Name: Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Lernen Sie die Präparation und Immunfärbung erwachsener Drosophila melanogaster-Gehirne zur Untersuchung von Pilzkörper- und Photorezeptorneuronen. Diese Methode ermöglicht die Analyse neuronaler Entwicklung und Konnektivität.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir möchten Changhui Pak und Alysia Vrailas Mortimer bedanken für den Unterricht zunächst SMK Gehirn Dissektion Technik. Wir danken auch Mitglieder des Ken Mobergs Lab-Gruppe, vor allem Chris Runden für das Manuskript kritisch zu lesen. Antikörper erkennen Fas2 (1-4) und Chaoptin (24B10) stammen aus der Entwicklungsbiologie Studien Hybridoma Bank. Antikörper-24B10 wurde auf die DSHB durch Seymour Benzer und Nansi Colley24,60,61eingezahlt, Antikörper 1 4 war, die DSHB von Corey Goodman 22,23,56hinterlegt. Fliegende-Aktien wurden von Bloomington Stock Center erhalten. Wir möchten auch danke dem Ohio Agricultural Research und Development Center (OARDC) MCIC Imaging Center für den Einsatz des konfokalen Mikroskops Gehirne in Abbildung 4A Image und B. SMK wird unterstützt durch einen Zuschuss von NICHD (1 R15 HD084241-01A1).

