der Antenne an der geklebten Deckglasoberfläche anliegt ( Abbildung 2B ). </li><li> Legen Sie eine Haltestange auf den Arista, um die Antenne auf dem doppelseitigen Klebeband zu befestigen, um eine Bewegung zu verhindern ( Abbildung 2B ). HINWEIS: Die Haltestange wird aus einer Borosilikatglaskapillare mit einem Pipettenabzieher gezogen und mit modelliertem Ton in Position gehalten ( Abbildung 2A ). </li><li> Legen Sie die Vorbereitung auf die Bühne der Anlage ( Abbildung 2C ). Mit dem Mikroskop bestätigen Sie, dass die Trichoide entlang der distal-lateralen Kante des dritten Segments der Antenne sichtbar sind. HINWEIS: Im Idealfall sollte die Sensilla vor dem Hintergrund klar silhouettiert werden, was sie vereinfacht<html> Identifizierung und erleichtert die Aufnahme ( Abbildung 3 ). Bei dieser Vorbereitung ist die Mehrheit der zugänglichen Trichoid-Sensilla vom Typ &quot;at4&quot;. </li><li> Halten Sie die Vorbereitung unter konstant befeuchtetem Luftstrom (2 l / min), die über ein separates Luftförderrohr aus einem Abstand von etwa 2 cm von der Vorbereitung ( Abbildung 4 ) geliefert wird, wie zuvor beschrieben, 2 , 15 . </li></ol> 4. Aufzeichnung von at4 Sensillum-Aktivität von Or47b-ORNs in den at4-Trichoiden in Reaktion auf Palmitoleinsäure <ol><li> Setzen Sie die Referenzelektrode in den Clypeus ein ( Abbildung 3A ). Um Gewebeschäden zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Elektrode direkt unter der Oberfläche eingesetzt wird, wo sie die Hämolymphe unter der Nagelhaut mit einer schnellen und sanften Bewegung berühren kann. </li><li> Senken Sie die Aufzeichnungselektrode langsam ab, bis sie in die gleiche Draufsicht tritt wie das Ziel-Sensillum (= &quot;Xfig&quot;&gt; Abbildung 3B). Aufnehmen unter einem Objektiv von 50X. HINWEIS: Die zähe Trichoidkohle macht das Einsetzen der Aufzeichnungselektrode in die sensilläre Basis, deren breiterer Bereich ein größeres Ziel bietet, das die Wahrscheinlichkeit verringert, dass die Elektrode abgelenkt wird ( Abbildung 3B , Einfügung). </li><li> Bevor Sie Geruchsreize auf ein Sensillum anwenden, beachten Sie die folgenden Selektionskriterien. Jeder Trichoid, der diese Standards nicht erfüllt, sollte abgelehnt und stattdessen ein anderes Sensillum gewählt werden. <ol><li> Beachten Sie ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis (siehe Abbildung 3C für ein Beispiel). </li><li> Beobachten Sie identifizierbare Spikes von at4A und at4C Neuronen ( Abbildung 3C ). HINWEIS: Die Note der at4B-Spitze ist sehr ähnlich zu at4A 10 und kann nicht leicht ohne Geruchsstimulation identifiziert werden. </li><li> Beachten Sie, dass die basale Zündrate der at4A Neuronen istUm oder unter 20 Hz. HINWEIS: Dieses Kriterium ist für at4A spezifisch, da die basale Brennrate für das Neuron höher ist als die der basiconischen ORNs 2 . Eine viel höhere Basalfeuerung zeigt an, dass die Neuronen während der Elektrodeneinfügung beschädigt worden sein könnten. </li></ol></li><li> Verbinden Sie die Patrone mit dem Riechentransportrohr. Beginnen Sie mit der Lösungsmittelkontrolle und dann den Geruchsstoffen von niedrigen zu hohen Konzentrationen. Benutzen Sie den Mikromanipulator, um die Patrone in Richtung Prep zu manövrieren, während Sie die Patrone quadratisch an den Kopf der Präp. Achten Sie darauf, dass die Patrone von wenigen Millimetern direkt direkt auf die Antenne ( Abbildung 4 ) gerichtet ist. HINWEIS: Ziel ist es, das Öffnen der Patrone direkt an der Antenne auszurichten und in der Nähe des Zielgewebes zu positionieren. </li><li> Vergewissern Sie sich, dass die Duftstoffpatrone von der