Name: Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Erfahren Sie, wie man embryonale Stammzelllinien aus Mausembryonen mit hoher Effizienz ableitet. Dieses Protokoll nutzt humane Fibroblasten als Feederzellen und verbessert die Derivation für die Stammzellbiologie.

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Wir danken Jonatan Lucas für seine technische Unterstützung mit Feeder-Zellkultur, Servei Estabulari De La UAB für Tierpflege und Domènec Martín für die Videoaufnahme. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R und Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC ist ein PIF-UAB-Stipendium.

die Verwendung von Tieren, die in den folgenden Abschnitten beschriebenen genehmigt wurde, durch die Ethikkommission für Tier- und Human Research von der Universitat Autònoma de Barcelona und Handelsverträge d &#39; Agricultura, Ramaderia, Pesca ich Alimentació von der Generalitat de Catalunya (Protokoll #8741).
 1. Feeder Zelle Inaktivierung und Lagerung Hinweis: menschliche Vorhaut Fibroblasten (HFF-1) in 1 mL eiskalte Lösung bestehend aus 90 % fetalen Bovine Serum (FBS) und 10 % Dimethyl Sulfoxid (vorher eingefroren wurden DMSO) und in flüssigem Stickstoff bis zum Gebrauch gespeichert.
<ol><li>Auftauen eine kryogene Phiole der HFF-1 (1 mL) durch das Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad eintauchen.</li>
	<li>Vorgewärmt Dulbecco den aufgetauten Inhalt der kryogenen Durchstechflasche hinzufügen &#39; s Modified Eagle &#39; s Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % FBS zu einem 01:10 Verdünnung.</li>
	<li>Saatgut die verdünnten Zellen (10 mL) in einem T75 Kolben und Kultur sie bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
	<li>Am nächsten Tag ändern das Medium, die DMSO-Reste zu beseitigen. Entfernen Sie das Medium und 10 mL vorgewärmten DMEM mit 10 % ergänzt FBS.</li>
	<li>Kultur der HFFs und das Medium alle 48 h verändern, bis die Kultur der konfluierende Stadium erreicht. Dies dauert etwa 7 bis 10 Tage.</li>
	<li>, Bereiten Sie die Inaktivierung Lösung verdünnen Mitomycin C in DMEM mit 10 % ergänzt FBS auf eine Endkonzentration von 10 µg/mL. Inkubation der Zellen mit der Inaktivierung Lösung für 3 h bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
	<li>Die Inaktivierung Lösung entfernen und spülen Sie die Zellen dreimal mit 2 mL von Hanks ausgewogen Salz Lösung (HBSS), Mitomycin C Reste zu beseitigen.</li>
	<li>Um die inaktivierten Zellen zu entfernen, fügen Sie 1 mL vorgewärmten Trypsin-EDTA-Lösung und inkubieren Sie für 5 min bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
	<li>Beobachten die Zellen unter einem inversen Mikroskop um sicherzustellen, dass sie getrennt (10 X Objektiv mit 0,3 numerische Apertur oder NA). Wenn sie nicht sind, brüten sie für ein paar Minuten bei 37 ° C und 5 % CO 2. Überprüfen Sie die Zellen wieder unter die inversen Mikroskop.</li>
	<li>Die Lösung mit einer Pasteurpipette pipette, um die Zelle Klumpen zu distanzieren.</li>
	<li>Neutralisieren die enzymatische Lösung durch Zugabe von 4 mL DMEM mit 10 % FBS und Aufschwemmen ergänzt.</li>
	<li>Ein Aliquot der Zellsuspension und machen eine 1: 100 Verdünnung in HBSS. Um die Anzahl der Zellen zu bestimmen, laden 10 µL der Verdünnung in einer Neubauer &#39; s-Kammer. Zählen der Zellen in einer der großen Plätze der Kammer unter einem inversen Mikroskop (20 X Objektiv mit einem 0,45 NA).
	<ol><li>Wiederholung die Zählung in insgesamt vier große Quadrate. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen (N) n = durchschnittliche Anzahl von Zellen gezählt x Gesamtvolumen x Verdünnung X 10 4.</li>
	</ol></li> <li>Zentrifugieren dem Rest der Probe für 5 min bei 200 X g. verwerfen den Überstand und Aufschwemmen der Pellets mit dem Einfrieren Lösung mit einer Konzentration von 10 6 Zellen pro mL.</li>
	<li>Aliquot Suspension in kryogenen Fläschchen mit 10 6 Zellen (1 mL) jeder. Die kryogenen Fläschchen in einem eiskalten Behälter legen und Einfrieren bei-80 ° c</li>
	<li>Am nächsten Tag speichern die kryogenen Fläschchen in Flüssigstickstoff.</li>
</ol> 2. Feeder-Zellkultur <ol><li>bis zu vier Tage vor der Ableitung, Tauwetter eine kryogene Fläschchen mit 1 x 10 6 inaktiviert HFF-1-Zellen in einem Wasserbad bei 37 ° c</li>
	<li>Stellen eine Verdünnung von 1:6 des aufgetauten HFF-1 in DMEM ergänzt mit 10 % FBS und halten die Temperatur bei 37 vorgewärmt ° c</li>
	<li>Jeder Brunnen ein 4-Well-Platte mit 500 µL vorgewärmten 0,2 % Gelatine aus Schweinehaut füllen und halten Sie die Platte bei 37 ° C für 10 min.</li>
	<li>500 µL von Gelatine aus den Brunnen zu entfernen und fügen Sie 500 µL HFFs-Verdünnung. Schütteln Sie die Platte, um eine gleichmäßige Verteilung des HFFs auf der Unterseite der Brunnen zu gewährleisten. Vermeiden Sie Kreisbewegungen, sonst werden die Zellen in der Mitte des Brunnens konzentrieren.</li>
	<li>Inkubieren die Platte mindestens 24 h bei 37 ° C und 5 % CO 2 eine Monolage von inaktivierten HFFs in jede Vertiefung erhalten.</li>
	<li>Am nächsten Tag die Zellen unter einem inversen Mikroskop (10 X-Objektiv mit 0,3 NA) beobachten und überprüfen, dass sie befestigt und homogen verteilt. Ändern Sie das Medium, um die DMSO-Reste zu beseitigen. Entfernen Sie das Medium und fügen 500 µL vorgewärmten DMEM mit 10 % ergänzt FBS.</li>
</ol> 3. Embryo-Sammlung und Kultur <ol><li>vier Tage vor dem Embryo Sammlung verwalten 5 IU trächtige Stute &#39; s Serum Gonadotropin durch intraperitoneale Injektion, 6-12 Wochen alten weiblichen Mäusen. 
	Hinweis: Wir haben Weibchen aus dem 129S2 oder B6CFAF1 Stämme verwendet, obwohl Weibchen aus anderen Mausstämme verwendet werden können. Dennoch, wenn arbeiten mit Weibchen aus non-permissive Stämme (z. B. CBA), Medium sollte ergänzt werden mit 2i wie unter Schritt 4.2.</li>
	<li>Nach 48 h, 5 IE humanes Choriongonadotropin durch intraperitoneale Injektion verabreichen und paaren sich die Weibchen mit Männchen, mindestens 8 Wochen alt, im Verhältnis 1:1. Die Weibchen von den Männchen am nächsten Tag trennen.</li>
	<li>Am Vortag Embryo Sammlung, vorbereiten eine 35-mm-Zellkultur Petrischale mit mehreren 40 µL Tropfen des KSOMaag Mediums ergänzt mit 4 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) und füllen die Platte mit Mineralöl, die Tropfen in vollem Umfang abdecken. Inkubieren Sie die Schüssel bei 37 ° C und 5 % CO 2 auf das Medium equilibrate.</li>