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Die Dissektion und Visualisierung der oben beschriebene Methode kann in einer Vielzahl von Immunostaining verwendet werden und live imaging-Anwendungen. Wir haben eine allgemeine Immunostaining Protokoll beschrieben und haben deutlich gemacht, dass eine Art und Weise MARCM axonalen Morphologie der einzelnen Pilz Körper Nervenzellen visualisieren verwendet werden kann. Darüber hinaus diese allgemeine Verfahren können auch verwendet werden, für andere Hirnregionen in festen imaging oder frisch seziert Erwachsenen Gehirne48,65. Live Imaging können ein effizienteres Vorgehen bei der Analyse der Expressionsmuster von Enhancer fallen, Reporter-Gene oder mimischen Linien66, zum Beispiel. Um zu verhindern, dass erfassen Artefakte von Zelltod während der live Aufnahme der GLP in fixierten Gewebe, Gehirne sollten werden zerlegt in 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder HL3 Medien48, montiert auf Brücke Folien in 1 x PBS (oder HL3) und abgebildet in weniger als 15-20 min. Pflege auch achten so viel Luftröhre möglichst aus dem seziert Gehirn vor Bildgebung, zu entfernen, da es mit Visualisierung der GFP Fluoreszenz stören kann.
Während Färbung Bedingungen für die Beurteilung der Morphologie der Pilze Körper und Photorezeptor Neuronen relativ gut etablierte24,61,67, die Lokalisierung eines spezifischen Proteins des Interesses an dieser Zelle sind Typen erfordern umfangreiche Fehlerbehebung und Optimierung. Insbesondere sollte einige wichtige Schritte, einschließlich Antikörper Verdünnung, blockierende Puffer Komponente Konzentration und Fixierung, optimiert werden, um reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse zu generieren. Zunächst sollte die optimale Konzentration der primären Antikörper bestimmt werden. Obwohl im Handel erhältlichen Antikörper oft eine empfohlene Verdünnung haben (und wir oft erst beginnen durch den Einsatz dieser Konzentration), sind diese Werte auf Drosophila Gewebe selten empirisch ermittelt. Daher testen eine Reihe von primären Antikörper-Verdünnungen, der Bereich oberhalb und unterhalb des Herstellers ab Vorschlag oft spezifische Färbung führt. Während Primärantikörper Verdünnung kann erhebliche Auswirkungen auf die Färbung Genauigkeit und sollte genau bestimmt werden, die Zeit Gehirne im primären Antikörper enthaltenden ausgebrütet werden können Lösungen mit wenig Einfluss auf das Gesamtergebnis erheblich variieren. Zum Beispiel haben wir ähnliche Ergebnisse beobachtet, wenn Inkubation Gehirne mit den Fas2 Antikörper Primärantikörper für zwei, drei oder sogar vier Tage bei 4 ° c seziert Zwar wir mindestens zwei Nächte empfehlen, haben wir auch Gehirne in Primärantikörper Lösung für eine einzige Nacht inkubiert und reproduzierbare Färbung erhalten. Wichtiger ist, hilft die Begrenzung der Höhe der Zeit, die Gehirne in der sekundären Antikörper zu 3 h bei Raumtemperatur (oder eine Nacht bei 4 ° C) inkubiert werden Grenze unspezifische Bindung der Sekundärantikörper, Hirngewebe.
Zweitens kann es notwendig, zusätzliche "Sperrung" Reagenzien zu verwenden, um unerwünschte Hintergrundgeräusche Signal zu beseitigen sein. Erhöhung der Konzentration von NGS auf ~ 10 %, 1-10 % Bovine Serum Albumin (BSA) hinzufügen, die Sperrung und primäre/sekundäre Antikörper Lösungen oder Pre-Adsorption von primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C mit Drosophila Embryos (siehe Optionen Referenz-68, Abschnitt 2.9, Schritt 3).
Während wir das obige Protokoll mit PTN als den vorgeschlagenen Puffer für alle Fixierung geschrieben haben, führen waschen, und Antikörper Inkubationsschritte, Gewebe Fixierung in anderen Puffer (z. B. PLP und PEM, aufgeführt in der Materialtabelle) tiefgreifende Unterschiede in Signalstärke. Zum Beispiel haben frühere Studien gezeigt, dass Cyclin E ist nicht nachweisbar im Larvenstadium imaginalen Scheiben, wenn Gewebe im traditionellen 4 % Paraformaldehyd in PBS verdünnt behoben werden, aber ist deutlich sichtbar, wenn Gewebe im PLP Puffer (Ken Moberg, persönliche behoben werden Kommunikation und Referenz-69). Neben Änderungen im Puffer Komponenten, Änderung der Zeit und Temperatur für Gewebe Fixierung auch erheblich immunofluorescent beeinträchtigen kann beflecken und kann bei Bedarf empirisch ermittelt werden. In der Regel Fixierzeit sollte lang genug sein, für ausreichende Vernetzung von Zellkomponenten ermöglichen und langfristige Erhaltung der gesamten zellulären Morphologie während begrenzt genug, um über Vernetzung und "vergraben" von Protein Epitope zu verhindern. Daher beim zunächst Färbung Bedingungen für einen neu erworbenen Primärantikörper optimieren wir in der Regel Fixierzeit ca. 20 min zu begrenzen und behebt oft Gewebe bei kälteren Temperaturen.
