In Vivo Multimodale Bildgebung und Analyse der laserinduzierten choroidale Neovaskularisation Mausmodell

Neovaskularisierungsprozesse sind ein charakteristisches Merkmal mehrerer verbreiteter okularer Erkrankungen. Am deutlichsten zeigen sich diese bei der exsudativen altersbedingten Makuladegeneration, kurz Wet AMD, der proliferativen diabetischen Retinopathie und der Retinopathia praematurorum. Gemeinsam verursachen diese Erkrankungen weltweit die meisten Fälle von gesetzlicher Erblindung und sind mit weiteren okularen Komplikationen assoziiert, wie beispielsweise Glaskörperblutungen und neovaskulärem Glaukom.

Jedoch sind die therapeutischen Optionen bei okularen neovaskulären Erkrankungen trotz ihrer Häufigkeit begrenzt. Der derzeitige Standard der Behandlung von Neovaskularisierung im Zusammenhang mit AMD und proliferativer diabetischer Retinopathie ist die intravitreale Injektion humanisierter Antikörper, die gegen einen zentralen Mediator der Angiogenese und Neovaskularisierung gerichtet sind, nämlich gegen den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor oder VEGF. Trotz der Wirksamkeit bei der Hemmung des Krankheitsfortschritts und der Verbesserung der funktionellen Sehkraft sind intravitreale Injektionen kostspielig und mit Risiken behaftet.

Zu den Komplikationen können Infektionen, Endophthalmitis, Netzhautablösung und okuläre Blutungen zählen. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung neuartiger Behandlungsoptionen, die wirksam, sicher und kostengünstiger sind. Um die Arzneimittelentwicklung bei neovaskulären Erkrankungen voranzutreiben, sind Kleintiermodelle von entscheidender Bedeutung.

Solche Modelle müssen reproduzierbar sein, etablierte und validierte Messgrößen sowie Endpunkte aufweisen und idealerweise eine klinisch relevante Referenzverbindung verwenden, die als positiver Kontrollstoff dient. In diesem Protokoll stellen wir das Mausmodell der choroidalen Neovaskularisierung, oder CNV-Modell, vor, das eines der am häufigsten verwendeten Modelle sowohl zur Untersuchung der pathophysiologischen Mechanismen, die zur CNV beitragen, als auch zur Entwicklung neuartiger antiangiogener Wirkstoffe ist. Im CNV-Modell wird die Bruchsche Membran mittels eines Argonlasers perforiert.

Dadurch werden neovaskuläre Prozesse aus der Aderhaut heraus initiiert. Die Anwendung der longitudinalen In-vivo-Bildgebung mittels optischer Kohärenztomographie im Spektralbereich, kurz SD-OCT, und der Fluoreszein-Angiographie ermöglicht es, das Wachstum und die Regression von CNV zu verfolgen. Und somit die Wirksamkeit und den zeitlichen Verlauf neuartiger pharmazeutischer Interventionen zu bewerten.

Aktuelle Fortschritte in der Bildverarbeitung ermöglichen zudem die automatisierte Segmentierung zur Messung der Netzhautdicke und stellen damit eine methodeunabhängige, vom Untersucher freie Methodik zur Beurteilung des Vorhandenseins eines Ödems bereit. In diesem Beitrag werden wir die Nützlichkeit der neuen InVivoVue Diver-Software von Leica Microsystems für die automatisierte Segmentierung der Netzhautschichten im Maus-CNV-Modell erörtern. Abschließend werden wir diskutieren, wie die histologische Analyse von Netzhaut-Ganzpräparaten die longitudinale in-vivo-Bildgebung in diesem Modell ergänzen kann.

Ein einzelner Tropfen Tropicamid wird auf jedes Auge zur Pupillenerweiterung aufgetragen. Anschließend wird das Tier vorsichtig in die Ratten-Halterungsvorrichtung platziert. Die Maus wird so ausgerichtet, dass das Auge freiliegt, und mithilfe des Nasenhalters sowie eines Stückes Laborbandes, das sanft über dem Hinterkopf befestigt wird, fixiert.

Anschließend wird ein Tropfen Gleitmittel auf das Auge aufgetragen, um es zu befeuchten, und überschüssige Flüssigkeit wird vorsichtig mit Filterpapierspitzen entfernt. Zuletzt wird der Tisch vor dem OCT-Gerät ausgerichtet, um eine Basis-OCT-Aufnahme durchzuführen. In-vivo-Spectral-Domain-Optische-Kohärenztomographie-Aufnahmen werden vor der Laseranwendung als Basislinie durchgeführt, um das Fehlen jeglicher Netzhautveränderungen zu überprüfen.

Entfernen Sie die Maus vorsichtig aus dem Halter. Geben Sie einen Tropfen Viscotears Gel auf einen Deckgläser, um die Cornea zu applanieren. Richten Sie die Maus so aus, dass der Sehnervenkopf in der Mitte liegt, und fokussieren Sie den Laserstrahl auf das retinale Pigmentepithel.

