Name: Optische Cross-sectional Muskel Bereich Bestimmung von Drosophila Melanogaster Erwachsenen indirekten Flugmuskeln (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Lernen Sie die optische Querschnittsbestimmung von Muskelbereichen bei Drosophila melanogaster-Erwachsenen. Diese Methode ermöglicht die indirekte Quantifizierung der Muskelmasse und unterstützt Forscher bei der Untersuchung von Muskelerkrankungen wie der Myotonen Dystrophie.

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Die Autoren möchten Mitglieder der translationalen Genomik-Gruppe und Kathryn J Hanson für die Rückmeldung und die Verbesserungen auf dieses Protokoll zu danken. Dieses Projekt erfolgte mit Forschungsstipendium SAF2015-64500-R, die europäischen Fonds für regionale Entwicklung, verliehen durch das Ministerio de Economia y Competitividad R.A umfasst.

(1) Fixierung und Harz einbetten
<ol><li>Die fliegen mit Kohlendioxid (CO2) oder via Hypothermie mit einem Eisblock zu betäuben. Verwenden Sie einen sezierenden Mikroskop (mit geringer Vergrößerung zu sehen, die ganze Fliege) und Schere um zu entfernen, die Beine, Flügel, Kopf und terminal Teil des Abdomens, das Eindringen der Fixativ zu erleichtern. Schonung der Kadaver ist erforderlich bei diesem Schritt um die Verformung des Brustkorbs zu vermeiden. Hinweis: Starten Sie mit mindestens 12 fliegen pro Genotyp um eine ausreichende Anzahl von richtig verarbeitete Individuen am Ende des Verfahrens.</li>
	<li>Übertragen Sie die Kadaver auf eine 1,5 mL-Tube auf Eis (Platzieren von maximal 6 Personen pro Röhre) mit 200 µL Lösung 1. Hinweis: Die Kadaver nicht in Lösung 1 für mehr als 20 min bleiben.<ol>
<li>Mix für Lösung 1, Komponenten in diesen Volumen Proportionen: ¼ 4 % Paraformaldehyd, ¼ 8 % Glutaraldehyd, ¼ 0,2 M Na2HPO4 und ¼ 0,2 M NaH2PO4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Lösung 2 und inkubieren Sie für 30 min auf Eis.<ol>
<li>Lösung 2: Mix Lösung 1 und OsO4 im Verhältnis 1:1 (V/V). Achtung: OsO4 ist extrem giftig. In einer Abzugshaube mit geeigneten Maßnahmen für Sicherheit und Entsorgung zu manipulieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Flüssigkeit zu entfernen. Fügen Sie 200 µL Lösung 2 und inkubieren Sie für 1-2 h auf Eis.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung und entwässern die Proben durch eine abgestufte Ethanol-Reihe wie folgt: einmal in 30 %, 50 %, 70 %, 90 %, und zweimal in absoluten Ethanol; 5 min. Fügen Sie 1 mL Ethanol um die Proben zu decken. Hinweis: Wenn das Gewebe in 90 % Ethanol platziert ist, können die nachfolgenden Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie den Proben zweimal in Propylenoxid für 10 min jeden Inkubation. Achtung: Propylenoxid ist giftig, in einer Dampfhaube verwenden.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Propylenoxid durch ein 1:1 (V/V) Mischung aus Epoxy-Harz und Propylen Oxid und über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Achtung: Das Harz ist im flüssigen Zustand extrem giftig. Das Harz ist als ein Satz von vier Komponenten (A, B, C und D) zur Verfügung.<ol>
<li>Fügen Sie für Epoxidharz in eine Einweg-Becher 54 g Harz (A), 44,5 g härter (B), 2,5 g des Beschleunigers (C) und 10 g Weichmacher (D). Kombinieren Sie die Harz-Komponenten unter einem Abzug. Speichern Sie das Harz in Aliquote bei-20 ° C (für bis zu 6 Monate) oder bei-80 ° C (für mehrere Jahre).</li>
		<li>Um das Harz zu verwerfen, Backen Sie bei 70 ° C für 24 h weil Festharz nicht toxisch ist. Alle bisherigen Lösungen in der Gruppe der Schwermetalle nach geeigneten internationalen Verfahren, zu verwerfen, da Lösungen können Spuren von OsO enthalten4.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ersetzen Sie die bisherigen Mischung mit 100 % Harz und inkubieren Sie die Proben für 4 h.</li>
	<li>Übertragen Sie die Kadaver auf Kunststoffformen, enthält neue Harz (ein Kadaver in jede Vertiefung der Form). Verwenden Sie einen angespitzten Holzstab oder Nadel zu übertragen und die Kadaver in den Brunnen zu orientieren und das Harz über Nacht im Backofen bei 70 ° c Pasteur polymerisieren zu verlassen Hinweis: Um entsprechende Orientierung der Schlachtkörper für hintere trimmen und schneiden zu gewährleisten, sollten die Kadaver an ihrer Längsseite mit dem vorderen Teil des Korpus sehr nahe an den Rand des Brunnens liegen.</li>
</ol>2. Trimmen und Schneiden von Blöcken