Aufzeichnungselektrode rechts von 1 - 2 mm und von der Fliege vorn getrennt istP um ca. 1 mm nach unten schieben. HINWEIS: Bei der hier beschriebenen Einrichtung wird die Duftstoffpatrone eng von der Aufzeichnungselektrode, der Referenzelektrode und der Fliegenvorbereitungsschiene ( Abbildung 4 ) begrenzt. HINWEIS: Achten Sie auf den Abstand zwischen der Patrone und den Aufzeichnungs- / Referenzelektroden. Ein Abstand von ca. 4 mm wird empfohlen 1 . Der unbeabsichtigte Kontakt kann das Signal beenden und die Spitze der Aufzeichnungselektrode brechen, das aktuelle Neuron beschädigen und weitere Aufnahmen komplizieren. HINWEIS: Betrachten Sie den Abstand, der die Patrone trennt, und die Fly-Prep-Folie. Das Berühren des Deckglases kann auch die Aufzeichnungselektrode entfernen, um die Aufzeichnung zu stören. </li><li> Drücken Sie &quot;Record&quot; in der Datenerfassungssoftware, um die Aufnahme zu starten. HINWEIS: Für jede 10-s-Aufzeichnung wird ein einziger 500 ms-Geruchsimpuls direkt an die Antenne geliefert, wie in Schritt 1.9 beschrieben. </li><li> Nach riechender Anwendung,Ziehen Sie die Patrone vorsichtig zurück, bevor Sie sie mit einer Patrone der nächsthöheren Konzentration ersetzen. Weiter bis der gesamte Dosierungsbereich erreicht ist. HINWEIS: Es wird empfohlen, von jeder Fliege nur ein Or47b ORN zu erfassen, um eventuelle Auswirkungen der Anpassung zu vermeiden. </li><li> Spülen Sie die Aufzeichnungselektrode gründlich mit destilliertem Wasser ab, nachdem Sie die Aufzeichnung für den Tag abgeschlossen haben. </li><li> Analysieren und zeichnen Sie die Daten mit handelsüblicher Offline-Analyse-Software. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier haben wir ein Verfahren beschrieben, mit dem die Reaktionen von Or47b ORNs auf Palmitoleinsäure robust induziert und aufgezeichnet werden können. Wir haben eine herkömmliche Langstrecken-Geruchsabgabemethode 2 , 7 , 10 modifiziert , um das Problem der unzureichenden Pheromon-Geruchsabgabe zu beheben. Wir haben das Problem der geringen Geruchsbelastung angesprochen, indem wir die Verbindung über Odorantpatronen l...

<html> Drosophila ORNs reagieren auf eine Vielzahl von Geruchsstoffen mit weitreichenden Kohlenstoffkettenlängen und einer Vielzahl von funktionellen Gruppen, einschließlich Estern, Alkoholen, Ketonen, Lactonen, Aldehyden, Terpenen, organischen Säuren, Aminen, Schwefelverbindungen, Heterocyclen und Aromaten 2 , 3 Geruchsstoffe, die in ihren physikalisch-chemischen Merkmalen variieren, können deutlich unterschiedliche Volatilitäten aufweisen, die durch den Dampfdruck der Verbindung gekennzeichnet sind. Bemerkenswerterweise unterscheiden sich biologisch relevante Geruchsstoffe für Drosophila melanogaster in ihrer Flüchtigkeit stark. Zum Beispiel reagieren Ir92a ORNs auf Ammoniak 4 , das sehr flüchtig ist, mit einem Dampfdruck von 6,432 mmHg bei 20 ° C. Im Gegensatz dazu reagieren Or67d ORNs auf ein männliches Pheromon, cis- Vccccylacetat ( c VA) 5 , 6 , dessen Dampfdruck 43 mmHg bei 20 ° C beträgt. Ove_content &quot;&gt; Das Studium der olfaktorischen Reaktion auf Geruchsstoffe mit geringer Flüchtigkeit ist bei herkömmlichen Geruchsabgabemethoden besonders anspruchsvoll, bei denen die Geruchsstoffe über einen Trägerluftstrom über einen relativ langen Abstand ( dh mehrere Zentimeter) zugeführt werden, so dass die berichteten Geruchsreaktionen vorliegen Zu einem gegebenen geringe Volatilitätsgeruch kann je nach Ausgestaltung des Geruchsabgabesystems stark variieren. Beispielsweise reicht die berichtete Reaktion von Or67d ORNs auf eine hohe Dosis von c VA