Mehrere Steuerelemente sollten in jedem Immunfluoreszenz-Experiment zu untersuchen, die Spezifität der primären und sekundären Antikörper sowie die Wirkung der transgene/genetische Herkunft auf den beobachteten Phänotyp aufgenommen werden. Um festzustellen, ob der primäre Antikörper speziell verwendet wird das Protein des Interesses erkennt, sollte Gewebe von den fliegen fehlt dieses Protein und/oder des Gewebes, die das Protein überexprimiert als Steuerelemente enthalten sein. Die Zugabe von überschüssige gereinigte Antigen Protein kann auch aufgenommen werden, um festzustellen, ob der primäre Antikörper andere Epitope im Gehirn Fliege erkennt. Schließlich stellt jeder Fluoreszenzsignal anwesend, als primären Antikörper entfallen das Niveau der unspezifischen Bindung durch die ausgewählten sekundäre Antikörper.
Mehrere wichtige Steuerelemente sollten auch aufgenommen werden, um den Beitrag der genetische Hintergrund oder das Vorhandensein von transgenen Färbung Intensität oder neuronale Morphologie zu beurteilen. Beispielsweise enthalten die fliegen in die MARCM Experiment in Abbildung 5 verwendet mehrere transgene (HsFLP, UAS-CD8-GFP, FRT82B, Wanne &#62; GAL80 und OK107-GAL4), von denen jeder für Auswirkungen auf die Morphologie der Pilze Körper getrennt analysiert werden sollte. Auf ein absolutes minimum, Pilz Körper Morphologie von fliegen sollten mit OK107-GAL4 und UAS-CD8-GFP analysiert werden. Es kann auch erforderlich sein, die Wirkung der Hitzeschock und Flp Rekombinase Produktion auf Pilz Karosserieentwicklung Dateientyp fliegt mit HsFLP und FRT82B. Obwohl MARCM erhebliche Einblick bieten, ob ein gegebenen Proteins autonom axonalen Führung steuert, kann die Anzahl der Kontrollen erforderlich, um genau diese Schlussfolgerung machen eine kleine Einschränkung dieser Technik sein. In weniger komplizierten Experimente gelten ähnliche Kontrollen auch. Zum Beispiel nehmen Sie ein Experiment, wo ist die GAL4/UAS -System in Kombination mit einer RNAi-Transgen Knockdown Ausdruck eines Proteins des Interesses an alle Neuronen verwendet wird. In diesem Experiment werden mindestens zwei transgene anwesend: eine Pfanne neuronalen GAL4-Treiber z. B. Ilav-GAL4 und UAS-RNAi -Transgen. Die Morphologie der Pilze Körper Neuronen im fliegen, enthält jeder der diese transgene allein sollte neben der Versuchsbedingung untersucht werden, wo fliegen beide transgene in der gleichen Fliege beherbergen.
Schließlich, um festzustellen, ob das Protein des Interesses in Pilz Körper Neuronen zum Ausdruck kommt ist es normalerweise notwendig, Co Fleck Gehirne mit Antikörpern gegen Fas2. Fluoreszierende Proteine wie z. B. GFP, RFP oder die Membran gebunden CD8-GFP können alternativ auch ausgedrückt werden, verwenden das GAL4/UAS -System und in Kombination mit Antikörpern, die das Protein des Interesses zu erkennen. Fas2 erkennt nur die fasciculated Axone, die die Pilz Körper α und β-Lappen zu bilden, seit die Verwendung von GAL4-driven, Membrane-springen CD8-GFP besonders nützlich für die Kennzeichnung von Pilz Körper Neuronen.
Mängel bei der axonalen Beratung sind oft nicht 100 % Penetranz und sogar Gehirne des gleichen Genotyps können gewisse Variabilität zeigen. Daher, wenn mutierten Allele für Mängel in Pilz oder Photorezeptor Pathfinding Analyse neu generiert werden, sollte eine Kombination aus verschiedenen Allelen und Ansätze genutzt werden. Die meisten Studien in der Literatur verschiedene Ansätze um zu untersuchen, ob ein Protein eine Zelle-autonome Rolle bei der Kontrolle der axonalen Anleitung verwenden: ich) Analyse der Pfadfindung Mängel bei homozygot null fliegen (vorzugsweise mit verschiedenen Null-Allele), Ii) Analyse der Pfadfindung Mängel an fliegen fehlt das Protein des Interesses nur in Neuronen (in der Regel über RNAi), Iii) MARCM Analyse der Pfadfindung Mängel und iv) Experimente, wo das Gen erneut zum Ausdruck in den Neuronen der homozygot Null ist, zu retten fliegt. Im Idealfall sollten mehrere Dutzend Köpfe pro Genotyp für Mängel in neuronale Morphologie analysiert werden.
Obwohl das Protokoll hier in erster Linie konzentriert sich auf immunofluorescent Lokalisierung von Proteinen innerhalb fixierte Gewebe beschrieben, werden mehrere zukünftige Anwendungen dieser Technik zum Bild live Hirngewebe entwickelt. Gehirn (in der Regel in Zellkulturmedien) seziert werden, kann sie dann kultiviert für mehrere Tage bei 25 ° c Diese ex Vivo Kultivierung Methoden entwickelt, um eine Vielzahl von biologischen Prozessen, wie z. B. Proteinaktivität zu untersuchen, das Axon Regeneration nach Verletzungen70,71, intrazelluläre fördert Signalisierung Dynamik72und neuronale Entwicklung73.

