Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Das übergeordnete Ziel dieses Drosophila-Gehirndissektionsprotokolls ist es, intakte Gehirne von erwachsenen Fliegen zu gewinnen, die in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden können, wie z. B. Immunfluoreszenz, GFP-markierte Proteinlokalisierung und Ex-vivo-Kultivierungsexperimente. Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen Entwicklungsbiologie und Neurowissenschaften zu beantworten, wie z.B. die Rolle spezifischer Proteine und Signalwege und die Etablierung von Mustern der neuronalen Konnektivität während der Gehirnentwicklung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie, sobald sie beherrscht ist, eine schnelle und effektive Methode zur immunologischen Identifizierung morphologischer Defekte in bestimmten Regionen des erwachsenen Gehirns bietet.

Dieses Verfahren kann schwer zu erlernen sein, da das Entfernen des Exoskeletts vom Fliegenkopf viel Sorgfalt und Übung erfordern kann. Deine Bewegungen müssen langsam und überlegt sein, und die Arme des Dissektors müssen gut gestützt werden, um ruhig zu bleiben. Es ist eine gute Idee, an rotäugigen Fliegen und dann an weißäugigen Fliegen zu üben, bevor man tatsächlich Genotypen seziert, die für tatsächliche Experimente von Interesse sind.

Um sich für die Dissektion vorzubereiten, legen Sie die betäubten Fliegen auf ein kaltes Metallpolster oder in eine Petrischale, die auf Eis sitzt. Alternativ kannst du ein Fliegenpad verwenden, das Kohlendioxid ausstößt. Geben Sie als Nächstes eine kleine Menge PTN in die Mitte der Sezierschale, um eine Blase aus PTN zu erzeugen.

Füllen Sie dann unter einem Stereomikroskop das Sichtfeld mit der PTN-Blase bei gleichmäßiger Beleuchtung. Manipuliere nun die Fliegen so, dass sie mit dem Bauch nach oben liegen, und übertrage eine Fliegen am Bauch in das PTN. Tauchen Sie das Tier vollständig in das PTN ein und führen Sie die gesamte Dissektion in PTN durch.

Fassen Sie mit einer zweiten Pinzette den Rüssel und ziehen Sie den Kopf vom Körper ab. Gelegentlich wird der Rüssel entfernt, aber der Kopf bleibt am Körper befestigt. In diesem Fall greifen Sie den medialen Rand einer Netzhaut und üben Sie seitliche Kraft aus, um den Kopf zu entfernen.

Entsorgen Sie den Bauch und den Brustkorb. Es ist wichtig, den Kopf während dieses Schritts im PTN zu halten. Verbindungen vom Zentralhirn zu VNC lassen sich mit dieser Methode eindeutig nicht analysieren.

Fassen Sie als Nächstes den medialen Rand der linken Netzhaut am Rand des zentralen Lochs in der Kutikula und ziehen Sie die Pinzette langsam direkt voneinander auseinander, um ein Reißen des Sehlappens zu verhindern, der die undurchsichtige Struktur ist, die von der weißen, fadenförmigen Luftröhre bedeckt ist. Wenn sich die Netzhaut dissoziiert, nimmt die Spannung leicht ab. Um zu verhindern, dass das Gehirn reißt, ist es von entscheidender Bedeutung, den medialen Rand jedes Auges zu greifen und die Pinzette sehr langsam auseinander zu ziehen.

Zu schnelles Handeln kann zu einer veränderten Gehirnmorphologie oder einer Schädigung des Hirngewebes führen. Wie hier gezeigt, fassen Sie die Nagelhaut mit jeder Pinzette und ziehen Sie sie ganz langsam in entgegengesetzte Richtungen. Wenn es richtig gemacht wird, sollte sich die Nagelhaut vom Hirngewebe trennen und das Gehirn intakt lassen.

Für diesen Schritt ist eine sehr scharfe Pinzette erforderlich. Anschließend entfernst du vorsichtig die umliegende Nagelhaut Stück für Stück. Bei der Entfernung hartnäckig anhaftender Nagelhaut kann es helfen, das Gehirn zu sichern, indem es das verbleibende VNC greift, um eine Quetschung des Gehirns zu vermeiden.

Zum Schluss wird die präparierten Gehirne mit einer P200-Pipette zur Fixierung und Immunfärbung in eine mit PTN gefüllte Vertiefung einer mit PTN gefüllten Platte überführt. Verwenden Sie unter dem Mikroskop eine P200-Pipette, um 10 bis 15 präparierte Gehirne desselben Genotyps in ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu übertragen, das mit 4 % Paraformaldehyd gefüllt ist, das in PTN verdünnt ist. Inkubieren Sie dann das Gehirn 20 Minuten lang unter langsamem Schaukeln bei Raumtemperatur.

Lassen Sie das Gehirn nach der Fixierung am Boden des Röhrchens absetzen und entfernen Sie dann das Fixiermittel. Führen Sie anschließend zwei Schnellwäschen mit 500 Mikrolitern PTN pro Waschgang durch. Tauschen Sie das PTN aus, sobald sich das Gehirn in der Röhre eingenistet hat.

Führen Sie anschließend drei lange Wäschen mit PTN unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur durch. Nach diesen Waschungen kann das Gehirn über Nacht bei vier Grad Celsius in PTN gelagert werden. Nach dem Entfernen der letzten PTN-Wäsche inkubieren Sie das Gehirn mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und unter leichtem Rühren in 0,5 Millilitern Blocklösung.