von ~ 40 7 -&gt; 200 Spikes / s 6 Darüber hinaus ist die ineffektive Abgabe von c VA mit konventionellen Verabreichungsmethoden wahrscheinlich auf falsch-negative Ergebnisse zurückzuführen, was zu der Interpretation führt, dass c VA allein nicht ausreicht, um Or67d ORNs 8 zu aktivieren. Diese Interpretation wurde später von einer anderen Studie mit einem Nahbereichs-Geruchslieferungsverfahren 9. Es ist daher imperaUm ein robustes Geruchsabgabesystem für die effektive Darstellung von Geruchsstoffen mit geringer Volatilität zu entwickeln. Vor kurzem haben wir mehrere langkettige cutikuläre Fettsäuren als Liganden für Or47b ORNs identifiziert. Sie sind im Typ 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4) untergebracht. Unter den langkettigen Fettsäure-Geruchsstoffen fanden wir, dass Palmitoleinsäure als aphrodisiakales Pheromon wirkt, das die männliche Balz durch die Aktivierung von Or47b ORNs 1 fördert. Jedoch wurde in einer anderen Studie, die ein herkömmliches Geruchsverabreichungsverfahren verwendete, Methyllaurat gezeigt, um Reaktionen von Or47b-ORNs hervorzurufen, während Palmitoleinsäure keine Antwort hervorrief, wenn sie aus dem gleichen Abstand 10 präsentiert wurde . Im Vergleich zu c VA sind langkettige Fettsäuren noch weniger flüchtig, mit Dampfdrücken von weniger als 0,001 mmHg bei 25 ° C 11 . Die inhärent geringe Flüchtigkeit von langkettigen Fettsäure-Geruchsstoffen, die eine effiziente Darstellung der Antenne ausschließtKonventionelle Geruchsabgabesysteme, wahrscheinlich die falsch-negativen Ergebnisse 10 . Diese Inkonsistenz hebt die Unzulänglichkeit konventioneller Geruchsabgabesysteme bei der Präsentation von Geringmachter-Geruchsstoffen hervor. Es wurde zuvor gezeigt, dass die effektive Abgabe von Fliegen-Cuticular-Gerüchen eine enge Nähe zwischen der Geruchsquelle und dem Zielgewebe 6 erfordert. Um also die Wirkungen von biologisch aktiven Pheromonen vollständig zu charakterisieren, während man den Abstand, von dem sie wahrscheinlich von Fruchtfliegen in der Natur 12 , 13 angetroffen werden, imitiert, haben wir vereinbart, dass der minimalen Abstand in unserem Verfahren eine hohe Priorität eingeräumt werden muss. Unsere Methode hat weitere Vorteile, einschließlich der Kompatibilität mit Standard-Elektrophysiologie Rigs und Techniken. Vorhandene Rig-Setups erfordern eine minimale Modifikation, um dieses Protokoll aufzunehmen, und die meisten SSR-Schritte erfordern nur geringfügige Anpassungen. DiesMacht unsere Technik für Forscher, die in SSR erfahren sind, leicht zugänglich. Darüber hinaus ermöglicht unsere Technik die Präsentation von geringen Volatilitätsgerüchen mit scharfem Einsetzen und Offset, Korrelation der Stimulusabgabe mit neuronaler Reaktion. Schließlich erleichtert das Hardware-Layout einen schnellen Austausch zwischen Duftkartuschen und beschleunigt die Datenerfassung über einen gewünschten Dosierungsbereich. Wir beginnen mit der Überprüfung der Vorbereitung von Referenz- und Aufzeichnungselektroden, Adult Hemolymph-Like (AHL) -Lösung, Odorant-Patronen und dem entsprechenden Olfaktometer. Wir diskutieren dann die Vorbereitung der Palmitoleinsäure-Geruchslösungen, gefolgt von der Vorbereitung der Fliege zur Aufzeichnung. Wir betrachten die Kriterien für die Auswahl eines Trichoid-Sensillums, um die Positionierung der Odoranzpatrone aufzuzeichnen und genauer zu untersuchen, bevor repräsentative Daten, die mit dieser Methode gewonnen wurden, präsentiert werden. Schließlich schließen wir durch die Erforschung nützlicher Anwendungen dieser techniqUe, einige begegnete Probleme und ihre Lösungen.