Zwar das Nervensystem Drosophila kleiner als die von Menschen und Nagern, stellt seine Komplexität ein kraftvoll, ansprechbar Modell zum besseren Verständnis seiner fest gefügten Pendants. In vielen Fällen kodieren das Genom der Wirbeltiere und fliegt sehr ähnliche Proteine, die die Mechanismen der Entwicklung des Nervensystems zu diktieren. In der Tat erforderlich viele der Gene, für die neuronale Entwicklung bei Wirbeltieren Orthologe in fliegen, einschließlich derjenigen Signalwege, dass Kontrolle Musterung, Neurogenese und axonalen Anleitung1,2,3 beteiligt haben ,4,5. Netrin ist beispielsweise ein Ligand für axonalen Beratung bei Säugetieren und D. Melanogaster6,7,8erforderlich. Während Netrin von embryonalen Küken Gehirn Gewebe6ursprünglich isoliert war, haben nachfolgende Studien gezeigt, dass Netrin spielt eine erhaltene Rolle während der Entwicklung des embryonalen zentrale Nervensystem (ZNS) in Drosophila8. Andere Studien haben genetische Bildschirme in der embryonalen Drosophila CNS zum konservierten Liganden und Rezeptoren für Pathfinding in Drosophila und Wirbeltieren9erforderlichen identifizieren.
Während die embryonale Fliege CNS weitgehend in der Vergangenheit verwendet worden ist, um Liganden, Rezeptoren und intrazellulären Signalproteine axonalen Anleitung8,9gefordert zu identifizieren, hat die jüngsten Arbeiten die Wege in denen viele der untersucht. Diese Proteine Steuern Pathfinding Entscheidungen auch in späteren Phasen der Entwicklung. Insbesondere hat Untersuchung von Pilz Körper (MB) und Netzhaut Photorezeptor Neuron Entwicklung (Abbildung 1) Einblick in die Mechanismen dieser Kontrolle Wegfindung, Synapse Bildung, Axon beschneiden, und verschiedene andere Aspekte der neuronalen zur Verfügung gestellt Entwicklung10,11,12,13,14,15,16,17. Photorezeptor Neuronen verbinden die Fliege Netzhaut Regionen des erwachsenen Gehirns genannt der Lamina und Medulla und sind entscheidend für die Weiterleitung von visuellen Informationen an das Gehirn (rezensiert von18,19), während der Pilz Körper Neuronen sind zentral gelegen im Gehirn Fliege und sind erforderlich für lernen und Gedächtnis20,21. Photorezeptor Neuronen und die intrinsische Neuronen die Pilzkörper, Kenyon Zellen, genannt nutzen evolutionär konservierte diffusiblem und Kontakt-abhängige axonalen Anleitung Mechanismen um ihre postsynaptischen Ziele zu finden. Abgesehen davon, dass bei Erwachsenen fliegen, können Photorezeptor und MB Neuronen werden auch direkt in die Larven und Puppen mit Antikörpern oder Reporter Gene22,23,24,25visualisiert. Die Fähigkeit, leicht zu diesen beiden Gruppen von Neuronen zu unterschiedlichen Entwicklungsstörungen Zeitpunkten visualisieren hat ihre Verwendung als hervorragende Modelle für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung gefördert.
Neben dem Einsatz als Modell um zu verstehen, die Mechanismen der normalen Nervensystem Entwicklung, haben neuere Studien gezeigt, dass fliegen auch dazu als genaue Modelle für eine Vielzahl von menschlichen Krankheiten dienen können, einschließlich Fragile X Syndrom (FXS)26 , Geistige Behinderung (ID)27,28,29,30,31, und andere32. Beispielsweise um die molekulare Funktion des ZC3H14 zu untersuchen, ein Gen, das vor kurzem verbunden mit menschlicher geistiger Behinderung haben wir fliegen Modellcharakter für die ID mit einer null Allel der Fliege ZC3H14 Ortholog, genannt Nab230. Fliegen fehlt Nab2 haben schweren Gedächtnisstörungen und poly(A) Tails erweitert, Rekapitulation was wird beobachtet bei menschlichen Patienten oder Patienten abgeleitet Zelle Linien33,34. Wichtig ist, anzeigen fliegen fehlt Nab2 auch schwere Gehirn Morphologie Mängel in ihren Erwachsenen Pilzkörper34, ähnlich wie was beobachtet wird, in denen das FXS-Syndrom gen, 135fliegen. So können fliegen dienen als ein wichtiger Modellorganismus, normale Gehirnentwicklung und Krankheiten, die es stören zu studieren.
Schließlich machen die Zugänglichkeit von Hochdurchsatz-Methoden, Verhalten, kombiniert mit der Vielzahl der verfügbaren genetischen Tools überwachen Drosophila Modellorganismus der Wahl für die Ermittlung der Hirnregionen, die komplexe Verhaltensweisen, wie z. B. Steuern lernen und Gedächtnis, Schlaf, Balz, Durst und andere36,37,38,39. Ein besonders nützliches Werkzeug, das in der Mitte eine Fliege Genetiker "Toolbox" ist ist das GAL4/UAS-System (Abbildung 2). Dieses System40,41 verwendet Gewebe Konkretisierung der Gal4 transcriptional Aktivator, um den Ausdruck der Gene oder transgene flussabwärts von einer vorgelagerten Aktivierung Sequenz (UAS) zu erhöhen. Änderungen dieses Systems konnten Forscher, z. B. genau steuern, die Erregbarkeit der spezifische Neuronen42,43, Overexpress oder Knock-down spezifischen Genen Interesse44, 45, Echtzeit-Kalzium Dynamik in Vivo46zu analysieren und express Reporter Gene neuronale Linien41markieren. Die Kombination aus der GAL4/UAS-System mit mitotische Rekombination, die auch für die Erstellung der Mosaik-Analyse mit einem tragen Zelle Marker (MARCM) System12,47erlaubt. MARCM ist beträchtlich bei der Rückverfolgung der einzelnen Nervenzelle benutzt worden, um zellulären Signalisierung für axonalen Führung12,47benötigten Komponenten zu identifizieren. Obwohl diese und andere Techniken etliche wertvolle Erkenntnisse über die zellulären Mechanismen erforderlich für die Funktion des Nervensystems zur Verfügung gestellt haben, erfordern die meisten, dass Drosophila Gehirn zuerst zerlegt werden; schonende Entfernung des Gehirns ist erforderlich, um korrekte Gehirn Morphologie und Verbindung Muster zwischen Gehirnregionen zu behalten. Das folgende Protokoll verwendet Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen alsBeispiel neuronalen Populationen als es führt Sie durch die Zerlegung und immunofluorescent Färbung der Erwachsenen Drosophila Gehirne.