<ol><li>Entfernen Sie die polymerisierten Harz-Blöcke aus den Formen. Verwenden Sie Rasierklingen schneiden Sie das Harz, eine trapezförmige form rund um die Karkasse und geben entsprechende Orientierung im Mikrotom. Starten Sie schneiden die Kadaver nach der transversalen Naht um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten. Hinweis: Der Schnitt muss senkrecht zur Achse des DLMs Probe richtig trimmen Anteroposterior sein ( Abbildung 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> Abbildung 3 . Dorsoventral Abschnitte des Erwachsenen Thoraces Harz eingebettet, myotonische Dystrophie Modell fliegen. (A) war das Trimmen der Probe nicht richtig, da war der Teil im dorsalen rechten Teil des Bildes nicht vollständig transversalen zu den Muskeln. Folglich scheinen die drei Muskelbündel auf der oberen rechten Seite größer als die der linken Seite. Dieser Fehler führt zu einer Überschätzung des Bereichs Muskel. (B) Abschnitt aus einem Block korrekt getrimmte Harz. Maßstabsleiste: 200 µm.
<ol><li>Schnitt 1,5 µm dicke Schichten mit einer regungsloses und übertragen Sie die Abschnitte in Wassertropfen über verkleisterte Folien.<ol>
<li>Erhalten Sie die Abschnitte aus dem Mesothorax Segment für alle Proben um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Folien mit den Abschnitten auf einem Heizblock bei 70-80 ° C bis H2O verdampft. An dieser Stelle können die Proben mit dem OsO4 Kontrast (Abb. 4A) beobachtet werden.</li>
</ol>3. Färbung IFM Abschnitte
<ol><li>Sollte in den Kapiteln mit genügend Toluidin blau für ca. 30 s auf dem Heizblock.<ol>
<li>Toluidin blauer Lösung lösen Sie auf, 1 % der Toluidin blau und 1 % Borax in H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spülen mit H2O und lassen Sie die Folien auf einem warmen Teller um das Wasser zu verdampfen. Wiederholen Sie die Färbung mit Toluidin blau wenn der Kontrast sein muss (Abbildung 4 b) erweitert.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> Abbildung 4 . Dorsoventral Abschnitte der Harz eingebettet adult Thoraces mit verschiedenen Kontrast Keramikschalen. Beide Platten zeigen Bilder der DM1 Modell fliegen mit Abp1 wie in Abb. 2Dgefüttert. (A) Bild eines Abschnitts mit dem OsO4 Kontrast. (B) Abschnitt gebeizt mit Toluidin Blau ermöglicht bessere Visualisierung der Muskelbündel. Maßstabsleiste: 200 µm.
4. Montage IFM Abschnitte
<ol><li>Trocknen Sie die Folien mit den Heizblock bis H2O verdampft.</li>
	<li>1 oder 2 Tropfen Eindeckmittel auf den Abschnitten und einem Deckgläschen auflegen. Achtung: Führen Sie diesen Schritt in einer Dampfhaube weil das Eindeckmittel giftig ist.</li>
</ol>5. Erwerb von Bildern und Quantifizierung der Muskelgebiet
<ol><li>Nehmen Sie die Bilder bei kleiner Vergrößerung, so dass das ganze Set der DLM Muskeln im Fokus ist. Wir verwenden normalerweise 10 X.<ol>
<li>Für die statistische Analyse mindestens 5 serielle Bilder pro Fliege nehmen und mindestens 5 fliegen pro Versuchsgruppe zu analysieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie das Bild mit der gesamten Muskulatur (Abb. 5A). Überprüfen Sie die Achse oder die Ausrichtung des Abschnitts und entsorgen Sie die Proben mit unangemessenen Orientierung, die die Ergebnisse verfälschen würde (Vergleiche Abbildungen 3A / 3 b zu stark unterscheiden und gut orientierte Abschnitte bzw.).</li>
	<li>Verwenden Sie ImageJ-Software, um einen Bereich (in Pixel), enthält nur die DLMs (Abbildung 5A/5B) auswählen. Für den Vergleich zwischen verschiedenen Versuchsgruppen wäre der Referenzbereich zu verwendenden immer die Fliege mit den größten Muskeln. In den Bildern der verschiedenen Genotypen zu vergleichen, wählen einen Bereich mit DLMs gleichen Abmessungen zu den Referenzbereich (Abb. 5 b).</li>
	<li>Vollständig die Bilder mit dem Befehl Bild-J: Prozess/Binary/Make binäre und löschen Sie die Bereiche oder Pixel, die nicht zu den Muskeln des Interesses (Abbildung 5) entsprechen.<ol>
<li>Löschen Sie in dem Fall, den artifizielle schwarze Flecken in anderen Bereichen als Muskel angezeigt werden sie mit dem Befehl Zeichenwerkzeuge und wählen Sie das Radiergummi-Symbol.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> Abbildung 5 . Analyseverfahren für Muskel Bereich Bestimmung Bild. (A) transversaler Abschnitt myotonische Dystrophie Typ 1 Modell fliegen Thorax mit ein Rechteck mit der DLM. (B) ausgewählte Bereich mit nur die indirekten Flugmuskeln und den Darm (*). (C) Binarized Bild. Die schwarzen Bereiche entsprechen den Muskeln von Interesse. Der Darm ist für eine genaue Quantifizierung der Muskelgebiet gelöscht. Maßstabsleiste: 200 µm.
<ol start="5"><li>Prozentsatz der Pixel, die Muskelgewebe (schwarze Pixel) von insgesamt mit dem Befehl zu quantifizieren: Analyse/Messung und wählen Sie die Option Bereich Bruchteil. Dieser Prozentsatz des Bereichs ist eine Abschätzung der DLM Muskelmasse jede Fliege.</li>
</ol>