<table><tbody><tr><td>Prep Einrichtung & Sonstige Materialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenabzieher-Instrument&nbsp;</td><td>Sutter Instruments Novato CA</td> USA <td>P97</td><td>Pipettenabzieher</td></tr><tr><td>Borosilikatglas Kapillaren</td><td>World Precision Instruments Sarasota FL USA</td><td>1B100F-4</td><td>zur Herstellung von Haltestangen</td></tr><tr><td>Aluminosilikatglas Kapillaren&nbsp;</td><td>Sutter Instruments Novato CA USA</td><td>AF100-64-10</td><td>zur Herstellung von Elektroden</td></tr><tr><td>Superfrost Objektträger</td><td>Fisher Scientific Pittsburgh PA USA</td><td>12-550-143</td><td>für Fly-Prep</td></tr><tr><td>Station Permanent Double Sided Tape</td><td>Scotch St. Paul MN USA</td><td></td><td>NA für Fly-Prep Station</td></tr><tr><td>Upright Mikroskop</td><td>Olympus Shinjuku Tokyo Japan</td><td>BX51</td><td>für das Aufnahmerigg</td></tr><tr><td>Plastalina Modelliermasse</td><td>Van Aken North Charleston SC USA</td><td>B0019QZMQQ</td><td>für die Vorbereitungsstation und zur Stabilisierung der Haltestange</td></tr><tr><td>Rapid-Flow Sterile Einweg-Filtereinheit mit SFCA-Membran, 0,45 mm</td><td>Nalgene Rochester NY USA</td><td>#156-4045</td><td>zur Sterilisation von AHL-Lösung</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Patronenmaterialien</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; </stark></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 & Mikro; L Pipettenspitze&nbsp;</td><td>VWR Radnor PA USA</td><td>53508-810</td><td>zur Herstellung von Geruchspatronen und Fliegenvorbereitung</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Whatman Maidstone Kent UK</td><td>740-E</td><td>zur Herstellung von Geruchspatronen&nbsp;</td></tr><tr><td>Vakuum-Exsikkator&nbsp;</td><td>Cole-Parmer Vernon Hills IL USA</td><td>VX-06514-30</td><td>zum Verdampfen von Ethanol Lösungsmittel</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Odorant Materials</strong</td><td>>&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>cis-Palmitoleinsäure</td><td>Cayman Chemical Ann Arbor MI USA</td><td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td><td>Or47b Odorant</td></tr><tr><td>trans-Palmitoleinsäure</td><td>Cayman Chemical Ann Arbor MI USA</td><td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td><td>Or47b Odorant</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Spectrum Chemical MFG.&nbsp; New Brunswick NJ USA</td><td>E1028-500MLGL</td><td>zur Verdünnung von Palmitoleinsäure&nbsp;</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Rig Setup Materials</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odorant Cartridge Mikromanipulator</td><td>Siskiyou Grants Pass OR USA</td><td>MX130R</td><td>zur Positionierung der Olfaktometer</td></tr><tr><td>Flow Vision Software&nbsp;</td><td>Alicat Tuscon AZ USA</td><td>FLOWVISIONSC</td><td>Software zur Steuerung der Durchflussrate</td></tr><tr><td>Massenregler</td><td>Alicat Tuscon AZ USA</td><td>MC-2SLPM-D</td><td>zur Steuerung der Durchflussmenge für befeuchtete Luft</td></tr><tr><td>Massenregler</td><td>Alicat Tuscon AZ USA</td><td>MC-500SCCM-D</td><td>zur Steuerung der Durchflussrate zur</td></tr><tr><td>Geruchsstimulation Clampex</td><td>Molecular Devices Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>Datenerfassungssoftware</td></tr><tr><td>Luftförderschlauch</td><td>Ace