Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen

Stammzellen sind pluripotente und spezialisierte Zellen, die sich durch ihre langfristige Selbsterneuerung und ihre Fähigkeit auszeichnen, unter bestimmten Bedingungen differenzierte Zellen aus den drei Keimblättern entstehen zu lassen. Aufgrund dieser Eigenschaften haben Stammzellen ein großes Potenzial in der regenerativen Medizin, der Krankheitsmodellierung und der Tiertechnik. Jahrelang wurden embryonale Stammzelllinien, die für Forschungszwecke bestimmt sind, hauptsächlich aus Mausembryonen gewonnen, aber im Allgemeinen waren die erzielten Ableitungseffizienzen gering.

In diesem Video zeigen wir ein einfaches Protokoll zur Ableitung embryonaler Stammzelllinien der Maus unter Standardbedingungen, das eine relativ hohe Ableitungseffizienz bietet, die mit der Effizienz vergleichbar ist, die bei der Verwendung von Modulatoren von Signalwegen, wie z. B. 2i, erzielt wird. In diesem Protokoll werden wir menschliche Vorhautfibroblasten als Feederzellen für die ESC-Gewinnung und -Kultur verwenden. Bevor der ESC-Ableitungsprozess gestartet wird, ist es notwendig, die Feederzellen zu deaktivieren.

Nehmen Sie zunächst ein kryogenes Fläschchen mit menschlichen Vorhautfibroblasten, die in flüssigem Stickstoff gelagert sind, und tauen Sie es auf, indem Sie das Fläschchen in ein Wasserbad bei 37 °C tauchen. Nach dem Auftauen verdünnen Sie den Inhalt in DMEM, ergänzt mit fötalem Rinderserum. Säen Sie die Verdünnung in einen Falcon-Kolben und kultivieren Sie sie, bis sie das Konfluenzstadium erreicht. Um die Fibroblasten zu inaktivieren, verdünnen Sie anschließend Mitomycin C in DMEM, das mit fötalem Rinderserum ergänzt ist, und inkubieren Sie die Zellen drei Stunden lang in dieser Inaktivierungslösung.

Entfernen Sie dann die Inaktivierungslösung und spülen Sie die Zellen dreimal mit Hanks'Balanced Salt Solution aus, um Mitomycin C-Reste zu entfernen. Um die inaktivierten Feederzellen zu lösen, fügen Sie einen Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang. Beobachten Sie danach die Zellen unter einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie vom Kulturkolben gelöst sind.

Pipettieren Sie dann die Zellen mit einer Pasteur-Pipette, um die Zellklumpen zu dissoziieren und die enzymatische Lösung zu neutralisieren, indem Sie vier Milliliter DMEM hinzufügen, die mit fötalem Rinderserum ergänzt werden. Nehmen Sie ein kleines Aliquot, verdünnen Sie es in Kochsalzlösung und bestimmen Sie die Anzahl der Zellen mit einer Neubauer-Kammer. Parallel dazu zentrifugieren Sie den Rest der Probe.

Der Überstand wird verworfen und das Pellet in Gefrierlösung bei einer Endkonzentration von einer Million Zellen pro Milliliter verdünnt. Aliquotieren Sie die Suspension in kryogenen Fläschchen. Und zum Schluss stellen Sie die Kryofläschchen in einen Gefrierbehälter und stellen Sie sie bei minus 80 Grad C auf. Lagern Sie sie am nächsten Tag in flüssigem Stickstoff.

Ein bis vier Tage vor Beginn des Derivationsprozesses nehmen Sie ein Kryoröhrchen mit inaktivierten Feeder-Zellen, die in flüssigem Stickstoff gelagert sind, und tauen Sie es in einem Wasserbad bei 37 °C auf. Verdünnen Sie dann die Zellen in vorgewärmtem DMEM, das mit fötalem Rinderserum ergänzt wird, und pipettieren Sie vorsichtig, um eine homogene Mischung zu gewährleisten. Geben Sie 500 Mikroliter vorgewärmte Gelatinelösung in jede Vertiefung einer Vier-Well-Platte und halten Sie sie 10 Minuten lang bei 37 Grad C. Gleich danach die Gelatine aus jeder Vertiefung entfernen.