Führen Sie drei Laserimpulse durch, wobei die Netzhautgefäße an den Positionen vier, acht und zwölf Uhr um den Sehnerv herum vermieden werden. Überprüfen Sie nach allen Laserimpulsen die Festigkeit des Auges hinsichtlich des Fehlens einer Netzhautblutung. Richten Sie die Maus wie zuvor im Halter aus und führen Sie eine Fluoreszein-Angiographie und OCT-Bildgebung durch, um den Schaden an der Bruchschen Membran zu bestätigen.

Bei der Fluoreszein-Angiographie zuerst mithilfe des Infrarot-Reflexionsmodus auf die Laserverbrennungsstellen fokussieren, wodurch die Stellen sichtbar werden, an denen der Laser appliziert wurde. Vorsichtig 0,1 Milliliter einer 5 %igen Natriumfluoreszein-Lösung für etwa 20 Gramm Körpergewicht der Maus injizieren, ohne die Augenposition der Maus zu verändern. Beginnen Sie etwa alle 30 Sekunden mit der Aufnahme von Fluoreszein-Angiographie-Bildern auf der Ebene der Aderhaut und auf der Ebene der Netzhaut.

Positionieren Sie das Auge wie zuvor für die OCT-Bildgebung und beginnen Sie mit der Aufnahme. Eine Mittelung des SD-OCT-Signals hilft, die detaillierte Netzhautmorphologie besser darzustellen, wie in dieser Sequenz gezeigt. Sobald die SD-OCT-Bildgebung abgeschlossen ist, nehmen Sie die Maus vorsichtig aus dem Halter.

Tragen Sie Schmiermittel auf beide Augen auf. An diesem Punkt können Sie die Anästhesie durch subkutane Injektion des Alpha-2-Antagonisten Atipamezol für Medetomidin umkehren oder auf die Erholung des Tieres von der Anästhesie warten. Wiederholen Sie die in-vivo-SD-OCT- und FA-Bildgebung bei anästhesierten Tieren an den Folgetagen fünf, 10 und 14.

Verwenden Sie die automatisierte Segmentierungsfunktion der InVivoVue Diver-Software für die Messung der Netzhautdicke. Bei der gesunden Netzhaut wird die Gesamtdicke der Netzhaut als Dicke aller Schichten von der Nervenfaserschicht bis zur Pigmentepithelschicht (RPE) betrachtet. Bei der gesunden Netzhaut kann die automatisierte Segmentierung einzelne Netzhautschichten genau erkennen, wie in diesem Beispiel zu sehen ist.

Es ist erwähnenswert, dass an Stellen mit CNV die manuelle Messung der Netzhautdicke für jeden CNV-Läsionsherd getrennt durchgeführt werden sollte. Von der Nervenfaserschicht bis zu einer gedachten Linie, die durch die RPE-Schicht verläuft. Diese Abfolge zeigt den Arbeitsablauf für manuelle Dickenmessungen an Stellen mit CNV-Läsionen.

Die Nervenfaserschicht befindet sich oben, die Aderhaut unten im Bild. Mithilfe der Maus oder des Touchpads werden die Grenzen der Nervenfaserschicht und der Aderhaut manuell festgelegt, und die Software berechnet automatisch die gesamte Netzhautdicke anhand dieser Koordinaten. Diese Abbildung zeigt Serienaufnahmen, die im Abstand von jeweils 20 Sekunden auf der Ebene der Aderhaut aufgenommen wurden.

Bild eins wurde im Infrarot-Reflexionsmodus aufgenommen, während die anderen nach intraperitonealer Injektion von Fluorescein entstanden. Weiße Pfeile in Bild eins zeigen auf die bestrahlten Stellen, die zu späteren Zeitpunkten ein Auslaufen von Fluorescein aufweisen, hervorgehoben durch die weißen Pfeile in Bild 18.

Diese Aufnahme zeigt eine serielle FA-Bildgebung auf Netzhautebene. Der weiße Pfeil in Bild 18 zeigt auf eine laserbehandelte Stelle, bei der die Fluorescein-Leckage schneller auftritt als bei den beiden anderen, die in Bild 18 mit Kreisen markiert sind. Diese Übersichtsabbildung zeigt einen zeitlichen Verlauf von SD-OCT-Aufnahmen.

Zum Ausgangszeitpunkt, unmittelbar nach dem Lasern sowie zu den Nachuntersuchungszeitpunkten am fünften, zehnten und vierzehnten Tag. Zusammenfassend ermöglicht das Protokoll zur longitudinalen in-vivo-Bildgebung von CNV-Läsionen mittels SD-OCT- und FA-Bildgebung eine schnelle, multimodale und zuverlässige Klassifizierung der CNV-Pathologie sowie des Vorhandenseins von Netzhautödem. Vielen Dank für Ihr Interesse.