Glass Vineland NJ USA</td><td>8802-936&nbsp;</td><td>zur Abgabe von befeuchteter Luft</td></tr><tr><td>50X Objektiv&nbsp;</td><td>Olympus Shinjuku, Tokio, Japan</td><td>LMPLFL50X</td><td>Aufnahme-Rig</td></tr><tr><td>Clampfit 10</td><td>Molecular Devices Sunnyvale, CA, USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>Software für die Spike-Analyse&nbsp;</td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>WaveMetrics Lake Oswego OR USA</td><td>Ver. 6.37</td><td>Software zur Datenanalyse&nbsp;</td></tr><tr><td>Audio Monitor</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXB-AUDIS-08B</td><td>Akustisch meldet einzelne Spitzen</td></tr><tr><td>Extrazellulärer Verstärker</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXT-02F</td><td>zur Erhöhung der Amplitude elektrischer Signale</td></tr><tr><td>Valve Controller</td><td>Warner Instruments&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>VC-8</td><td>zur Steuerung der Öffnung des Ventils für die Geruchsstimulation</td></tr><tr><td>Aufnahmeelektrode Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments Novato CA USA</td><td>MP-285</td><td>zur Positionierung der Aufnahmeelektrode</td></tr><tr><td>Headstage Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA</td><td>EQ-16.0008</td><td>zur Erhöhung der Amplitude elektrischer Signale</td></tr><tr><td>Oszilloskop</td><td>Tektronix Beaverton ODER</td><td>USA TDS2000C</td><td>Visueller Bericht über einzelne Spitzen</td></tr></tbody></table>

elektrophysiologische aufzeichnung von<em&gt; drosophila</em&gt; trichoid sensilla in reaktion auf odoranten der niedrigen volatilität

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Insekten verlassen sich auf ihren Geruchssinn, um eine breite Palette von Verhaltensweisen zu führen, die für ihr Überleben kritisch sind, wie z. B. Nahrungssuchende, Raubtiervermeidung, Eiablage und Paarung. Unzählige Chemikalien unterschiedlicher Volatilitäten wurden als natürliche Geruchsstoffe identifiziert, die Insekten-Olfaktor-Rezeptor-Neuronen (ORNs) aktivieren. Allerdings wurde das Studium der olfaktorischen Reaktionen auf niedervolatile Geruchsstoffe durch eine Unfähigkeit behindert, solche Reize mit herkömmlichen Geruchsabgabemethoden effektiv zu präsentieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das die wirksame Darstellung von Geringheitsröhrchen mit geringer Volatilität für in vivo Single-Sensillum Recording (SSR) ermöglicht. Durch Minimierung 1 den Abstandes zwischen der Geruchsquelle und dem Zielgewebe, ermöglicht diese Methode zur Anwendung von biologisch ausgeprägten aber bisher unzugänglichen Riechstoffe, einschließlich Palmitoleinsäure, eine stimulierende Pheromon mit einer nachgewiesenen Wirkung auf ORNs in Balz und Paarungsverhalten beteiligt.Unsere Prozedur bietet somit eine neue Avenue, um eine Vielzahl von niedervolatilen Geruchsstoffen für das Studium der Insekten-Olfusion und Pheromon-Kommunikation zu untersuchen.

Unsere Technik wurde erfolgreich angewendet, um die relative Wirksamkeit der trans ( Abbildung 5A ) gegenüber cis ( Fig. 5B ) Isomeren der Palmitoleinsäure zu bestimmen. Unsere repräsentativen Daten zeigen, dass trans- Palmitoleinsäure ein effektiverer Ligand für Or47b-ORNs im Vergleich zur cis- Isoform ist ( Abbildung 5C ). Ein einzelnes Neuron wurde von jeder Fl...