Geben Sie 500 Mikroliter der Verdünnung der Feeder-Zellen in jede Vertiefung und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Feeder-Zellen auf dem Boden der Wells zu gewährleisten. Vermeiden Sie kreisende Bewegungen, da dies die Zellen in der Mitte der Vertiefung konzentrieren würde. Legen Sie dann die Platte mindestens 24 Stunden lang bei 37 Grad und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator.

Beobachten Sie die Zellen am nächsten Tag unter einem inversen Mikroskop und überprüfen Sie, ob sie befestigt und gründlich verteilt sind. Wechseln Sie schließlich das Medium der Feederzellen durch vorgewärmtes DMEM, das mit fötalem Rinderserum ergänzt wird, um DMSO-Reste zu entfernen. Vor der Embryonenentnahme ist die Superovulation des weiblichen Mausmaus durch intraperitoneale Injektion von fünf internationalen Einheiten von Trächterstutenserumgonadotropin und humanem Choriongonadotropin im Abstand von 48 Stunden zu induzieren.

Verpaaren Sie die Weibchen mit den Männchen und trennen Sie sie 24 Stunden später. Um Embryonen im Zweizellstadium zu sammeln, euthanasieren Sie die Weibchen 48 Stunden nach dem Koitum, präparieren Sie die weiblichen Mäuse, um die Eileiter und einen kurzen Teil der Gebärmutterhörner zu erhalten, und legen Sie sie in eine Schale mit HEPES-gepuffertem CZB-Medium. Spülen Sie dann nacheinander die Eileiter mit HEPES-gepuffertem CZB-Medium unter dem Stereomikroskop, um die Embryonen zu sammeln.

Übertragen Sie die zweizelligen Embryonen in eine Kulturschale, die am Vortag mit einigen Tropfen Embryokulturmedium zubereitet und mit Mineralöl bedeckt war. Bewahren Sie die Embryonen bis zum Blastozystenstadium im Inkubator auf. Überwachen Sie die Entwicklung des Embryos alle 24 Stunden.

Es wird erwartet, dass die Embryonen das Blastozystenstadium 48 Stunden nach Beginn der In-vitro-Kultur erreichen. Wenn möglich, wählen Sie nur expandierte Blastozysten aus, um den Ableitungsprozess zu starten. Bereiten Sie am Tag der Aussaat des Embryos das Medium für die Stammzellgewinnung vor.

Fügen Sie DMEM einen Leukämie-Hemmfaktor (LIF) hinzu, der mit nicht-essentiellen 2-Beta-Mercaptoethanol-Aminosäuren und KnockOut-Serumersatz ergänzt wird. Falls gewünscht, fügen Sie einen MAPK-Inhibitor und einen GSK-3-Inhibitor hinzu, um ein 2i-Medium zu erhalten. Nehmen Sie die Vier-Well-Platte mit der Monolage der Feederzellen aus dem Inkubator.

Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 800 Mikroliter des frisch zubereiteten Ableitungsmediums hinzu. Vor der Aussaat der Blastozysten auf den Feederzellen muss die Zona pellucida entfernt werden. Übertragen Sie dazu einen Embryo von der Kulturplatte in einen Tropfen saurer Tyrodenlösung und bewahren Sie ihn dort auf, bis die Zona pellucida verdaut ist.

Stellen Sie sicher, dass die Zona pellucida vollständig entfernt wurde, indem Sie den Fokus und den Kontrast des Stereomikroskops anpassen. Spülen Sie dann den zonafreien Embryo in mehreren Tropfen Ableitungsmedium ab und säen Sie ihn auf eine Monoschicht aus Feederzellen. Wiederholen Sie den Vorgang mit den restlichen Embryonen.

Kultivieren Sie die Platte bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid. Überwachen Sie die Kulturen alle 24 Stunden unter einem inversen Mikroskop, um ihr Wachstum zu beurteilen und mögliche frühe Anzeichen einer Differenzierung zu identifizieren, wie z. B. geschwollene refraktive Zellen, die das Wachstum umgeben, oder sogar das Verdrängen der Feeder-Zellen zur Seite. Wechseln Sie jeden zweiten Tag das Medium der Kultur.