	<li>Embryo Manipulation Pipetten, Vorbereitung erhitzen den dünneren Teil eines langen Spitzen Glases Pasteurpipette mit dem Bunsenbrenner. Sobald weich, die Flamme entziehen Sie und ziehen Sie die beiden Enden auseinander. Brechen sie auf die gewünschte Länge. Der innere Durchmesser an der Spitze sollte 100-150 µm.</li>
	<li>Einschläfern der weiblichen Mäusen durch zervikale Dislokation 45-48 h Post Coitum (p.c.).</li>
	<li>Sezieren die Mäuse um die Bauchhöhle verfügbar machen, indem die Haut mit einer gebogenen glatt scharfen Schere und das Bauchfell mit gerade scharfen Schere schneiden. Eine Gebärmutter mit Zange greifen, die Eileiter mit gerade scharfen Schere abgeschnitten und legen Sie sie in Hepes gepufferten CZB Medium (HCZB) 13 bei 37 ° c wiederholen Sie den Vorgang, der andere Eileiter entfernen.</li>
	<li>Flush die Eileiter mit einer 1 mL Spritze mit HCZB geladen gehalten von Uhrmacher-Pinzette, die 2 Zellen Embryonen zu sammeln. 
	Hinweis: Um der Spülung Nadel nehmen eine 30 G Injektionsnadel vorzubereiten, schneiden Sie das Ende und zu einer stumpfen Spitze auf einem Schleifstein geschliffen.</li>
	<li>Mit der Mund-Pipette-Apparat, die Embryonen abholen, waschen Sie sie in HCZB und Kultur sie in der Kulturschale vorbereitete Embryo bei 37 ° C und 5 % CO 2 bis zum Blastozystenstadium. Bis zu 50 Embryonen können in jedem Tropfen 40 µL kultiviert werden. Überwachen der Embryonalentwicklung alle 24 h unter einem Stereomikroskop. 
	Hinweis: Alternativ können Embryonen im Blastozystenstadium in Vitro Embryonenkultur verkürzen gesammelt werden. In diesem Fall einschläfern Sie den Weibchen am Tag 3,5-4,5 p.c., sezieren Sie die Gebärmutter zu. und spülen Sie es mit HCZB.</li>
</ol> 4. Stem Cell Ableitung <ol><li>Vorbereitung der Ableitung Platten <ol><li>am Tag der Embryo Aussaat, bereiten die Ableitung Medium durch Ergänzung DMEM Medium mit 100 µM 2-β-Mercaptoethanol, 1 x nicht-essentiellen Aminosäuren , 20 % der Serum-Ersatz und 10 3 U/mL LIF.</li>
		<li>Auf Wunsch auch hinzufügen 1 µM von der MEK-Inhibitor PD0325901 und 3 µM GSK3-Inhibitor CHIR99021 2i Medium zu erhalten.</li>
		<li>Nehmen die 4-Well-Platte mit der Monolage von inaktivierten HFFs (Schritt 2,6) von der Inkubator. Entfernen Sie das Medium und jedes gut fügen Sie 800 µL vorgewärmten Ableitung Medium hinzu. Die Platte in den Inkubator zurück.</li>
	</ol></li> <li>Zona Pellucida Entfernung und Embryo Aussaat <ol><li>Vorbereitung eine 35 mm-Zellkultur Petrischale mit drei 30 µL Tropfen der sauren Tyrode &#39; s Lösung 14 und drei 30 µL Tropfen Ableitung Medium. Decken die Tropfen mit Mineralöl und halten Sie die Schüssel bei 37 ° c</li>
		<li>Nehmen die Embryo-Kulturschale aus dem Inkubator. Eins nach dem anderen, übertragen die Blastozysten von Kultur-Tropfen auf einen sauren Tyrode &#39; s Lösung Tropfen mit einem Embryo Manipulation Pipette. Wenn möglich, wählen Sie nur die erweiterte Blastozysten um die Ableitung zu starten.</li>
		<li>Überwachen die Zona Pellucida Verdauung unter dem Stereomikroskop. Sobald die Zona Pellucida verschwindet, übertragen die Blastozyste zu einer Ableitung Mittel um die sauren Tyrode auszuwaschen &#39; s Lösung.</li>
		<li>Nehmen die Ableitung 4-Well Platte aus Inkubator und Samen einer Zona-freie Blastozyste auf die Zuführung Zellen in jedem Bohrloch.</li>
		<li>Rückkehr die Ableitung 4-Well-Platte zum Inkubator und Kultur bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
	</ol></li> <li>Monitoring Stammzellen Wachstum und Medium ändern <ol><li>Kulturen alle 24 h unter einem inversen Mikroskop (20 X Objektiv mit 0,45 NA) zu überwachen. Es ist wichtig zu beachten, ob es Anzeichen von Stammzell-Differenzierung, z. B. geschwollenen refraktiven Zellen rund um den Auswuchs oder sogar schieben die Zuführung Zellen beiseite.</li>
		<li>Jeden zweiten Tag, das Medium der Kultur verändern. Nehmen Sie die 4-Well-Platte aus dem Inkubator, entfernen Sie das Medium aus jedem Bohrloch und fügen Sie 800 µL vorgewärmten Ableitung Medium ergänzt mit LIF und 2i, hinzu, wenn verwendet. Pflegen die Kultur bis Auswüchse (6-8 Tage) eingehalten werden.</li>
	</ol></li></ol> 5. Stammzelle-Kultur und Wartung <ol><li>Prepare Kolle-ähnliche Griffe und Stammzellen Manipulation Pipetten. Folgen Sie Schritt 3.4 vorzubereitende Stammzell-Manipulation Pipetten mit einem Innendurchmesser an der Spitze von 250-300 µm. verwenden andererseits zog Pasteurpipette Kolle-ähnlichen Griff vorzubereiten. Erhitzen und gestalten Sie es bis zum Erreichen eines Hakens.</li>
	<li>Kultur 4-Well-Platte aus dem Inkubator nehmen und zu den Auswuchs unter einem Stereomikroskop suchen. Verwenden Sie den Griff um die differenzierte Zellen und die Anleger, die den Auswuchs umgeben wegzudrücken. 
	Hinweis: Zur Vermeidung von eventuellen Differenzierung der Auswuchs ist es wichtig, die differenzierte Zellen vom Rand der Auswuchs entfernen.</li>
	<li>Auswuchs mit einer Stammzelle Manipulation Pipette abzusaugen und legen Sie sie in ein neues Gericht in einem 50 µL Trypsin-EDTA Tropfen.</li>
	<li>Verwenden ein Skalpell zu den Auswuchs in mehrere Teile geschnitten, um es sowohl mechanisch als auch enzymatisch disaggregieren.</li>
	<li>Sofort, übertragen die Auswuchs Fragmente zu einem frischen Tropfen Ableitung Medium Trypsin Aktion neutralisieren.</li>
	<li>Übertragen die Auswuchs Fragmente auf einen neuen 4-Well-Platte mit einem monomolekularen Film Feeder. Übertragen Sie bis zu 10 Fragmente pro Bohrloch und Kultur sie mit Ableitung Medium bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
	<li>Pflegen die Stammzell-ähnliche Kulturen für mindestens sechs Wochen vor der Prüfung der mESC-Linie gegründet. Das Medium verändern, jeden anderen Tag und Subkultur ihnen einmal pro Woche.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Obwohl mESC Linie Ableitung ein bekannter Verfahren routinemäßig in vielen Laboratorien eingesetzt wird, ist der Wirkungsgrad nicht immer so hoch wie erwartet aufgrund der multiplen Faktoren, die Aufrechterhaltung der Pluripotenz stören können. In diesem Artikel zeigen wir Schritt für Schritt, wie man mESC Linien mit hohen Wirkungsgraden über ein einfaches und zuverlässiges Protokoll zu etablieren. Diese Effizienz sind ähnlich denen in der Literatur beschrieben.
Um maximale Effizienz zu gewähr...

