Flow Cytometry-based Drug Screening-System für die Identifizierung von kleinen Molekülen, die zelluläre Differenzierung von Stammzellen Glioblastom zu fördern

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, kleine Molekülbibliotheken auf Wirkstoffe zu untersuchen, die die astrogliale Differenzierung in Glioblastom-Stammzellen fördern. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Krebsstammzellen zu beantworten, z. B. welche Signalwege erforderlich sind, um Glioblastom-Stammzellen im undifferenzierten Zustand zu halten. Die korrekte Ausführung dieser Technik ermöglicht die einfache Identifizierung kleiner Moleküle, die die Differenzierung von Glioblastom-Stammzellen fördern.

Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auch auf die Therapie des Ehlers-Danlos-Glioblastoms, da die Verringerung des Anteils an Glioblastom-Stammzellen die Wahrscheinlichkeit eines erneuten Auftretens verringern kann. Diese Methode kann auch angewendet werden, um die Differenzierung in andere Zelllinien unter Verwendung anderer Reporterkonstrukte zu setzen. Unser Bericht ist der erste, der einen Hochdurchsatzansatz für das Screening nach Wirkstoffen etabliert, die Gliom-Stammzellen zur Differenzierung zwingen.

Die Arbeit mit Lentivirus-Partikeln in Krebszellen, die von Patienten stammen, kann äußerst gefährlich sein. Daher sollte immer das Standardverfahren für die Arbeit mit durch Blut übertragbaren Krankheitserregern befolgt werden. Säen Sie zunächst eine Million Glioblastom-Stammzellen oder GSCs in zwei Millilitern vollständigem neuronalen Stammzell-Wachstumsmedium in einer Sechs-Well-Platte.

Als nächstes transduzieren Sie die Zellen mit dem Lentivirus-Reporter bei einer Infektionsvielfalt von gleich fünf. Fügen Sie dem Zell- und Virusgemisch zwei Mikroliter Polybren hinzu, so dass die Endkonzentration acht Mikrogramm pro Milliliter beträgt, und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Tauschen Sie nach der Inkubation das Wachstumsmedium aus, um das ungebundene Virus zu entfernen.

Und zentrifugieren Sie Zellen fünf Minuten lang bei 360-fachem G. Anschließend werden die Medium- und Plattenzellen vorsichtig in einer Sechs-Well-Platte zurückgesaugt. Und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang.

Ernten Sie 0,5 Milliliter des gesamten Kulturvolumens. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 360 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 Millilitern frischem Wachstumsmedium für neurale Stammzellen.

Stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator, um eine Ausdehnung für mindestens 72 Stunden zu ermöglichen. Fügen Sie 200 Mikroliter Dissoziationsreagenz hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie sanft auf und ab pipettieren.

Zu den dissoziierten Zellen fügen Sie 800 Mikroliter HBSS hinzu, um eine minimale Zellanheftung oder -aggregation zu gewährleisten. Übertragen Sie anschließend 200 Mikroliter jeder Zellsuspension in Vertiefungen mit einer 96-Multiwell-Platte. Bestimmen Sie den Prozentsatz der Zellen, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, durch Durchflusszytometrie.

Erfassen Sie bei jeder Aufnahme mindestens 10.000 lebensfähige Zellen. In allen durchflusszytometrischen Analysen werden nicht transduzierte Elternzellen oder vektortransduzierte nicht fluoreszierende Zellen verwendet, um die Ausgangsfluoreszenz zu ermitteln. Zur Selektion und Erweiterung einzelner Subklone säen Sie Zellen mit einer Dichte von 0,7 Zellen pro Vertiefung in 100 Mikrolitern neuralem Stammzellmedium in einer 96-Well-Platte.

Bewahren Sie diese Klone 11 Tage lang in Kultur auf. Achten Sie auf Neurosphären mit einem Durchmesser von mehr als 100 Mikrometern. Wir haben diese Cutoff-Größe bereits festgelegt, um retrospektiv festzustellen, ob die Neuorsphäre von einer sich selbst erneuernden Glioblastom-Stammzelle stammt.

Diese Cutoff-Größe muss möglicherweise optimiert werden, wenn mit verschiedenen Glioblastom-Zellmodellen gearbeitet wird. Beobachten Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem FITC-Filter ausgestattet ist, und markieren Sie Vertiefungen, die eine einzelne Neurosphäre enthalten, in der etwa 1 % bis 5 % der Zellen GFP-positiv sind. Nach der Markierung expandieren Sie einzelne Klone, bis eine ausreichende Anzahl von Zellen für die durchflusszytometrische Analyse zur Verfügung steht.

Unter der Annahme, dass die Reporterklone 1 % bis 5 % GFP-positive Zellen enthalten, ernten Sie 0,5 Milliliter von jedem Klon zusammen mit der gleichen Menge an nicht transduzierten Kontrollzellen, um den genauen Prozentsatz der GFP-positiven Zellen zu bestimmen. Nach dem Pelletieren der Zellen bei 360-fachem G für fünf Minuten bei Raumtemperatur wird der Überstand abgesaugt. Geben Sie 200 Mikroliter Dissoziationsreagenz zu jedem Pellet und inkubieren Sie die Röhrchen in einem auf 37 Grad Celsius eingestellten Wasserbad.

