Fourier-basierte Beugung Live-Analyse von Caenorhabditis elegans

Das übergeordnete Ziel dieser fourierbasierten Beugungsanalyse ist es, die Fortbewegung von C elegans in Echtzeit zu charakterisieren, während sich die Spezies frei in einem dreidimensionalen Raum bewegt. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der Neurobiologie beantworten, indem sie die Reaktionen der Spezies auf unterschiedliche Dichten von Lösungs- oder Bewegungsmutanten beschreibt. Diese Methode dient als Grundlage für die Fourier-Analyse mikroskopischer Spezies.

Es hat den Vorteil, dass jede mikroskopisch kleine Spezies ihr eigenes einzigartiges Fourier-Spektrum hat. Diese Methode kann zwar Aufschluss über die Fortbewegung von C elegans geben, kann aber auch auf andere Mikroorganismen angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig sein kann, den Fadenwurm in der Küvette unter dem Laserstrahl zu finden.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir versuchten, etwas über das Schwimmverhalten aus dem temporalen Beugungssignal selbst zu lernen, einem verrauschten Signal. Befestigen Sie zunächst einen Helium-Neon-Laser in der hinteren linken Ecke der optischen Werkbank und schließen Sie ihn an eine Stromquelle an. Platzieren Sie einen Neutraldichtefilter zwischen dem Laser und der Probenstelle, so dass der Laserstrahl durch den Filter wandert, bevor er die Probe erreicht.

Baue mit zwei vorderen Aluminium-Lenkspiegeln ein Periskop, indem du den ersten Spiegel nach dem Neutralfilter befestigst. Befestigen Sie dann den zweiten Spiegel etwa 10 Zentimeter unter dem ersten Spiegel, um Platz für die Steuerung des Laserstrahls zu haben. Setzen Sie eine Küvette zwischen die Spiegel ein und richten Sie den Laserstrahl und die Küvette so aus, dass der Laserstrahl vertikal durch die Küvette wandert.

Befestigen Sie als Nächstes die Fotodiode direkt gegenüber dem zweiten Spiegel, so dass ihr Sensor zum Spiegel zeigt. Stellen Sie dann eine mit Wasser gefüllte Küvette auf einen Ständer. Stellen Sie die Höhe des Stativs und die Winkel der Spiegel eins und zwei so ein, dass der Laserstrahl durch die Küvette wandert und in der Nähe, aber nicht direkt auf die Fotodiode gerichtet ist.

Stellen Sie mit einem Hebel sicher, dass der Ständer eine ebene Fläche für die Küvette bildet. Wenn der Ständer nicht waagerecht ist, nehmen Sie die entsprechenden Einstellungen vor, bis er nivelliert ist. Verbinden Sie abschließend die Fotodiode mit dem mitgelieferten USB-Kabel mit dem digitalen Oszilloskop und schließen Sie sie an den Computer an.

Laden Sie die Oszilloskop-Software und stellen Sie die Abtastrate auf mindestens acht Hertz ein, um den Müllzyklus des Wurms ausreichend aufzulösen. Verwenden Sie einen dünnen, abgeflachten Platindrahtpickel, um vier adulte Nematoden in eine frische, mit NGM-Agar gefüllte Petriplatte zu übertragen. Nehmen Sie als Nächstes eine Einweg-Plastikküvette aus der Verpackung und achten Sie darauf, die Küvette nur an den geriffelten Seiten zu berühren.

Verwenden Sie dann eine Mikropipette, um destilliertes Wasser in eine Küvette zu pipettieren, bis die Küvette zu etwa 80 % mit destilliertem Wasser gefüllt ist. Stellen Sie die Petrischale mit dem C elegans unter ein Präparierfernrohr. Nehmen Sie dann mit dem Platin-Plektrum ein reifes C elegans aus der Petrischale und tauchen Sie das Plektrum in die Küvette.

Bewege das Plektrum im Kreis, um den Fadenwurm bei Bedarf zu entfernen. Behandeln Sie die Nematoden vorsichtig und schütteln Sie die Küvette nicht. Das Schütteln der Küvette kann dazu führen, dass die Würmer nicht mehr reagieren.

Um zu verhindern, dass sich Blasen in der Küvette bilden, füllen Sie die Küvette mit destilliertem Wasser, bis sie sich leicht über die Oberseite der Küvette bewegt. Füllen Sie dann den Deckel mit Wasser und setzen Sie den Deckel schnell auf die Küvette. Entfernen Sie mit Linsenpapier alle Wassertropfen, die auf die Küvette gelangt sind.