Nehmen Sie dazu die Vier-Well-Platte aus dem Inkubator, entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie 800 Mikroliter vorgewärmtes Ableitungsmedium hinzu, das gegebenenfalls mit LIF und 2i ergänzt wird. Legen Sie die Platten wieder in den Inkubator und bewahren Sie die Kultur auf, bis Auswüchse beobachtet werden. Sechs bis acht Tage nach der Aussaat der Blastozysten sollte ein Auswuchs beobachtet werden, der subkultiviert werden muss.

Für dieses Verfahren sind keulungsähnliche Griffe und Pipetten zur Manipulation von Stammzellen erforderlich. Um sie zuzubereiten, nehmen Sie eine Pasteur-Pipette mit langer Spitze und erhitzen Sie den dünneren Teil mit einem Bunsenbrenner. Sobald sie weich ist, ziehen Sie die Pipette aus der Flamme und ziehen Sie die beiden Enden auseinander, bis sie sich trennen.

Verwenden Sie den dickeren Teil als Pipette zur Stammzellenmanipulation. Erhitzen Sie die Spitze des dünneren Teils und formen Sie sie, bis Sie einen Haken erhalten, um einen keulartigen Griff vorzubereiten. Um den Auswuchs zu subkultivieren, lokalisieren Sie ihn unter dem Stereomikroskop.

Schieben Sie mit Hilfe des Griffs die differenzierten Zellen weg, die den Auswuchs umgeben. Um eine eventuelle Differenzierung zu vermeiden, ist es wichtig, die differenzierten Zellen vom Rand des Auswuchses streng zu entfernen. Aspirieren Sie mit einer Stammzellmanipulationspipette den Auswuchs und geben Sie ihn in einen Tropfen vorgewärmte Trypsin-EDTA-Lösung.

Schneiden Sie mit Hilfe eines Skalpells den Auswuchs in mehrere Stücke, um ihn mechanisch und enzymatisch zu zerkleinern. Die Auswuchsfragmente werden zurückgewonnen und in einen Tropfen vorgewärmtes Ableitungsmedium gelegt, um die Trypsinwirkung zu neutralisieren. Schließlich säen Sie die Auswuchsfragmente mit einer Monoschicht aus Feederzellen in die Vier-Well-Platte und kultivieren sie in einem Ableitungsmedium bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.

Stammzellähnliche Kulturen müssen mindestens sechs Wochen lang aufbewahrt werden, bevor eine ESC-Linie als etabliert angesehen werden kann. Während dieser Zeit ist es notwendig, das Medium jeden zweiten Tag zu wechseln und sie einmal pro Woche zu subkulturieren. Mit zunehmender Anzahl der Passagen ändert sich die Morphologie der Kolonien allmählich von einer Kuppelform zu einer länglicheren und abgeflachten Morphologie.

Nach sechs Passagen exprimieren die ESC-Linien der Maus konstitutiv Pluripotenzmarker wie Oct 4 und Sox 2. Darüber hinaus können nach Induktion der ESC in vitro Differenzierung durch Kultivierung in DMEM, ergänzt mit 10%igem fötalem Rinderserum und ohne Feederzellen, Differenzierungsmarker, die für die drei Keimblätter repräsentativ sind, durch Immunfluoreszenz nachgewiesen werden. Hier zeigen wir den Nachweis des Anti-Tubulin-beta-3-Proteins als Marker für das Ektoderm, des alpha-Aktins der glatten Muskulatur für das Mesoderm und des alpha-Fetoproteins für das Endoderm.

Nach diesem einfachen Verfahren können embryonale Stammzellen aus Maus-Blastozysten mit einer Effizienz von 60 % bis 78 % gewonnen werden? Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Zellen täglich oder jeden zweiten Tag zu kontrollieren, da die hier angegebenen Zeiten nur zur Veranschaulichung dienen. Überwuchern embryonale Stammzellkolonien, werden sie durch die Zellansammlung dunkler und neigen dazu, sich leichter zu differenzieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die Gewinnung und Kultivierung embryonaler Stammzellen der Maus unter Standardbedingungen haben.