Das Gesamtziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie man Geruchsstoffe mit geringer Flüchtigkeit für die Single-Sensillum-Aufzeichnung von Drosophila- olfaktorischen Rezeptor-Neuronen, die auf langkettige cutikuläre Pheromone reagieren, präsentieren kann.

Elektrophysiologische Aufzeichnung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Trichoid Sensilla in Reaktion auf Odoranten der niedrigen Volatilität

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, Geruchsstoffe mit geringer Flüchtigkeit effektiv für olfaktorische Rezeptorneuronen und Drosophila für die elektrophysiologische Aufzeichnung zu präsentieren. Diese Neuronen sind in den tricchoiden Sensillen untergebracht und reagieren auf langkettige kutikuläre Pheromone. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Pheromonkommunikation von Insekten zu beantworten, indem sie eine verbesserte Geruchsabgabetechnik bietet.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Odoriermittel, die bisher aufgrund ihrer geringen Flüchtigkeit unzugänglich waren, während der In-vivo-Aufzeichnung effektiv präsentiert werden können. Konkret werden Pheromone aus kurzer Entfernung präsentiert, die die Spanne zwischen balzenden Männchen und Zielweibchen simulieren. Die Vorbereitung der Odor Delivery Cartridge-Komponente für AT4-Aufnahmen beginnt mit der Entnahme von 0,9 Zentimetern aus dem schmalen Ende einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze.Entfernen Sie dann von einer zweiten Pipettenspitze 1,7 Zentimeter vom schmalen Ende und 1,5 Zentimeter vom breiten Ende, um eine Länge von 1,8 Zentimetern zu erhalten. Platzieren Sie anschließend mit einer Pinzette eine Scheibe mit Filterpapier mit einem Durchmesser von 1/8 Zoll an der Spitze des 1,8 Zentimeter großen Abschnitts. Lassen Sie eine kleine Öffnung, durch die Luft strömen kann.Befestigen Sie dann die Pipettenabschnitte zusammen mit dem kleineren Abschnitt nach unten, um auf das Präparat zu zielen. Tragen Sie nun mit einem P10 das Odormittel in der gewünschten Verdünnung auf das Filterpapier auf. Lassen Sie die geladenen Patronen dann zum Verdampfen des Lösungsmittels eine Stunde lang in einem Vakuumexsikkator ruhen.Zuerst baust du eine Fliegenvorbereitungsfolie zusammen. Befestigen Sie auf einem Glasobjektträger einen Glasdeckglas mit Modelliermasse, so dass ein Winkel von etwa drei Grad zwischen dem Objektträger und dem Deckglas entsteht. Bringen Sie dann doppelseitiges Klebeband an zwei Stellen an, an der Innenkante des Deckglases und der Rutsche direkt unter dem Deckglas.Verwenden Sie immer frisches Klebeband. Sammle nun die Fliege von Interesse in einem Aspiratorrohr. Setzen Sie dann eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze über das Ende des Röhrchens und schnippen Sie gleichzeitig mit dem Röhrchen, um die Fliege in das Ende der Pipettenspitze zu schieben.Schneide dann mit einer Rasierklinge die Spitze direkt unter dem Körper der Fliege ab. Fülle nun vorsichtig Formschude in das breite Ende der Spitze, um den Kopf der Fliege in die kleinere Öffnung zu drücken. Sobald beide Antennen freiliegen, hören Sie auf, in Lehm zu packen.Positionieren Sie nun die Vorbereitung mit einer Pinzette auf der Folie. Positionieren Sie den Clipeus so, dass er horizontal mit der seitlichen Seite der Antenne gegen die abgeklebte Deckschicht zeigt. Setze dann die Haltestange auf die arista, um die Antenne am Band zu befestigen.Platzieren Sie als Nächstes die Vorbereitung auf der Bühne des Rigs. Vergewissern Sie sich, dass die Trichoide entlang der distalen lateralen Kante des dritten Segments der Antenne sichtbar sind. Die Sensilla sollte sich deutlich vom Hintergrund abheben.Halten Sie das Präparat unter einem konstanten befeuchteten