<table><tbody><tr><td>Mikrodissektionszange/Pinzette</td><td>Ted Pella</td><td>505-NM</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Schalen</td><td>Living Systems Instrumentierung</td><td>DD-50-S-BLK</td><td>Erhältlich bei amazon.com</td></tr><tr><td>Fas2</td><td>Antikörper-Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>1D4</td><td></td></tr><tr><td>Chaoptin</td><td>Antikörper-Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP Antikörper</td><td>Aves Labor</td><td>GFP-1010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 Ziegen-Anti-Hühner-Sekundärantikörper</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>20% Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskop Dienstleistungen</td><td>RT15713</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Objektträger</td><td>ThermoFisher</td><td>99-910-01</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>ThermoFisher</td><td>12-553-454</td><td></td></tr><tr><td>Na Phosphatpuffer einbasig</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Na Phosphatpuffer zweibasig</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Fingernagellack</td><td>Elektronenmikroskop Dienstleistungen (EMS)</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica S6D mit KL300 LED-Lichtquelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9-Well-Schüssel (Spotplatte)</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>Nutator/Wippe</td><td>Fisher</td><td>22-363-152 oder 88-861-041</td><td></td></tr><tr><td>35-mm-Schüssel</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Fisher</td><td>50-366-794</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Potentielle Fixierungspuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTN Puffer</td><td></td><td></td><td>0,1 M Naphosphat, pH 7,2, 0,1 % Triton-X-100, bilden typischerweise 0,5 l 0,1 M NaPhosphat-Puffer und aliraten jeweils 50 ml</td></tr><tr><td>PLP-Puffer</td><td></td><td></td><td>2 % Paraformaldehyd, 0,01 M NaI04, 0,075 M Lysin, 0,037 M NaPO4, pH 7,2, 0,36 g Lysin in 10 ml H2O + 7,5 ml 0,1 M NaH2PO4 pH 7,2 + 2,5 ml 0,1 M Na2HPO4 auf Eis. Mischen Sie unmittelbar vor Gebrauch 15 ml dieser gepufferten Lysinlösung mit 50 mg NaIO4 (Natriumperiodat) + 2 ml des 20% hochwertigen Paraformaldehyds (EMS) + 3ml H2O</td></tr><tr><td>PEM-Puffer</td><td></td><td></td><td>0,1M PIPES pH 7,0, 2mM MgS04, 1mM EGTA, Dieser Puffer kann bequem als 2x Stamm hergestellt und mit 8% Paraformaldehyd (PFA) verdünnt werden, um eine Endkonzentration von 4% PFA</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td> zu erhalten><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Fly Lagerbestände erhältlich bei Bloomington</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elav (c155)-GAL4</td><td></td><td>BL458</td><td>Pan-neuronaler GAL4-Treiber</td></tr><tr><td>mit *;;; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 854</td><td>GAL4-Treiber für alle Pilzkörper-Neuronen (OK107-GAL4-Insertion erfolgt auf dem 4. Chromosom)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td><td></td><td>BL 7362</td><td>GAL4-Treiber für Alpha- und Beta-Lappen (auf 2. Chromosom)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64305</td><td>GAL4-Treiber für Alpha- und Beta-Lappen, enthält auch UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*; 201Y-GAL4</td><td></td><td>BL 4440</td><td>GAL4-Treiber für primär die Gamma-Lappen des Pilzkörpers (auf dem 2. Chromosom)</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64296</td><td>GAL4-Treiber für Pilzkörper-Gamma-Lappen, enthält auch UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub>Gal80/CyO</td><td></td><td>BL 5145</td><td>MARCM-Stamm, enthält FRT-Stelle und GAL80 auf dem 2. Chromosom</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL5146</td><td>MARCM-Stamm, enthält hsFLP, panneuronales GAL4 und CD8-GFP auf</td></tr><tr><td>X-Chromosom y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;; FRT82B, Tub>GAL80/TM3, Sb(1); OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44408</td><td>MARCM Schaft zum Umdrehen des 3. Chromosoms</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; FRT40A, Wanne>GAL80; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL44406</td><td>MARCM Schaft zum Wechseln des 2. Chromosoms</td></tr><tr><td>w*, hsFLP, tub>GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO; OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44407</td><td>MARCM Schaft zum Drehen des X-Chromosoms</td></tr><tr><td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td><td></td><td>BL 5137</td><td>GFP markiert die Zelloberfläche (CD8 ist ein Transmembranprotein)</td></tr><tr><td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 5139</td><td>MARCM-Schaft, enthält FRT-Stelle und CD8-GFP auf dem 2. Chromosom</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td><td></td><td>BL 28832</td><td>MARCM Stamm, enthält hsFLP und CD8-GFP auf dem X-Chromosom</td></tr><tr><td>w*; FRTG13, Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5140</td><td>MARCM Stamm, enthält FRT-Stelle und GAL80 auf dem 2. Chromosom</td></tr><tr><td>y(1), w*;; FRT82B, Tub>GAL80</td><td></td><td>BL 5135</td><td>MARCM Stamm, enthält FRT-Stelle und GAL80 auf dem 3. Chromosom</td></tr></tbody></table>