Nach der Inkubation zerreiben Sie die Zellen etwa 20 bis 30 Mal, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Fügen Sie dann 800 Mikroliter HBSS hinzu, um eine minimale Zellanheftung oder -aggregation zu gewährleisten. Übertragen Sie nun 200 Mikroliter jeder Zellsuspension in Vertiefungen einer 96-Multiwell-Platte.

Führen Sie abschließend eine Durchflusszytometrie durch, bei der bei jeder Aufnahme mindestens 10.000 lebensfähige Zellen aufgezeichnet werden. Um die klonogene Kapazität zu beurteilen, bereiten Sie Einzelzellsuspensionen von Differenzierungsreporter-Subklonen her, indem Sie die Zellen etwa 20 bis 30 Mal verreiben. Dann werden diese Zellen in 100 Mikroliter vollständiges Wachstumsmedium für neurale Stammzellen mit einer Dichte von etwa fünf bis 500 Zellen pro Vertiefung in 96-Multiwell-Platten plattiert.

Bewahren Sie diese Zellen neun bis 11 Tage lang in Kultur auf. Suchen Sie unter einem Lichtmikroskop nach Neurosphären. Ein Brunnen, der mindestens eine einzige große Neurosphäre enthält, wird als positiv angesehen.

Unter Berücksichtigung von elterlichen, nicht transduzierten Zellen und GFP-positiven Lentivirus-transduzierten Zellen als Kontrolleingaben werden die Gesamtzahl der analysierten Wells und die Anzahl der positiven Zellen auf der ELDA-Online-Schnittstelle berücksichtigt. Um mit dem Screening zu beginnen, werden 5000 Zellen in 99 Mikrolitern vollständigem Wachstumsmedium für neurale Stammzellen in einer 96-Well-Platte plattiert. Behandeln Sie dann mit einer 12-Kanal-Pipettierer die Zellen mit einer zweimikromolaren Endkonzentration verdünnter Bibliotheksverbindungen oder mit der DMSO-Kontrolle.

Inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden lang. Geben Sie nun 150 Mikroliter Zelldissoziationsreagenz mit einem 12-Kanal-Pipettierer in jede Vertiefung und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Zerreiben Sie dann die Zellen in jeder Vertiefung etwa 20 bis 30 Mal vorsichtig mit einer 12-Kanal-Pipette, bis eine einzelne Zellsuspension erreicht ist.

Führen Sie nun eine Durchflusszytometrie durch und bestimmen Sie den Prozentsatz der Zellen, die den GFAP:GFP-Reporter exprimieren. Bestimmen Sie zunächst die Zellgröße und -viabilität aus den Forward- und Side-Scattern und gaten Sie die lebensfähige Zellpopulation. Bestimmen Sie dann die GFP-positiven Zellen innerhalb der lebensfähigen Zellpopulation.

Eine Erhöhung des Prozentsatzes der GFP-positiven Zellen um drei Standardabweichungen gegenüber den Kontrollen wird als positiver Treffer angesehen, der angepasst werden kann, um der Präferenz der Benutzer für die Stringenz gerecht zu werden. Gezeigt werden repräsentative Bilder von HSR-GBM1 GSC-Subklonen, die niedrige und hohe Konzentrationen von GFAP:GFP exprimieren. Die Subklone, die positiv für die GFAP:GFP-Expression sind, wurden durch Durchflusszytometrie für die vom Patienten stammende Neurosphärenlinie ausgewählt.

Hier bedeutet ein niedriger GFAP:GFP-Wert, dass weniger als 5 % der Zellen im Klon GFP-positiv sind, während ein hoher GFAP:GFP-Wert bedeutet, dass mehr als 75 % der Zellen im Klon GFP-positiv sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass die in vitro Selbsterneuerungskapazität von GFAP-niedrigen Subklonen höher ist als die ihrer GFAP-hohen Gegenstücke, wie durch ELDA bestimmt. Daher sind GH-Subklone differenzierter als GL-Subklone.

Schließlich wurden Wirkstoffbibliotheken gescreent, um Wirkstoffe zu identifizieren, die in der Lage sind, die astrogliale Differenzierung in GSCs zu induzieren. Es wurde festgestellt, dass 12 Medikamente den Prozentsatz der Zellen, die den GFAP:GFP-Reporter exprimieren, signifikant erhöhen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Wochen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie der alamarBlue-Assay, der klonogene Assay in halbfesten Medien, die Flanken- oder intrakranielle Xenographie-Injektion durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Wirkung selektiver Arzneimittel auf die zelluläre Proliferation und die Klonogenität in vitro und die Tumorigenität in vivo zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Verbindungen identifizieren können, die in Glioblastom-Stammzellen eine astrogliale Differenzierung induzieren können.