<ol><li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li>
<li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+%28DLM%29+of+Drosophila%3A+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li>
<li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.sdbonline.org/sites/fly/atlas/00atlas.htm">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li>
<li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Platin+Met+Rev%22%5BJournal%5D)">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li>
<li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1165/">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li>
<li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li>
<li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscleblind%2C+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model.+Mech%22%5BJournal%5D)">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li>
<li>García-López, A., Llamusí, B., Orzáez, M., Pérez-Payá, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li>
<li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li>
<li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184(2010).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223(2014).</li>
</ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Es hat sich gezeigt, dass Drosophila Melanogaster eine nützliche Modell zur menschlichen neuromuskulären Erkrankungen7,10,11, einschließlich myotonische Dystrophien, charakterisiert durch das Auftreten von Muskelatrophie. Das Protokoll hier vorgestellten ist ein nützliches Instrument zur Quantifizierung der Muskeldegeneration durch das auftreten oder Fortschreiten einer bestimmten Krankheit in einem Fly Modell verursach...

Der Thorax der Fruchtfliege enthält zwei verschiedene Klassen von Flugmuskeln, die funktionell, physiologisch und anatomisch unterscheiden. Diese Muskeln sind: die indirekten Flugmuskeln (IFM), die von dorsal längs (DLM) und dorsal-Ventral (DVM) Muskeln (Abbildung 1) und die synchrone Flug bestehen Steuern Muskeln1,2. Diese Muskeln erzeugen zusammen die erhöhte mechanische Leistung für Flug benötigt. Die Größe, Verteilung und Rostro-kaudalen Disposition der die Schnittstellenmodule ermöglichen eine einfache Orientierung für transversale Stationspunkte3 (Abbildung 2A). Aus diesem Grund haben wir diese Muskeln, Muskelatrophie in Drosophila Melanogasterstudieren ausgewählt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> Abbildung 1: Diagramm des Thorax der Fruchtfliege zeigen die indirekten Flugmuskeln (Schnittstellenmodule) Anordnung. (Links) stellt eine seitliche Ansicht und (rechts) repräsentiert einen Querschnitt des Thorax. Die Schnittstellenmodule bestehen der dorsal längs (DLM) Muskeln (in rot) und dorsal-Ventral (DVM) Muskeln (in grün).
Erhaltung der Gewebestruktur und die Kontrolle über dorsal-Ventral Achsenausrichtung der histologischen Abschnitte sind entscheidend für die richtige Beurteilung der Muskel Querschnittsfläche gewährleisten zu können. Muskelstruktur erhalten wir eine Fixierung Mischung geändert von Tomlinson Et Al. verwendet 4 . Weil Muskeln inneren Geweben, ist die Dichtheit der DrosophilaExoskelett übrigens ein Problem als Fixierung, die Mischungen auf das Zielgewebe nicht durchdringen können. Um dieses Problem zu umgehen, entfernen wir fliegen Kopf, Beine, Flügel und die letzten beiden Segmente des Abdomens Bohrungen erstellen, die die Fixierung Mischung geben darf. Im Rahmen des Protokolls Fixierung wir Behandlung mit Osmium ausgefällt (OsO4)5, die ausgiebig wegen seiner Fähigkeit verwendet wird enthalten, um Fette zu beheben, einschließlich der Triglyceride. OsO4 bewahrt die meisten Strukturen sehr gut, vor allem auf die zytologische Ebene und zur gleichen Zeit bietet einen Kontrast zu dem Bild. Nach der Fixierung waren Drosophila Thoraces im Harz für transversale semi-dünne Stationspunkte (1,5 µm) eingebettet. Für verbesserten Kontrast kann Gewebe zusätzlich mit Toluidin blau gefärbt werden. Bilder der kompletten Thoraces wurden bei 10 X und Muskelgebiet wurde durch binarizing Bilder (mit gleichen Abmessungen) und Quantifizierung der Prozentsatz der Pixel, die Muskelgewebe (schwarze Pixel) von insgesamt, mit ImageJ Software quantifiziert.