dissektion, immunofluorescent färbung der pilz körper und photorezeptor neuronen im gehirn erwachsener taufliege melanogaster

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervensystem-Entwicklung beinhaltet eine sequenzielle Serie von Ereignissen, die durch mehrere Signalwege und Regulationsnetzwerke koordiniert werden. Viele von den Proteinen, die in diesen Bahnen sind evolutionär konserviert zwischen Säugetieren und anderen Eukaryoten, wie der Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, was darauf hindeutet, dass ähnliche organisierende Grundregeln bei der Entwicklung dieser vorhanden Organismen. Wichtig ist, wurde Drosophila ausgiebig zur zelluläre und molekulare Mechanismen, die Regulierung der Prozesse, die erforderlich sind, bei Säugetieren einschließlich Neurogenese, Differenzierung, axonalen Beratung und Synaptogenese zu identifizieren. Fliegen haben auch erfolgreich eingesetzt, um eine Vielzahl von menschlichen Neurodevelopmental Krankheiten zu modellieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die schrittweise Mikrodissektion, Fixierung und immunofluorescent Lokalisierung von Proteinen im erwachsenen Gehirn Drosophila . Dieses Protokoll konzentriert sich auf zwei Beispiel neuronalen Populationen, Pilz Körper Neuronen und retinalen Photorezeptoren und beinhaltet optionale Schritte zu einzelnen Pilz Körper Neuronen mit Mosaik-Analyse mit einer tragen Zelle Marker (MARCM) Technik zu verfolgen. Beispieldaten aus Wildtyp und Mutanten Gehirne sind mit einer kurzen Beschreibung der Bewertungskriterien für axonalen Anleitung Mängel gezeigt. Während dieses Protokoll zwei etablierte Antikörper zeigt für die Untersuchung der Morphologie der Pilze Körper und Photorezeptor Neuronen, andere Hirnregionen Drosophila und die Lokalisierung der Proteine in anderen Hirnregionen können auch mit Hilfe dieses Protokolls untersucht.