Verwenden Sie zusätzlich Linsenpapier, um kleine verbleibende Tröpfchen zu entfernen. Schalten Sie den Helium-Neonlaser ein und stellen Sie die Frequenzeinstellung so ein, dass er einen roten Strahl erzeugt. Schalten Sie dann den Sensor ein.

Halten Sie die Küvette auf die geriffelten Seiten und kippen Sie sie vorsichtig, bis sich der Fadenwurm ungefähr in der Mitte der Küvette befindet. Platzieren Sie dann die Küvette auf dem Ständer im optischen System und zentrieren Sie die Schnecke innerhalb des Laserstrahls, der von Spiegel eins zu Spiegel zwei wandert. Platzieren Sie als Nächstes die Fotodiode im Beugungsmuster, so dass die Position der Fotodiode und das zentrale Maximum des Beugungsmusters nicht übereinstimmen.

Drehen Sie dann die Neutraldichtefilter so, dass von der Fotodiode eine bemerkenswerte Spannung ausgegeben wird. Achten Sie darauf, das Licht mit dem Neutraldichtefilter zu begrenzen, um eine Sättigung der Fotodiode zu verhindern. Eine flache Linie deutet auf eine Übersättigung oder einen Mangel an Intensität hin.

Sobald das sich bewegende Beugungsmuster sichtbar ist, sammeln Sie Daten mit der Fotodiode, indem Sie auf die Startschaltfläche in der Software klicken und das Oszilloskop steuern, während Sie die Bewegung der Schnecke überwachen. Fahren Sie mit den Messungen fort, bis sich der Wurm aus dem Laserstrahl bewegt und das Beugungsmuster verschwindet. Wenn die Küvette zerkratzt ist, entsorgen Sie sie und den Wurm und beginnen Sie erneut.

Stoppen Sie nach etwa 20 Sekunden den Datenerfassungsvorgang, indem Sie in der Software für das Oszilloskop auf die Stopp-Schaltfläche klicken. Speichern Sie die Daten jeder Testversion im kommagetrennten Wert- oder Textformat. Sammeln Sie mindestens 50 Datensätze für jeden Phänotyp und verwenden Sie acht bis 10 Tiere pro Versuch.

Beispiele für modellierte sequentielle Wurmbewegungen und entsprechende Beugungsmuster sind hier dargestellt. Die modellierten Beugungsmuster ähneln qualitativ experimentellen Mustern und deuten darauf hin, dass die Simulation den Fadenwurm erfolgreich modelliert hat. Darüber hinaus kann die zeitliche Beugungssignatur der Walze und des Wildtyps c elegans quantitativ dargestellt werden.

Wie hier zu sehen ist, schlägt jeder Fadenwurm mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und Amplituden. Die durchschnittlichen digitalen Fourier-Transformationen ermöglichen es, den Fadenwurm anhand der Amplitude seines Beugungsfrequenzspektrums zu identifizieren. Das Wildtyp-Wurmspektrum wird durch niedrigere Frequenzen dominiert als das Rollenbewegungsspektrum.

Hier ist ein Beispiel für die W-Oszillation, die man sich als zwei gegensätzliche Seebewegungen vorstellen kann. Im Gegensatz dazu bildet die Walze meist ein c zu einer Seite und sieht so aus. Bei der Untersuchung der Frequenzen ist die w-Bewegung komplexer und zeigt mehr sekundäre tiefe Frequenzen als die c-Bewegung.

Einmal gemeistert, kann ein Datensatz in etwa zwei Minuten gesammelt werden, wenn die Technik richtig angewendet wird. Es dauert etwa 20 bis 30 Minuten, um die Optik für eine Reihe von Datensätzen einzurichten. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, die C elegans vorsichtig zu behandeln, um die Integrität ihrer Fortbewegung zu erhalten.

Nach diesem Verfahren können wir andere Methoden anwenden, wie z. B. die Rekonstruktion eines Traktors und die nichtlineare Analyse, um mehr über die Bewegung von C elegans zu erfahren. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher in der Neurobiologie geebnet, um die Bewegungsmutanten in C elegans eingehender zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein ziemlich gutes Verständnis dafür haben, wie man Beugungsmuster für lebende Nematoden generiert und wie man sie analysiert.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung des Eingriffs Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. dass sich die Laser nicht auf Augenhöhe bewegen.