Veränderungen auf die Gewebe Vorbereitung und Fixierung Mischungen, wie der Anstieg der Konzentration von OsO4 und Glutaraldehyd-Lösung eingeführt, die in diesem Protokoll erlaubt einzigartige Erhaltung von Muskelgewebe. Und zwar deshalb, weil das Protokoll der Abbau und die Verformung des Gewebes, machen die hintere Analyse der Proben selbst in stark atrophischen Bedingungen im Zusammenhang mit neuromuskulären degenerativen Erkrankungen wie z. B. myotonische Dystrophie (DM) zuverlässiger vermeidet. In seiner häufigsten Form, DM Typ 1, ist diese seltene genetische Erkrankung durch erweiterte CUG Wiederholungen im myotonische Dystrophie Proteinkinase (DMPK) Abschriften herbeigeführt. Mutierte DMPK RNA Aggregate Form Ribonuclear Herde, die absondern Muscleblind-wie nukleare RNA-bindende Proteine (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) in Drosophila)6. Wir generiert eine Drosophila -Modell myotonische Dystrophie 250 CTG Wiederholungen unter den muskulösen Myosin schwere Kette Projektträger (Mhc-Gal4) zum Ausdruck zu bringen. Modell fliegen waren flugunfähige mit einem typischen "Up statt Flügel" Phänotyp und schweren Muskel Atrophie in ihre Schnittstellenmodule (Abb. 2 b). Frühere Studien, die in unserem Labor durchgeführt haben gezeigt, dass die Bestimmung des Gebiets Muskel Schnittstellenmodule ist eine zuverlässige Methode zur Quantifizierung der Auswirkungen von verschiedenen chemischen oder genetische Modifikatoren der Muskelatrophie in diese Modell fliegen7. Als Beispiel erreicht Überexpression des Mbl-Isoform C fliegen mit dem Ausdruck der 250 CTG im Muskel, Wiederholungen eine Rettung Muskelgebiet, Mbl Erschöpfung durch Sequestrierung ist der auslösende Faktor in DM1 Pathogenese8 (Abbildung 2). Muskelgebiet wurde auch gerettet, nach Fütterung der DM-Modell mit Abp1, ein Hexapeptid mit bewährten Anti-DM1 Aktivität9 (Abb. 2D) fliegt.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> Abbildung 2: Quantifizierung der dorsoventral Abschnitte des Erwachsenen Thoraces Harz eingebettet. (A-D) indirekten Flugmuskeln von Drosophila Melanogaster mit der angegebenen relevanten Genotypen. (A) Kontrolle fliegt (Yw). (B) Ausdruck von 250 nicht-kodierenden CTG wiederholt in der Muskulatur (UAS-CTG(250)x) verursacht eine Verringerung der Muskelgebiet im DLMs im Vergleich zur Kontrolle fliegen. (C) diese Muskel-Atrophie-Phänotyp wurde gerettet durch Überexpression des Muscleblind (MblC) (FH-CTG (250) x UAS-MblC) und (D) Fütterung die Modell-fliegen mit dem Hexapeptid Abp1 (FH-CTG (250) x Abp1). In allen Bildern ist die dorsale Seite oben. Transgene Muscle Myosin Heavy Chain Förderer (Mhc) mit vertrieben wurden-Gal4. (E) Quantifizierung der Prozentsatz der Muskelgebiet bezogen auf die Kontrolle fliegen bestätigt, dass die Unterschiede signifikant waren. Das Histogramm zeigt Mittel ± S.E.M **p< 0,01 und * p < 0,05 (Student t-Test). Maßstabsleiste: 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Die Methode, die hier berichtet wird von Interesse für Forscher mit Schwerpunkt auf Muskel-Entwicklung, Wartung und Altern, Krankheit Pathologie und Drogentests wie es zuverlässige Informationen liefert über wie Muskelgewebe auf endogene und externe Faktoren reagiert.