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls zur Drosophila-Gehirndissektion besteht darin, intakte Gehirne aus adulten Fliegen zu gewinnen, die für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden können, wie beispielsweise Immunfluoreszenz, Lokalisierung von mit GFP markierten Proteinen und Ex-vivo-Kultivierungsexperimente. Diese Methode kann uns helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Entwicklungsbiologie und Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise die Rolle spezifischer Proteine und Signalwege sowie die Aufklärung von Mustern der neuronalen Vernetzung während der Gehirnentwicklung. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie nach Beherrschung eine schnelle und effektive Methode bietet, um morphologische Defekte in bestimmten Regionen des adulten Gehirns immunologisch nachzuweisen.Dieses Verfahren kann schwierig zu erlernen sein, da das Entfernen des Exoskeletts aus dem Fliegenkopf viel Sorgfalt und Übung erfordert. Ihre Bewegungen müssen langsam und gezielt erfolgen, und die Arme des Präparators müssen gut abgestützt sein, um ruhig zu bleiben. Es ist ratsam, zunächst an rotäugigen Fliegen und anschließend an weißäugigen Fliegen zu üben, bevor Sie tatsächlich Genotypen von Interesse für echte Experimente präparieren.Um die Dissektion vorzubereiten, stellen Sie die betäubten Fliegen auf eine kalte Metallplatte oder in eine Petrischale, die auf Eis steht. Alternativ verwenden Sie eine Fliegenhalteplatte, die Kohlendioxid abgibt. Anschließend geben Sie eine kleine Menge PTN in die Mitte der Dissektionschale, um eine PTN-Blase zu erzeugen.Danach füllen Sie unter einem Stereomikroskop bei gleichmäßiger Beleuchtung das Sichtfeld mit der PTN-Blase. Bringen Sie die Fliegen nun so in Position, dass sie auf dem Rücken liegen, und übertragen Sie eine einzelne Fliege durch das Abdomen in die PTN. Tauchen Sie das Tier vollständig in die PTN ein und führen Sie die gesamte Präparation unter Flüssigkeit in der PTN durch.Greifen Sie mit einem zweiten Paar Pinzetten den Rüssel und ziehen Sie den Kopf vom Körper ab. Gelegentlich wird der Rüssel entfernt, während der Kopf am Körper verbleibt. In diesem Fall fassen Sie den mittleren Rand einer Retina und wenden seitliche Kraft an, um den Kopf zu entfernen.Entfernen Sie Abdomen und Thorax. In diesem Schritt ist es entscheidend, den Kopf im PTN zu belassen. Verbindungen vom zentralen Gehirn zur ventralen Nervenbahn (VNC) können mit dieser Methode nicht analysiert werden.Fassen Sie anschließend den medialen Rand der linken Netzhaut am Rand des zentralen Lochs in der Cuticula und ziehen Sie die Pinzetten langsam direkt voneinander weg, um ein Einreißen des Opticlobus zu verhindern, der durch eine weiße, faserige Trachea bedeckt ist. Wenn sich die Netzhaut löst, wird die Spannung leicht nachlassen. Um ein Einreißen des Gehirns zu vermeiden, ist es entscheidend wichtig, den medialen Rand jedes Auges zu fassen und die Pinzetten äußerst langsam auseinanderzuziehen.Zu schnelles Vorgehen kann zu veränderter Gehirnmorphologie oder Schädigungen des Gehirngewebes führen. Wie hier gezeigt, ergreifen Sie die Cuticula mit jedem Paar von Pinzetten und ziehen Sie sehr langsam in entgegengesetzte Richtungen. Wird dies korrekt ausgeführt, sollte sich die Cuticula vom Gehirngewebe lösen, wobei das Gehirn intakt bleibt.Sehr scharfe Pinzetten sind für diesen Schritt erforderlich. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die umgebende Cuticula Stück für Stück. Beim Entfernen stark haftender Cuticula-Teile kann es helfen, das Gehirn zu sichern, indem man den verbleibenden ventralen Nervenstrang greift, um eine Beschädigung des Gehirns zu vermeiden.Verwenden Sie abschließend eine P200-Pipette, um die präparierten Gehirne in eine Vertiefung einer Platte mit PTN zur Fixierung und Immunfärbung zu überführen. Überführen Sie unter dem Mikroskop mit einer P200-Pipette 10 bis 15 präparierte Gehirne desselben Genotyps in ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 4 % Paraformaldehyd in PTN verdünnt ist. Inkubieren Sie die Gehirne anschließend 20 Minuten lang bei langsamer Schüttelbewegung bei Raumtemperatur.Nach der Fixierung das Absetzen der Gehirne auf den Boden des Röhrchens ermöglichen und anschließend das Fixierungsmittel entfernen. Danach zwei schnelle Waschschritte mit jeweils 500 µL PTN durchführen. Das PTN austauschen, sobald sich die Gehirne im Röhrchen abgesetzt haben.Anschließend dreimalige lange Waschungen mit PTN unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur durchführen. Nach diesen Waschungen können die Gehirne über Nacht bei vier Grad Celsius in PTN aufbewahrt werden. Nach dem Entfernen der letzten PTN-Waschung die Gehirne in 0,5 Milliliter Blockierungslösung für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur und unter leichtem Schütteln inkubieren.Nach dem Entfernen der Blockierungslösung die primären Antikörper in Blockierungslösung verdünnt hinzufügen und die Gehirne bei vier Grad Celsius zwei Tage unter leichtem Schütteln inkubieren. Den primären Antikörper mithilfe des Fünfwaschschritts mit PTN-Puffer entfernen. Anschließend die sekundären Antikörper auftragen.Lassen Sie diese Antikörper drei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Lichtabschirmung und mit Schwenkbewegung mit den Geweben inkubieren. Nach der Inkubation der Gehirne in der Sekundärantikörper-Lösung wenden Sie die PTN-Waschpufferung an. Bedecken Sie die Proben nach jedem Waschgang mit Aluminiumfolie und schließen Sie den Vorgang mit dem vollständigen Entfernen des Puffers ab.Fügen Sie anschließend 75 Mikroliter fluoreszierendes Anti-Fade-Montagemedium hinzu und pipettieren Sie die Gehirne und das Medium ein einziges Mal hinein und hinaus. Das Röhrchen kann dann mit Aluminiumfolie umwickelt und mehrere Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden, idealerweise sollte jedoch direkt mit der Montage fortgefahren werden. Um die Gehirne zu montieren, stellen Sie eine Brückenpräparation her.Platzieren Sie zwei Basis-Deckgläser in einem Abstand von etwa einem Zentimeter auf einem positiv geladenen Objektträger. Achten Sie darauf, dass die positiv geladene Seite nach oben zeigt. Befestigen Sie die Deckgläser anschließend mit Nagellack am Objektträger und lassen Sie den Lack vollständig trocknen, bevor Sie fortfahren.Als Nächstes platzieren Sie den Objektträger unter ein Stereomikroskop und pipettieren Sie die Gehirne zusammen mit dem Medium in den Raum zwischen den Deckgläsern. Achten Sie darauf, die Beleuchtung so einzustellen, dass die Sichtbarkeit der Gehirne verbessert wird. Danach saugen Sie die überschüssigen Montagemedien vorsichtig vom Objektträger ab, wobei Sie die Gehirne unberührt lassen müssen.Danach überschüssiges Einbettungsmedium durch Abwischen entfernen. Dadurch können die Gehirne präziser positioniert werden. Nun die Gehirne mit einer Pinzette in einem Gittermuster ausrichten, wobei ihre Antennallappen nach oben zeigen.Dann legen Sie einen Deckgläser über die Gehirne und versiegeln Sie die Kanten des oberen Deckglases, die mit den Basisdeckgläsern verbunden sind, mit Nagellack. Füllen Sie nun den mittleren Hohlraum tropfenweise mit frischem Einbettmedium, wobei das Medium durch Kapillarwirkung unter das Deckglas gezogen wird. Wenn der Hohlraum vollständig gefüllt ist, verschließen Sie ihn vollständig mit klarem Nagellack.Die beschriebene Methode kann verwendet werden, um nahezu jede Struktur im erwachsenen Gehirn sichtbar zu machen, einschließlich der Pilzkörper. Dieser Bereich des Gehirns ist für Lernen und Gedächtnis erforderlich. Die Pilzkörper können mithilfe von Antikörpern, die das Faszikulin-2-Protein erkennen, leicht sichtbar gemacht werden.Dieses Protein wird stark in den Alpha- und Beta-Lappen sowie im zentral gelegenen ellipsoiden Körper exprimiert. Diese Technik ermöglichte die Identifizierung mehrerer zellulärer Prozesse, die für die korrekte Axonführung der Neuronen des Pilzkörpers erforderlich sind. Die Störung dieser Prozesse führt zu einer Vielzahl unterschiedlicher mutanter Phänotypen, wie beispielsweise unangemessene Axonprojektionen über die mittlere Hirnregion hinweg und fehlende Alpha-Lappen.Diese mutantenbedingten Phänotypen zeigen oft eine unvollständige Penetranz und erfordern daher die Untersuchung mehrerer Gehirne. Um die autonome Rolle eines Proteins bei der Axonwegfindung zu untersuchen, kann die Markham-Technik ebenfalls verwendet werden, um die Wegfindungsentscheidungen einzelner GFP-positiver mutanter oder wildtypischer Neuronen in einem nicht-fluoreszierenden Wildtyp-Hintergrund sichtbar zu machen. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die zuverlässige und reproduzierbare Visualisierung nahezu jedes Bereichs des adulten Drosophila-Gehirns.Hier konzentrierten wir uns auf die Neuronen des Pilzkörpers. In der Textversion dieses Protokolls haben wir außerdem die Visualisierung der Optischen Lappen demonstriert. Andere Studien haben ähnliche Techniken verwendet, um die Pars intercerebralis, Uhr-Neuronen und Projektionsneuronen des Antennallobus sowie viele andere Strukturen sichtbar zu machen.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann jedes Gehirn in 3 bis 5 Minuten präpariert werden, sofern es ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Arme in der Nähe des Mikroskops zu stabilisieren. Ebenso wichtig ist es, langsam vorzugehen und jeweils kleine Stücke der Cuticula einzeln zu entfernen.Zu schnelles Vorgehen könnte unerwünschte Schäden am darunterliegenden Hirngewebe verursachen. Neben der Verwendung von präparierten Gehirnen für mikroskopische Untersuchungen auf Basis der Immunfluoreszenz kann Hirngewebe auch für weitere Experimente genutzt werden.