Nach dem Entfernen der Blockierungslösung fügen Sie die in Blockierungslösung verdünnten Primärantikörper hinzu und inkubieren Sie das Gehirn zwei Tage lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren. Entfernen Sie den primären Antikörper mit dem PTN-Waschregiment mit fünf Wäschen. Und dann tragen Sie die Sekundärantikörper auf.

Lassen Sie diese Antikörper drei Stunden lang bei Raumtemperatur mit dem Gewebe inkubieren, während Sie durch Schaukeln vor Licht geschützt sind. Nach dem Inkubieren des Gehirns in der Sekundärantikörperlösung wenden Sie das PTN-Waschregiment an. Decken Sie die Proben nach jedem Waschen mit Folie ab und entfernen Sie abschließend so viel Puffer wie möglich.

Fügen Sie als Nächstes 75 Mikroliter fluoreszierendes Eindeckmedium hinzu und lassen Sie das Gehirn und das Medium nur einmal in die Pipettenspitze hinein und wieder heraus. Das Rohr kann dann in Folie eingewickelt und mehrere Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden, im Idealfall geht es direkt mit der Montage weiter. Um das Gehirn zu besteigen, baue eine Brückenrutsche.

Positionieren Sie zwei Basisabdeckfolien im Abstand von etwa 1 Zentimeter auf einer positiv geladenen Rutsche. Stellen Sie sicher, dass die positiv geladene Seite nach oben zeigt. Kleben Sie dann die Deckgläser mit Fingernagellack auf die Folie und lassen Sie den Lack vollständig trocknen, bevor Sie fortfahren.

Legen Sie dann den Objektträger unter ein Stereomikroskop und pipettieren Sie Gehirn und Medium in den Raum zwischen den Deckgläsern. Achten Sie darauf, die Beleuchtung anzupassen, um die Visualisierung des Gehirns zu verbessern. Saugen Sie als Nächstes das zusätzliche Einbettmedium von der Rutsche ab und achten Sie darauf, das Gehirn zu vermeiden.

Entfernen Sie dann die restlichen überschüssigen Einbettmedien. Dadurch können die Gehirne präziser positioniert werden. Richten Sie nun die Gehirne mit einer Pinzette in einem Gittermuster aus, wobei die Antennenlappen nach oben zeigen.

Lege dann einen Deckzettel über das Gehirn und versiegele mit Fingernagellack die Kanten des oberen Deckglases, die an den Basisabdeckfolien befestigt sind. Beladen Sie nun den mittleren Hohlraum tropfenweise mit frischem Einbettmedium, so dass das Medium durch Kapillarwirkung unter den Deckglas gezogen werden kann. Wenn der Hohlraum gefüllt ist, versiegeln Sie ihn vollständig mit klarem Fingernagellack.

Mit der beschriebenen Methode können nahezu alle Strukturen im erwachsenen Gehirn, einschließlich der Pilzkörper, sichtbar gemacht werden. Diese Region des Gehirns wird für das Lernen und das Gedächtnis benötigt. Die Pilzkörper können mit Antikörpern, die das Protein Fasciculin 2 erkennen, leicht sichtbar gemacht werden.

Dieses Protein wird in den Alpha- und Beta-Lappen sowie im zentral gelegenen Ellipsoidkörper stark exprimiert. Diese Technik hat die Identifizierung mehrerer zellulärer Prozesse ermöglicht, die für die korrekte Axonführung von Pilzkörperneuronen erforderlich sind. Eine Störung dieser Prozesse führt zu einer Vielzahl von mutierten Phänotypen, wie z. B. einer unangemessenen Axonprojektion über die Mittellinienregion des Gehirns und fehlenden Alpha-Lappen.

Diese mutierten Phänotypen sind oft unvollständig penetrant und erfordern daher die Untersuchung mehrerer Gehirne. Um die autonome Rolle eines Proteins bei der Axon-Wegfindung zu untersuchen, kann die Markham-Technik auch verwendet werden, um Axonführungsentscheidungen einzelner GFP-positiver Mutanten oder Wildtyp-Neuronen in einem nicht-fluoreszierenden Wildtyp-Hintergrund zu visualisieren. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die zuverlässige und reproduzierbare Visualisierung virtueller Regionen des adulten Drosophila-Gehirns.

Hier konzentrierten wir uns auf die Neuronen des Pilzkörpers. In der Textversion dieses Protokolls haben wir auch die Visualisierung der Sehlappen demonstriert. Andere Studien haben ähnliche Techniken verwendet, um unter anderem die Pars intercerebralis, die Uhrenneuronen und die Projektionsneuronen des Antennenlappens zu visualisieren.

Einmal gemeistert, kann jedes Gehirn in 3 bis 5 Minuten seziert werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Ihre Arme in der Nähe des Mikroskops zu stabilisieren. Es ist auch wichtig, sich langsam zu bewegen und kleine Stücke der Nagelhaut nacheinander zu entfernen.

Zu schnelles Handeln kann zu unerwünschten Schäden am darunter liegenden Hirngewebe führen. Neben der Verwendung von präparierten Gehirnen für Immunfluoreszenz-basierte Mikroskopie-Experimente kann Hirngewebe auch für zusätzliche Experimente verwendet werden.