<table><tbody><tr><td>Image-J Software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica</td><td>Leica UC6</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>Leica MZ6</td><td>Hellfeldtechnik.</td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>71970</td><td>Es gibt mehrere alternative Anbieter.</td></tr><tr><td>Schere</td><td>World Precision World</td><td>14003</td><td>Es gibt mehrere alternative Anbieter.</td></tr><tr><td>Einbettformen</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>70900</td><td>Es gibt mehrere alternative Anbieter.</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Fluka (Sigma)</td><td>49624</td><td>Giftig.</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>Polyscience</td><td>0972A</td><td>Extrem giftig.</td></tr><tr><td>Propylenoxid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82320-250ML</td><td>Extrem giftig.</td></tr><tr><td>Harz (Durcupan)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44611-44614</td><td>Karzinogen, wenn es nicht polymerisiert ist.</td></tr><tr><td>Toluidinblau</td><td>Panreac</td><td>251176</td><td>Giftig.</td></tr><tr><td>Eindeckmittel (DPX)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44581</td><td>Gefährlich.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>gesundheitsschädlich.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Panreac</td><td>122507</td><td>0,2 M Verdünnung.</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Panreac</td><td>121677</td><td>0,2 M Verdünnung.</td></tr><tr><td>Borax</td><td>Panreac</td><td>3052</td><td>Giftig.</td></tr></tbody></table>

optische cross-sectional muskel bereich bestimmung von drosophila melanogaster erwachsenen indirekten flugmuskeln

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Muskelmasse zu verlieren, ist bekannt als Muskelatrophie, einen gemeinsamen Phänotyp in Drosophila -Modellen der neuromuskulären Erkrankungen. Wir haben die indirekten Flugmuskeln (Schnittstellenmodule) fliegen, speziell der dorsal-Längsmuskeln (DLM), als die experimentelle gegen die verwendet, die atrophische Phänotyp durch unterschiedliche genetische Ursachen herbeigeführt. In diesem Protokoll beschreiben wir fliegen Thorax Muskeln für halb dünn schneiden einbetten, das einen guten Kontrast zwischen Muskel und das umgebende Gewebe zu erhalten und das optische Mikroskopbilder für halbautomatische Erfassung von quantifizierbaren Daten verarbeiten und Analyse. Wir beschreiben drei spezifische Anwendungen der methodischen Pipeline. Zunächst zeigen wir, wie die Methode angewendet werden kann, um Muskeldegeneration in einem myotonische Dystrophie Fly Modell zu quantifizieren; Zweitens helfen Messung der Muskel Querschnittsfläche, um Gene zu identifizieren, die entweder zu fördern oder zu, Muskelatrophie und/oder Muskeldegeneration verhindern; Drittens kann dieses Protokoll angewendet werden, um festzustellen, ob eine Kandidatenverbindung in der Lage, einen bestimmten atrophischen Phänotyp, induziert durch eine ursächliche Mutation wesentlich zu ändern istoder durch ein Umwelt-Trigger.