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Artikel werden wir zeigen, wie das zentrale Nervensystem aus dritten Larvenstadium Drosophila-Larven zu sezieren.

Dissection der Larven ZNS von Drosophila melanogaster

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

Dissektion und Immunhistochemie von Larven, Puppen und Erwachsenenbildung<em&gt; Drosophila</em&gt; Netzhäute

Dieses Video beschreibt eine Methode, um intakte Gehirne von erwachsenen Fliegen unter eine Brückenrutsche zu montieren und zeigt das Protokoll, das an immungefärbten Gehirnen für die Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt wurde.

Montage von adulten Drosophila-Gehirnen: Eine Methode zur Vorbereitung von Objektträgern für die konfokale Bildgebung

Dieses Video beschreibt, wie man das erwachsene Drosophila-Gehirn präpariert und isoliert – ein Verfahren, das notwendig ist, um das Organ sichtbar zu machen, das sonst von der Nagelhaut, dem Auge und dem Luftröhrengewebe verdeckt wird. Das Beispielprotokoll zeigt eine detaillierte Demonstration, die zu hochwertigen Präparaten führt, die für Immunfärbungen und bildgebende Verfahren in der Neurobiologie von Drosophila verwendet werden können.

Drosophila Dissektion des Gehirns von Erwachsenen: Eine Methode der Fliegenneurobiologie

Dieses Video zeigt ein detailliertes Immunfärbeprotokoll zur Visualisierung phänotypischer Defekte in den Pilzkörpern mutierter Drosophila-Gehirne. Das Protokoll beinhaltet die Verwendung von Antikörpern gegen Fas2, ein Protein, das an der axonalen Führung beteiligt ist und die richtige morphologische und funktionelle Entwicklung des Pilzkörpers erleichtert.

Visualisierung von Pilzkörperneuronen in Drosophila-Gehirnen durch Immunfärbung

Die adulten Strukturen von Drosophila stammen von sackartigen Strukturen ab, die imaginale Scheiben genannt werden. Die Analyse dieser Scheiben bietet Einblicke in viele Entwicklungsprozesse, einschließlich der Gewebebestimmung, der Etablierung von Kompartimentgrenzen, der Zellproliferation, der Spezifikation des Zellschicksals und der planaren Zellpolarität. Dieses Protokoll wird verwendet, um imaginale Scheiben für die Licht-/Fluoreszenzmikroskopie vorzubereiten.

Präparation und Immunfärbung von Imaginalscheiben aus Drosophila melanogaster

Der erwachsene Drosophila Gehirn ist ein wertvolles System zur Untersuchung der neuronalen Schaltkreise, höhere Hirnfunktionen und komplexe Erkrankungen. Eine effiziente Methode ganze Hirngewebe von der kleinen Fliegenkopf zu sezieren werden Gehirn basierte Studien erleichtern. Hier beschreiben wir eine einfache, one-step-Dissektion Protokoll von erwachsenen Gehirn mit gut erhaltenen Morphologie.

Eine einfache Ein-Schritt-Dissection-Protokoll für Whole-mount Vorbereitung von Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

Hier stellen wir Protokolle zur Verfügung, um drei einfache verletzungsinduzierte Axondegeneration (Axontod) Assays in Drosophila melanogaster durchzuführen, um die morphologische und funktionelle Konservierung von abgetrennten Axonen und ihren Synapsen zu bewerten.

Morphologische und funktionelle Bewertung von Axonen und ihren Synapsen während des Axon-Todes bei Drosophila melanogaster

Dieses Protokoll beschreibt drei Schritte zur Vorbereitung von Larven und adulten Drosophila-Sehlappen für die Bildgebung: 1) Dissektion des Gehirns, 2) Immunhistochemie und 3) Montage. Der Schwerpunkt liegt auf Schritt 3, da unterschiedliche Montageausrichtungen erforderlich sind, um spezifische Optikkeulenstrukturen sichtbar zu machen.

Dissektion, Immunhistochemie und Montage von Larven und adulten Drosophila-Gehirnen zur Visualisierung des Sehlappens

Diese Studie stellt ein vereinfachtes Protokoll für die Gewebeaufbereitung vor, das Enthauptung, Fixierung, Kryosektion, Fluoreszenzfärbung, Immunfärbung und Bildgebung umfasst und auf konfokale und Multiphotonen-Bildgebung erweitert werden kann. Die Methode behält eine Wirksamkeit bei, die mit komplexen Dissektionen vergleichbar ist, ohne dass fortgeschrittene motorische Fähigkeiten erforderlich sind. Die quantitative Bildanalyse bietet ein umfangreiches Untersuchungspotenzial.

Direkte Kryosektion von Drosophila-Köpfen zur verbesserten Fluoreszenzfärbung und Immunfärbung des Gehirns

Lernen Sie die Präparation und Immunfärbung erwachsener Drosophila melanogaster-Gehirne zur Untersuchung von Pilzkörper- und Photorezeptorneuronen. Diese Methode ermöglicht die Analyse neuronaler Entwicklung und Konnektivität.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Weitere Videos entdecken