In Vivo Multimodale Bildgebung und Analyse der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation Mausmodell

Hier präsentieren wir Ihnen die Nützlichkeit der längs in-Vivo Bildgebung bei der Nachbereitung der morphologischen Veränderungen der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation bei Mäusen.

Neovaskuläre Prozesse sind ein charakteristisches Merkmal mehrerer weit verbreiteter Augenerkrankungen. Am bekanntesten sind die exsudative altersbedingte Makuladegeneration oder kurz feuchte AMD, die proliferative diabetische Retinopathie und die Frühgeborenenretinopathie. Zusammen sind diese Erkrankungen für die meisten Fälle von gesetzlicher Blindheit weltweit verantwortlich und mit zusätzlichen Augenkomplikationen wie Glaskörperblutungen und neovaskulärem Glaukom verbunden.

Trotz ihrer Prävalenz sind die therapeutischen Möglichkeiten für neovaskuläre Erkrankungen des Auges jedoch begrenzt. Der derzeitige Behandlungsstandard bei Neovaskularisationen im Zusammenhang mit AMD und proliferativer diabetischer Retinopathie ist die intravitreale Injektion von humanisierten Antikörpern, die gegen einen kritischen Mediator der Angiogenese und Neovaskularisation, den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor oder VEGF, gerichtet sind. Trotz der Wirksamkeit bei der Eindämmung des Fortschreitens der Krankheit und der Verbesserung des funktionellen Sehvermögens sind intravitreale Injektionen jedoch kostspielig und alles andere als ohne Risiko.

Zu den Komplikationen können Infektionen, Endophthalmitis, Netzhautablösung und Augenblutungen gehören. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung neuartiger Behandlungsoptionen, die wirksam, sicher und kostengünstig sind. Um die Entwicklung von Medikamenten für neovaskuläre Erkrankungen voranzutreiben, sind Kleintiermodelle von entscheidender Bedeutung.

Solche Modelle müssen reproduzierbar sein, über etablierte und validierte Messwerte und Endpunkte verfügen und idealerweise eine klinisch relevante Referenzsubstanz als Positivkontrolle verwenden. In diesem Protokoll stellen wir das choroidale Neovaskularisationsmodell (CNV-Modell) der Maus vor, das eines der am häufigsten verwendeten Modelle sowohl für die Untersuchung pathophysiologischer Mechanismen, die zur CNV beitragen, als auch für die Entwicklung neuartiger antineovaskulärer Wirkstoffe ist. Im CNV-Modell wird die Bruchsche Membran mit einem Argonlaser aufgebrochen.

Dadurch werden neovaskuläre Prozesse eingeleitet, die von der Aderhaut ausgehen. Der Einsatz von longitudinaler In-vivo-Bildgebung mittels optischer Kohärenztomographie im Spektralbereich, kurz SD-OCT, und Fluoreszenzangiographie bietet die Möglichkeit, die Proliferation und Regression von CNV zu verfolgen. Und damit die Wirksamkeit und der zeitliche Verlauf neuartiger pharmazeutischer Interventionen zu bewerten.

Jüngste Fortschritte in der Bildverarbeitung ermöglichen darüber hinaus die automatisierte Segmentierung für die Messung der Netzhautdicke und bieten eine Methodik, die frei von Prüferverzerrungen ist, um das Vorhandensein von Ödemen zu bewerten. Im Folgenden werden wir die Nützlichkeit der neuen InVivoVue Diver-Software von Leica Microsystems für die automatisierte Segmentierung von Netzhautschichten im CNV-Modell der Maus erörtern. Abschließend werden wir diskutieren, wie die histologische Analyse von retinalen Ganzhalterungen die longitudinale in vivo-Bildgebung in diesem Modell ergänzen kann.

Ein einzelner Tropfen Tropicamid wird zur Pupillenerweiterung auf jedes Auge aufgetragen. Anschließend wird das Tier sanft in die Nagetierausrichtungsphase gebracht. Die Maus ist so eingestellt, dass sie das Auge freilegt und mit dem Nasenhalter und einem Stück Laborband, das sanft über den Rücken gelegt wird, gesichert.

Als nächstes wird ein Tropfen Gleitmittel auf das Auge aufgetragen, um es mit Feuchtigkeit zu versorgen, und überschüssige Flüssigkeit wird vorsichtig mit Filterpapiertupfern entfernt. Zuletzt wird der Tisch vor dem OCT-Gerät für die OCT-Basisbildgebung ausgerichtet. Die optische Kohärenztomographie im In-vivo-Spektralbereich wird zu Beginn der Laseranwendung durchgeführt, um das Fehlen von Netzhautanomalien zu überprüfen.

Nehmen Sie die Maus vorsichtig aus der Halterung. Geben Sie einen Tropfen Viscotears Gel auf eine Deckfolie, um die Hornhaut zu applanieren. Richten Sie die Maus mit dem Sehnervenkopf in der Mitte aus und fokussieren Sie den Laserstrahl auf das retinale Pigmentepithel.