Embryonale Stammzellen (ESC) sind pluripotente Zellen aus Präimplantations Embryonen, die behalten die Fähigkeit, selbst zu erneuern oder unter bestimmten Bedingungen1zu unterscheiden. Basierend auf diesen Eigenschaften, ESC sind ein nützliches Werkzeug für die regenerative Medizin, Krankheit Modellierung und Tissue engineering Studium2geworden.
ESC wurden zum ersten Mal von Präimplantationsdiagnostik Mäuseembryonen, mit ESC (mESC) Mauslinien mit geringen Erfolg3,4Ursprung abgeleitet. Jahrelang blieb der Herleitung Wirkungsgrad niedrig wegen der Schwierigkeit der Aufrechterhaltung der Pluripotenz in Vitro. Außerdem das Vorhandensein von Feeder Zellen5, die Ableitung effizienter zu gestalten, Kolonie Anlage fördern und verbessern karyotypic Stabilität6, einige Modifikationen von den Protokoll führen zu einer Verbesserung der Pluripotenz Wartung. Die wichtigsten waren die Zugabe von Leukämie hemmenden Faktor (LIF), mESC Kulturmedium7,8, die Verwendung von Embryonen aus dem 129S2 permissive Hintergrund9 und die Kultur der mESC mit Medium ergänzt mit definierten Serum, frei von möglichen Differenzierung Faktoren10. Vor kurzem hat zwingende Beweise gezeigt, dass Zusatz von einem Cocktail aus zwei kleinen Molekül-Modulatoren der Signalwege, die mESC Kulturmedium (bekannt als 2i) am besten, Pluripotenz beizubehalten. Die 2i cocktail besteht aus einer Kombination von MEK-Inhibitor PD0325901, die die Differenzierung Signale reduziert durch die Hemmung des Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK) Weges, und der GSK3β-Inhibitor CHIR99021, die Zelle Überleben bei geringer Dichte verbessert durch die Aktivierung der Wnt-Signalweg-11.
In diesem Artikel beschreiben wir ein einfaches Protokoll um effizient mESC Linien von Maus Blastozysten abzuleiten. Wir folgen Standardverfahren, Kultivierung der Embryonen von freizügigen Belastungen für Feeder-Zellen in Ableitung Medium mit LIF und ein Serum-Ersatz-12ergänzt. Nach diesem Protokoll mESC Linien kann mit Wirkungsgraden Äquivalent zu denen, die in 2i Medium abgeleitet werden. Trotzdem können 2i hinzugefügt werden, um mögliche Probleme mit Pluripotenz Wartung oder beim Arbeiten mit nicht-freizügigen Belastungen zu vermeiden.