Luftstrom, der über einen separaten Schlauch in einem Abstand von etwa zwei Zentimetern abgegeben wird. Um Aufnahmen zu machen, führen Sie die Referenzelektrode mit einer schnellen und gleichmäßigen Bewegung in den Clipeus ein. Platzieren Sie es direkt unter der Nagelhaut, wo es mit der Hämolymphe in Kontakt kommt.Senken Sie dann die Aufzeichnungselektrode langsam ab, bis sie in die gleiche Sichtebene wie das Zielsensillum eintritt. Führen Sie dann die Aufzeichnungselektrode in die Sensillarbasis ein. Bevor Sie fortfahren, stellen Sie sicher, dass ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis mit identifizierbaren Spitzen von AT4-A- und AT4-C-Neuronen vorhanden ist.Die AT4-A-Neuronen sollten nicht schneller als 20 Hertz feuern. Verbinden Sie nun die Kartusche mit dem Odormittelabgaberohr. Beginnen Sie mit der Lösungsmittelkontrolle und gehen Sie zur höchsten Odoriermittelkonzentration über.In diesem Fall wird eine Palmitoleinsäure-Kartusche angebracht. Verwenden Sie als Nächstes den Mikromanipulator, um die Patrone in Richtung Vorbereitung zu manövrieren, während Sie sie auf den Kopf richten. Positionieren Sie die Patronenspitze aus einem Abstand von etwa vier Millimetern direkt auf die Antenne.Außerdem muss sich die Kartusche etwa einen Millimeter über dem Schlitten befinden. Die präzise Positionierung der Kartusche in Bezug auf die Vorbereitung ist der wichtigste Schritt dieses Verfahrens. Konsistente neuronale Reaktionen hängen von der reproduzierbaren Position der Kartusche über die Versuche hinweg ab.Die Patrone kann von den Elektroden und dem Objektträger eng begrenzt sein. Er sollte idealerweise mindestens vier Millimeter von beiden Elektroden entfernt sein. Stellen Sie zur Stimulation den Odormitteldurchflussregler auf 500 Millisekunden ein und verwenden Sie eine Durchflussrate von 500 Millilitern pro Minute.Zeichnen Sie für jeden Stimulus-Burst die elektrische Aktivität 10 Sekunden lang auf. Ziehen Sie die Kartusche nach dem Auftragen eines Odoriermittels vorsichtig zurück, bevor Sie sie durch eine Kartusche mit der nächsthöheren Konzentration ersetzen. Nachdem Sie alle Aufnahmen des Tages gemacht haben, spülen Sie die Aufnahmeelektrode gründlich mit destilliertem Wasser ab.Mit Hilfe der beschriebenen Methoden an sieben Tage alten männlichen Berliner Wildtyp-Fliegen wurde die relative Wirksamkeit der trans- und cis-Palmitoleinsäure verglichen. Trans-Palmitoleinsäure war ein stärkeres Stimulans der Or47b-Geruchsrezeptorneuronen. Von jeder Fliege wurde nur ein einziges Neuron aufgezeichnet.Der Abstand zwischen der Öffnung der Geruchspatrone und dem Kopf der Fliege hatte einen signifikanten Einfluss auf die neuronalen Reaktionen. Bei vier Millimetern wurden viel mehr Stacheln als Reaktion auf Palmitoleinsäure abgefeuert. In einem Abstand von 11 Millimetern waren kaum Reaktionen der O47b-Neuronen zu beobachten.Die Präsentation von Palmitoleinsäure aus nächster Nähe war sehr wichtig für die Untersuchung ihrer Wirkung als Geruchsstoff. Wir hoffen, dass Sie nach dem Ansehen dieses Videos ein klares Verständnis dafür haben, wie Sie Palmitoleinsäure oder andere leicht flüchtige Geruchsstoffe während der In-vivo-Einzelsensillum-Aufzeichnung in Ihren Drosophila-Geruchsrezeptor-Neuronen präsentieren können. Sobald diese Technik beherrscht wird, kann die Aufzeichnung einer gesamten Dosiskurve von einer einzigen Fliege in etwa 20 Minuten erreicht werden.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet des Insektengeruchs, um die Neurophysiologie und die Signaltransduktionsmechanismen für die Pheromonerkennung zu erforschen.

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Elektrophysiologische Aufzeichnung von

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