Führen Sie drei Laserschüsse aus, indem Sie die retinalen Blutgefäße an den Positionen vier, acht und 12 Uhr um den Sehnerv herum vermeiden. Überprüfen Sie die Festigkeit des Auges nach allen Laserschüssen auf das Fehlen von Netzhautblutungen. Richten Sie die Maus wie zuvor in der Halterung aus und führen Sie eine Fluoreszenzangiographie und eine OCT-Bildgebung durch, um eine Schädigung der Bruch-Membran zu bestätigen.

Für die Fluoreszenzangiographie wird zunächst auf Laserbrandbereiche mit dem Infrarot-Reflexionsmodus fokussiert, der es ermöglicht, die Stellen zu visualisieren, an denen der Laser verabreicht wurde. Injizieren Sie vorsichtig 0,1 Milliliter 5%iges Fluorescein-Natriumsalz für etwa 20 Gramm Körpergewicht der Maus, ohne die Position des Mausauges zu verändern. Beginnen Sie mit der Aufnahme von Fluoreszenzangiographiebildern auf Höhe der Aderhaut und auf Höhe der Netzhaut, etwa alle 30 Sekunden.

Richten Sie das Auge für die OCT-Bildgebung wie zuvor aus und beginnen Sie mit der Bildgebung. Die Mittelung des SD-OCT-Signals hilft, die detaillierte Morphologie der Netzhaut besser zu visualisieren, wie in dieser Sequenz gezeigt. Nachdem die SD-OCT-Bildgebung durchgeführt wurde, nehmen Sie die Maus vorsichtig aus der Halterung.

Tragen Sie Gleitmittel für beide Augen auf. Zu diesem Zeitpunkt können Sie sich entscheiden, die Anästhesie durch subkutane Injektion des Alpha-2-Antagonisten für Medetomidin, Atipamezol, umzukehren oder auf die Genesung des Tieres aus der Anästhesie zu warten. Wiederholen Sie die in vivo SD-OCT- und FA-Bildgebung bei anästhesierten Tieren an den Nachbeobachtungstagen fünf, 10 und 14.

Nutzen Sie die automatische Segmentierungsfunktion der InVivoVue Diver-Software für Messungen der Netzhautdicke. Für die gesunde Netzhaut wird die Gesamtdicke der Netzhaut als die Dicke aller Schichten betrachtet, von der Nervenfaserschicht bis zum RPE. In der gesunden Netzhaut können durch die automatisierte Segmentierung einzelne Netzhautschichten genau erkannt werden, wie in diesem Beispiel zu sehen ist.

Es ist erwähnenswert, dass an Stellen, an denen CNV vorhanden ist, eine manuelle Messung der Netzhautdicke für jede CNV-Läsionsstelle separat durchgeführt werden sollte. Von der Nervenfaserschicht zu einer imaginären Linie, die durch die RPE-Schicht verläuft. Diese Sequenz zeigt den Arbeitsablauf für manuelle Dickenmessungen an Stellen, an denen CNV-Läsionen vorhanden sind.

Die Nervenfaserschicht befindet sich am oberen Bildrand, die Aderhaut am unteren Bildrand. Mit der Maus oder dem Touchpad werden die Ränder der Nervenfaserschicht und der Aderhaut manuell bestimmt, und die Software berechnet anhand dieser Koordinaten automatisch die Gesamtdicke der Netzhaut. Diese Abbildung zeigt Serienbilder, die alle 20 Sekunden auf Aderhautebene aufgenommen wurden.

Bild eins wurde im Infrarot-Reflexionsmodus aufgenommen. Während die anderen nach intraperitonealer Fluorescein-Injektion. Weiße Pfeile in Bild eins zeigen auf gelaserte Stellen, die Fluorescein-Leckagen zu späteren Zeitpunkten zeigen, hervorgehoben durch die weißen Pfeile in Bild 18.

Dieses Bild zeigt eine serielle FA-Bildgebung, die auf retinaler Ebene aufgenommen wurde. Der weiße Pfeil in Bild 18 zeigt auf eine gelaserte Stelle, die zeigt, dass die Fluorescein-Leckage schneller auftritt als die beiden anderen, in Bild 18 kreisförmig umrandet. Diese Zusammenfassung zeigt den zeitlichen Verlauf von SD-OCT-Bildern.

Zu Studienbeginn, unmittelbar nach dem Lasern und die Nachbeobachtungszeit an den Tagen fünf, 10 und 14. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Protokoll für die longitudinale in vivo-Bildgebung von CNV-Läsionen mittels SD-OCT- und FA-Bildgebung eine schnelle, multimodale und zuverlässige Klassifizierung der CNV-Pathologie und des Vorhandenseins eines retinalen Ödems ermöglicht. Vielen Dank für Ihr Interesse.