<table><tbody><tr><td>1 mL Sryring</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>2-&beta;-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>4-Well-Platte</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Saure Tyrodenlösung&nbsp;</td><td>Hausgemacht</td><td></td><td>Siehe Rezept in Nagy et al., 2003. Für die kurzfristige Lagerung (bis zu 1 Monat) halten Sie es bei 4 °C. Alternativ können Sie es für die Langzeitlagerung bei -20 °C aufbewahren. Wenn die Wirksamkeit der Lösung abnimmt, sollte sie durch Zugabe eines kleinen Tropfens HCl 1M angesäuert werden.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Hühner-Anti-Maus-IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Molekulare Sonden - Invitrogen</td><td>A-21200</td><td>1:500 Verdünnung. Sekundärer Antikörper für Oct4, Tuj1, &alpha;SMA- und AFP-Maus-Antikörper.&nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR990212</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1386</td><td>Rekonstituieren Sie mit 2,15 ml DMSO pro mg Pulver, um eine 1 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren Sie das gewünschte Volumen und lagern Sie es bei -20 °C. Vermeiden Sie Gefrier- und Auftauzyklen.</td></tr><tr><td>CryoTube</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>3754518</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41640</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>BioWest</td><td>L0107</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td>Vor Gebrauch durch Erhitzen für 30 Minuten bei 56°C inaktivieren. Aliquotieren und bei -20°C lagern; C</td></tr><tr><td>Spülnadel</td><td>BD&nbsp;</td><td>304000</td><td>Das Ende der Nadel abschneiden und auf einem Schleifstein bis zur stumpfen Spitze zerkleinern</td></tr><tr><td>Gelatine aus Schweinehaut</td><td>Fluka</td><td>48724</td><td>Bei 0,2 % in destilliertem Wasser verdünnen und autoklavieren. Jede Verdünnung kann einen Monat lang verwendet werden.</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG, Alexa Fluor 594</td><td>Molekularsonden - Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>1:500 Verdünnung. Sekundärer Antikörper für Sox2-Kaninchen-Antikörper.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>BioWest</td><td>L0611</td><td></td></tr><tr><td>Hepes-gepuffert CZB&nbsp;</td><td>Hausgemacht</td><td></td><td>Siehe Zusammensetzung in Chatot et al., 1989</td></tr><tr><td>Humanes Choriongonadotropin</td><td>Divasa-Farmavic</td><td>Veterin-Corion 3000 UI</td><td>Verdünnt in NaCl 0,9% bei 50 IE/ml. Aliquotieren Sie es in 1 ml und lagern Sie es bei -20μg; C für bis zu zwei Monate. Nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren.</td></tr><tr><td>Humane Vorhautfibroblasten</td><td>ATCC</td><td>ATCCSCRC-1041</td><td>Für die Langzeitlagerung wird empfohlen, sie in flüssigem Stickstoff zu lagern.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologien</td><td>&nbsp; 10828-028</td><td>Lichtempfindlich. Es wird empfohlen, es in kleinen Volumina wie 10 ml zu aliquotieren und bei -20° ordm zu lagern; C (Überprüfen Sie das Ablaufdatum). Vermeiden Sie Frost- und Auftauzyklen. &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>KSOMaag Evolve</td><td>Zenith Biotech</td><td>ZEKS-050</td><td>Supplement mit 4 mg/ml BSA. Äquilibrieren bei 37° ordm; C und 5% CO2 pro Tag vor der Anwendung.</td></tr><tr><td>Leukämie-Hemmfaktor</td><td>Merk Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Mäuse&nbsp;</td><td>Charles River/Harlan</td><td></td><td>Es wird empfohlen, Mäuse aus einem permissiven Stamm in Bezug auf die mESC-Ableitung (z. B. 129S2 oder C57BL) zu verwenden. Inzuchtstämme sind jedoch weniger effizient bei der Produktion von Embryonen. Daher wird empfohlen, einen Hybridstamm wie 129S2 x C57BL oder B6CBAF1 zu verwenden, um die Vorteile der Hybridkraft zu nutzen.</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Embryo getestet. Lichtempfindlich.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Serva</td><td>2980501</td><td>Rekonstituieren Sie das Pulver mit MilliQ Wasser in einer Menge von 0,5 mg/ml. Bei 4 μm lagern; C vor Licht geschützt. Achtung, es ist schädlich und steht im Verdacht, Krebs zu verursachen.</td></tr><tr><td>Maus Anti-Tubulin &Beta; III (Tuj1)</td><td>Biolegend</td><td>MMS-435P</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Maus monoklonal anti-&alpha;SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Maus monoklonal anti-AFP</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1368</td><td>1:50 Verdünnung</td></tr><tr><td>Maus monoklonal anti Oct3/4&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-5279</td><td>1:50 Verdünnung</td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Life Technologies</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem&nbsp;</td><td>1408</td><td>Rekonstituieren Sie mit 2,08 ml DMSO pro mg Pulver, um eine 1 mM Stammlösung zu erhalten. Aliquotieren Sie das gewünschte Volumen und lagern Sie es bei -20 °C. Vermeiden Sie Gefrier- und Auftauzyklen.</td></tr><tr><td>Petrischale (35 mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale (60 mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Serum für trächtige Stuten Gonadotropin</td><td>Foligon</td><td>Foligon-1000 UI</td><td>In NaCl 0,9 % bei 50 I.E./ml verdünnen. Aliquotieren Sie es in 1 ml und lagern Sie es bei -20 I.E.; C für bis zu zwei Monate. Nach dem Auftauen nicht wieder einfrieren.</td></tr><tr><td>Kaninchen poliklonales Anti-Sox2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5603</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>T75 Falke</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 10x</td><td>BioWest</td><td>X0930</td><td>1:10 in HBSS verdünnen, um eine 1x Lösung zu erhalten</td></tr></tbody></table>

ableitung von stammzelllinien aus präimplantations mausembryonen

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Maus embryonalen Stammzellen (mESC) Ableitung ist der Prozess, durch welche, den pluripotenten Zelllinien aus preimplantation Embryos ansässig sind. Diese Zeilen erhalten die Möglichkeit, entweder selbst zu erneuern oder unter bestimmten Bedingungen zu unterscheiden. Aufgrund dieser Eigenschaften mESC sind ein nützliches Werkzeug in der regenerativen Medizin, Krankheit Modellierung und Gewebe Ingenieurstudium. Dieser Artikel beschreibt ein einfaches Protokoll mESC Linien mit hoher Ableitung Wirkungsgraden (60-80 %) erhalten durch Kultivierung Blastozysten von freizügigen Mausstämme Feeder-Zellen in definierten Mediums mit Leukämie hemmenden Faktor ergänzt. Das Protokoll kann auch angewendet werden um effizient mESC Linien nicht freizügig Mausstämme, abgeleitet durch die einfache Zugabe von einem Cocktail aus zwei kleine Molekül-Inhibitoren auf die Ableitung Medium (2i Medium). Einzelheiten über die Vorbereitung und die Kultur der Feeder-Zellen, Sammlung und Maus-Embryonen und Ableitung und Kultur mESC Linien stehen zur Verfügung. Dieses Protokoll erfordert keine speziellen Ausrüstung und kann in jedem Labor mit grundlegenden Säugerzelle Kultur Expertise durchgeführt werden.

Nach diesem Protokoll sollte mehr als 95 % der Auswuchs Bildung nach der ersten Woche der Kultur (Abbildung 1A) erreicht werden. MESC Linien nach sechs Passagen sind Variable unter experimentellen Wiederholungen mit eine durchschnittliche Erfolgsquote von 60-80 %. Die Zugabe von 2i deutlich verbessert nicht die Ergebnisse bei der Arbeit mit freizügigen Mausstämme, z. B. mit einem 129S2 Hintergrund, aber es ist notwendig, bei der Arbeit mit nicht-freizügigen S...

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, um effizient leiten und Kultur pluripotenten Stammzelllinien aus Maus-Embryonen im Blastozystenstadium.

Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Stammzellen sind pluripotente und spezialisierte Zellen, die sich durch langfristige Selbsterneuerung und die Fähigkeit auszeichnen, unter bestimmten Bedingungen differenzierte Zellen der drei Keimblätter hervorzubringen. Aufgrund dieser Eigenschaften besitzen Stammzellen ein großes Potenzial in der regenerativen Medizin, der Krankheitsmodellierung und der Tierzüchtung. Seit Jahren werden für Forschungszwecke bestimmte embryonale Stammzelllinien hauptsächlich aus Maus-Embryonen gewonnen, wobei im Allgemeinen jedoch nur geringe Ausbeuten bei der Gewinnung erzielt wurden.In diesem Video zeigen wir ein einfaches Protokoll zur Ableitung von embryonalen Stammzelllinien aus Mäusen unter Verwendung standardisierter Bedingungen, das vergleichsweise hohe Ableitungseffizienzen ermöglicht, die mit den Effizienzen bei der Verwendung von Signalwegmodulatoren wie 2i vergleichbar sind. In diesem Protokoll verwenden wir humane Vorkautenfibroblasten als Fütterungszellen für die Ableitung und Kultur von embryonalen Stammzellen. Vor Beginn des Ableitungsprozesses ist es notwendig, die Fütterungszellen zu inaktivieren.Zunächst nehmen Sie eine kryogene Probendose mit in fl&uuml;ssigem Stickstoff gelagerten humanen Fibroblasten aus der Vorhaut und tauen sie auf, indem Sie die Dose in ein Wasserbad bei 37 Grad C tauchen. Nach dem Auftauen verd&uuml;nnen Sie den Inhalt in DMEM, das mit fetalem K&auml;lberserum erg&auml;nzt wurde. S&auml;en Sie die Verd&uuml;nnung in einem Falcon-Kolben aus und kultivieren Sie sie, bis der Konfluenzstadium erreicht ist. Danach verd&uuml;nnen Sie Mitomycin C in DMEM, das mit fetalem K&auml;lberserum erg&auml;nzt wurde, um die Fibroblasten zu inaktivieren, und inkubieren die Zellen drei Stunden lang in dieser Inaktivierungsl&ouml;sung.Entfernen Sie anschließend die Inaktivierungslösung und waschen Sie die Zellen dreimal mit Hank's Balanced Salt Solution, um Reste von Mitomycin C zu entfernen. Um die inaktivierten Futterzellen abzulösen, geben Sie ein Milliliter Trypsin-EDTA-Lösung hinzu und inkubieren die Zellen fünf Minuten lang. Danach beobachten Sie die Zellen unter einem umgekehrten Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie sich vom Kulturgefäß gelöst haben.Anschießend pipettieren Sie die Zellen mit einer Pasteurpipette, um die Zellklumpen zu lösen, und neutralisieren die enzymatische Lösung durch Zugabe von vier Millilitern DMEM, ergänzt mit fetalem Kälberserum. Entnehmen Sie eine kleine Aliquotprobe, verdünnen Sie diese in Kochsalzlösung und bestimmen Sie die Zellanzahl mithilfe einer Neubauer-Kammer. Parallel dazu zentrifugieren Sie den Rest der Probe.Entfernen Sie den Überstand und verdünnen Sie das Pellet in der Gefriermischung auf eine Endkonzentration von einer Million Zellen pro Milliliter. Portionieren Sie die Suspension in kryogene Gefäße. Stellen Sie die kryogenen Gefäße abschließend in einen Gefrieraufsatz und lagern Sie sie bei minus 80 Grad C. Am nächsten Tag lagern Sie sie in flüssigem Stickstoff.Einen bis vier Tage vor Beginn des Differenzierungsprozesses nehmen Sie einen Kryoröhrchen mit inaktivierten Fütterzellen, der in flüssigem Stickstoff gelagert wurde, und tauen ihn in einem Wasserbad bei 37 Grad C auf. Verdünnen Sie die Zellen anschließend in vorgewärmtem DMEM, das mit fetalem Kälberserum ergänzt wurde, und pipettieren Sie vorsichtig, um eine homogene Mischung zu gewährleisten. Geben Sie 500 Mikroliter vorgewärmte Gelatinelösung in jedes Loch einer Vierlochplatte und lagern Sie sie 10 Minuten bei 37 Grad C. Unmittelbar danach entfernen Sie die Gelatine aus jedem Loch.Geben Sie 500 Mikroliter der Verdünnung der Futterzellen in jede Vertiefung und schaukeln Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Futterzellen auf dem Boden der Vertiefungen zu gewährleisten. Vermeiden Sie kreisförmige Bewegungen, da dies die Zellen in der Mitte der Vertiefung konzentrieren würde. Anschließend stellen Sie die Platte für mindestens 24 Stunden in den Inkubator bei 37 Grad und 5 % Kohlendioxid.Am nächsten Tag die Zellen unter einem inversen Mikroskop beobachten und überprüfen, ob sie angeheftet und gleichmäßig verteilt sind. Schließlich das Medium der Futterzellen durch vorgewärmtes DMEM ergänzt mit fetalem Kälberserum wechseln, um DMSO-Rückstände zu entfernen. Vor der Embryogewinnung die Superovulation bei weiblichen Mäusen durch intraperitoneale Injektion von fünf internationalen Einheiten schwangeren Stuten-Serum-Gonadotropin und humanem Choriongonadotropin im Abstand von 48 Stunden induzieren.Paaren Sie die Weibchen mit Männchen und trennen Sie sie 24 Stunden später. Um Embryonen im Zweizellstadium zu gewinnen, euthanasieren Sie die Weibchen 48 Stunden nach der Begattung, dissezieren die weiblichen Mäuse, um die Eileiter und einen kurzen Abschnitt der Uterushörner zu erhalten, und legen Sie diese in eine Schale mit HEPES-pufferter CZB-Medien. Anschließend spülen Sie unter dem Stereomikroskop einzeln die Eileiter mit HEPES-pufferter CZB-Medien aus, um die Embryonen zu sammeln.Überführen Sie die Zweizellen-Embryonen in eine am Vortag vorbereitete Kulturschale mit mehreren Tropfen Embryokulturmedium, die mit Mineralöl bedeckt sind. Bewahren Sie die Embryonen im Inkubator bis zum Blastozystenstadium auf. Überwachen Sie die Embryonalentwicklung alle 24 Stunden.Es wird erwartet, dass die Embryonen 48 Stunden nach Beginn der In-vitro-Kultur das Blastozystenstadium erreichen. Wenn möglich, sollten nur expandierte Blastozysten zur Initiierung des Ableitungsprozesses ausgewählt werden. Am Tag der Embryo-Aussaat das Medium für die Stammzellenableitung vorbereiten.Fügen Sie Leukämie-Hemmfaktor (LIF) zu DMEM hinzu, das mit 2-Beta-Mercaptoethanol, nicht essentiellen Aminosäuren und KnockOut-Serumersatz ergänzt wurde. Falls gewünscht, fügen Sie einen MAPK-Inhibitor und einen GSK-3-Inhibitor hinzu, um ein 2i-Medium zu erhalten. Nehmen Sie die Vier-Well-Platte mit der Einzelschicht an Fütterungszellen aus dem Inkubator. Entfernen Sie das Medium und geben Sie 800 Mikroliter des frisch zubereiteten Differenzierungsmediums hinzu. Vor der Aussaat der Blastozysten auf den Fütterungszellen muss die Zona pellucida entfernt werden. Überführen Sie dazu ein Embryo von der Kulturplatte in einen Tropfen saurer Tyrode-Lösung und belassen Sie ihn dort, bis die Zona pellucida verdaut ist.Stellen Sie sicher, dass die Zona pellucida vollständig entfernt wurde, indem Sie den Fokus und den Kontrast des Stereomikroskops anpassen. Spülen Sie dann den zonafreien Embryo in mehreren Tropfen Differenzierungsmedium und geben Sie ihn auf eine Einzelschicht von Fütterungszellen. Wiederholen Sie den Vorgang mit den übrigen Embryonen.Züchten Sie die Platte bei 37 Grad C und 5 % Kohlendioxid. Überwachen Sie die Kulturen alle 24 Stunden unter einem invertierten Mikroskop, um das Wachstum zu beurteilen und mögliche frühe Differenzierungszeichen zu erkennen, wie zum Beispiel geschwollene, refraktäre Zellen, die den Auswuchs umgeben oder sogar die Fütterungszellen zur Seite drücken. Wechseln Sie das Kulturmedium jeden zweiten Tag.Um dies durchzuführen, nehmen Sie die Vier-Well-Platte aus dem Inkubator, entfernen das Medium aus jedem Well und geben 800 Mikroliter vorgewärmtes Differenzierungsmedium, ergänzt mit LIF und gegebenenfalls 2i, hinzu. Stellen Sie die Platten zurück in den Inkubator und pflegen Sie die Kultur, bis Auswüchse beobachtet werden. Sechs bis acht Tage nach der Befruchtungseizell-Aussaat sollte ein Auswuchs sichtbar sein, der subkultiviert werden muss.Für dieses Verfahren werden pipettenähnliche Griffe und Pipetten zur Stammzellmanipulation benötigt. Um sie herzustellen, nehmen Sie eine Pasteurpipette mit langem Spitzenende und erhitzen den dünnen Teil mit einem Bunsenbrenner. Sobald der Teil weich ist, ziehen Sie die Pipette aus der Flamme und ziehen beide Enden auseinander, bis sie sich trennen.Verwenden Sie den dickeren Teil als Pipette zur Stammzellmanipulation. Erhitzen Sie die Spitze des dünneren Teils und formen Sie sie zu einem Haken, um einen kellenartigen Griff herzustellen. Um das Auswachsen zu unterkultivieren, lokalisieren Sie es unter dem Stereomikroskop.Mit Hilfe des Griffs werden die differenzierten Zellen, die das Auswachsen umgeben, abgeschoben. Um eine mögliche Differenzierung zu vermeiden, ist es wichtig, strikt vorzugehen, wenn die differenzierten Zellen vom Rand des Auswachsens entfernt werden. Mit einer Pipette für Stammzellenmanipulationen wird das Auswachsen aspiriert und in einen Tropfen vorgewärmter Trypsin-EDTA-Lösung gegeben.Mit Hilfe eines Skalpells schneiden Sie das Auswachsen in mehrere Stücke, um es mechanisch und enzymatisch zu disaggregieren. Sammeln Sie die Auswuchsfragmente ein und geben Sie sie in einen Tropfen vorgewärmtes Herleitungsmedium, um die Trypsinwirkung zu neutralisieren. Schließlich säen Sie die Auswuchsfragmente in die Viermuldenplatte mit einer Einzelschicht von Fütterungszellen aus und kultivieren sie in Herleitungsmedium bei 37 Grad C und 5 % Kohlendioxid.Stammzellenähnliche Kulturen müssen mindestens sechs Wochen lang gepflegt werden, bevor eine ESC-Linie als etabliert angesehen werden kann. Während dieses Zeitraums ist es notwendig, alle zwei Tage das Medium zu wechseln und sie einmal wöchentlich zu unterkultivieren. Mit zunehmender Passagezahl verändert sich die Morphologie der Kolonien schrittweise von einer gewölbten Form hin zu einer stärker gestreckten und abgeflachten Morphologie.Nach sechs Passagen exprimieren murine ES-Zelllinien konstitutiv Pluripotenzmarker wie Oct4 und Sox2. Darüber hinaus können nach induzierter in-vitro-Differenzierung der ES-Zellen durch Kultivierung in DMEM, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum und ohne Fütterzellen, Differenzierungsmarker der drei Keimblätter mittels Immunfluoreszenz nachgewiesen werden. Hier zeigen wir den Nachweis des Anti-Tubulin-Beta-3-Proteins als Marker für das Ektoderm, von Alpha-Smooth-Muscle-Aktin für das Mesoderm und von Alpha-Fetoprotein für das Entoderm.Nach dieser einfachen Vorgehensweise können embryonale Stammzellen aus Mausblastozysten mit Effizienzen zwischen 60 % und 78 % gewonnen werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zellen täglich oder jeden zweiten Tag zu kontrollieren, da die hier angegebenen Zeitpunkte lediglich beispielhaft sind. Wenn sich Kolonien embryonaler Stammzellen zu stark ausbreiten, werden sie durch Zellansammlung dunkler und neigen stärker zur Differenzierung. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis für die Gewinnung und Kultur embryonaler Mausstammzellen unter Standardbedingungen haben.

derivation-of-stem-cell-lines-from-mouse-preimplantation-embryos

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Protokoll beschreibt die Herleitung der transplantierbaren hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus (ESC) und deren anschließende Injektion in letal bestrahlten Mäusen Empfänger. Kurz gesagt, ESC als Embryoidkörpern, die dann mit retroviralen HOXB4 und co-kultiviert mit OP9 Stromazellen und hämatopoetischen Zytokinen infiziert sind differenziert.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

Die Fähigkeit von humanen embryonalen Stammzellen sich selbst zu erneuern und zu differenzieren sich in alle Zelltypen des Körpers lässt vermuten, dass sie großes Versprechen für medizinische Anwendungen und als Recherche-Tool für die Bewältigung grundlegender Fragen in Entwicklung und Krankheit zu halten. Hier bieten wir Ihnen einen kurzen Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen aus Embryonen, die durch immunosurgical Isolierung der inneren...

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

Die Fähigkeit von embryonalen Keimzellen in primordialen Keimzellen während der frühen Entwicklungsstadien zu unterscheiden, ist eine perfekte Modell, um unsere Hypothese über Krebs und Unfruchtbarkeit Adresse. Dieses Protokoll zeigt, wie Ur-Keimzellen aus Entwicklungsländern Gonaden in 10,5-11,5 Tage nach coitum Maus-Embryonen zu isolieren.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

In diesem Video zeigen wir die Isolierung der Maus Blastozysten und die Ableitung der Trophoblast-Stammzellen aus Blastozysten. Wir beschreiben auch Bedingungen für die Wartung der Stammzell-Eigenschaft sowie die Induktion der Differenzierung in Kultur.

Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

Erzeugung induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) Linien produziert Linien unterschiedlicher Entwicklungspotenzial, auch wenn sie Standard-Tests für Pluripotenz passieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Mäuse vollständig aus iPS, die die iPSC Linien definiert als die über volle Pluripotenz abgeleitet...

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

Eine einfache Methode zur Ableitung und pflegen Spermatogonien Stamm-und Vorläuferzellen Zelllinien aus erwachsenen Mäusen wird hier vorgestellt. Das Verfahren nutzt Feeder-Zellen, die aus dem somatischen Zellkompartiment der adulten Maus Hoden. Diese Technik ist für die gemeinsame Mausstämmen, auch transgenen Knock-out und Knock-in Mäusen.

Serielle Anreicherung von Spermatogonien Stamm-und Progenitorzellen (SSC) in der Kultur für die Ableitung des langfristigen adulten Maus SSC Linien

In den letzten Jahren ist die Bildung von Keimzellen mit in-vitro-Kultur Methoden nachgewiesen wurde mit mehreren verschiedenen Arten von somatischen Stammzellen. Dieser Artikel wird visuell präsentieren die Differenzierung der neugeborenen Maus-Stammzellen zu frühen Oozyten-ähnlichen Zellen.

Differenzierung von Newborn Mäusehaut Derived Stem Cells in Germ-like Cells<em&gt; In-vitro-</em

Wir beschreiben eine Reihe von Methoden, um Farbstoffe zu injizieren, DNA-Vektoren, Viren und Zellen, um sowohl das Zellschicksal und Phänotyp von endogenen und transplantierten Zellen aus embryonalen oder pluripotenten Zellen in Maus-Embryonen (E) 9,5 und späteren Stufen abgeleitet an embryonalen Tag überwachen der Entwicklung.

Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen

Dieses Protokoll stellt eine Methode quantitative, single-cell in situ Analyse der Proteinexpression durchzuführen lineage in mouse Spezifikation Präimplantationsembryonen zu studieren. Die Verfahren, die für die Sammlung von Blastozysten, Vollmontage Immunfluoreszenz-Nachweis von Proteinen, Imaging von Proben auf einem konfokalen Mikroskop und Kern Segmentierung und Bildanalyse beschrieben.

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

Dieser Artikel zielt darauf ab, die Verwendung von parthenogenetischen haploiden embryonalen Stammzellen als Ersatz für Spermien für den Aufbau von halbgeklonten Embryonen zu demonstrieren.

Anwendung von Maus parthenogenetischen Haploid embryonalen Stammzellen als Ersatz für Sperma

Erfahren Sie, wie man embryonale Stammzelllinien aus Mausembryonen mit hoher Effizienz ableitet. Dieses Protokoll nutzt humane Fibroblasten als Feederzellen und verbessert die Derivation für die Stammzellbiologie.

Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen

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