Um zu bestimmen ob die Überexpression von MblC oder die Verwaltung von Abp1 keine Wirkung in der atrophischen Phänotyp des Modells myotonische Dystrophie fliegen hatte konzentrierten wir uns auf die DLMs, die Schnittstellenmodule (Abbildung 1) gehören. Wir festgestellt, dass das Modell fliegt die express 250 nicht-kodierenden CTG Wiederholungen in der Muskulatur, angetrieben durch den Projektträger Myosin Heavy Chain (Mhc),-Gal4, hatte eine Ermäßigun...

Wir berichten über eine Methode, um Muskelgebiet, zu quantifizieren, ist eine indirekte Methode Muskelmasse bei Drosophila Erwachsenen bestimmen. Wir demonstrieren die Anwendung unserer Methode durch die Analyse des indirekten Flugs in einem Drosophila -Modell myotonische Dystrophie Krankheit Muskeln.

Optische Cross-sectional Muskel Bereich Bestimmung von Drosophila Melanogaster Erwachsenen indirekten Flugmuskeln

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Muskeloberfläche in den adulten Muskeln von Drosophila zu quantifizieren, um indirekt die Muskelmasse zu bestimmen und die Größenänderung aufgrund von Muskelhypertrophie oder -atrophie korrekt einzuschätzen. Zu diesem Zweck konzentrierten wir uns auf die dorsolongitudinalen Muskeln aufgrund ihrer Größe, Verteilung und der geringen Anzahl an dieser Position, was eine einfache Orientierung für Querschnitte ermöglicht. Erster Schritt: Fixierung und Einbettung in Harz.Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Fliegen mit CO2 zu betäuben und mithilfe von Schere und Pinzette die Beine, Flügel sowie den terminalen Teil des Abdomens zu entfernen. Anschließend werden die Leichen vorsichtig, um eine Verformung des Thorax zu vermeiden, in eine 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis überführt, wobei maximal sechs Individuen pro Röhrchen mit 200 Mikrolitern Lösung eins enthalten sein sollten. Die Leichen dürfen sich nicht länger als 20 Minuten in dieser Lösung befinden.Als letztes 200 Mikroliter Lösung zwei hinzufügen und 30 Minuten auf Eis inkubieren. Nach der Inkubation die gesamte Flüssigkeit entfernen, 200 Mikroliter Lösung zwei hinzufügen und die Kadaver eine bis zwei Stunden auf Eis inkubieren. Im nächsten Schritt wird die Lösung entfernt und die Proben durch eine abgestufte Ethanolreihe dehydriert.Die Proben zweimal jeweils zehn Minuten in Propylenoxid inkubieren. Anschließend das Propylenoxid durch eine Mischung aus 500 Mikroliter Harz und 500 Mikroliter Propylenoxid ersetzen und die Proben über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Am nächsten Tag die Mischung durch 100 Prozent Harz ersetzen und die Proben vier Stunden lang inkubieren.Anschließend überführen Sie die Kadaver in Kunststoffformen, die mit neuem Harz gefüllt sind, und stellen sicher, dass sich jeweils ein Kadaver in jeder Vertiefung der Form befindet. Richten Sie die Kadaver mit einem Holzstäbchen in den Vertiefungen aus und lassen Sie das Harz über Nacht in einem Pasteur-Ofen bei 70 Grad Celsius polymerisieren. Um das Harz zu entsorgen, backen Sie es 24 Stunden lang bei 70 Grad Celsius, da festes, ausgebackenes Harz nicht toxisch ist.Zwei, Einstellen und Schneiden der Blöcke. Mit Hilfe von Rasierklingen wird das Harz abgetragen und eine trapezförmige Form um die Leiche herum ausgebildet, um die korrekte Orientierung im Mikrotom zu gewährleisten. Überprüfen Sie am Mikroskop, ob die Muskulatur exakt ausgerichtet ist.Danach schneiden Sie 1,5 µm dicke Schnitte mit einem Ultramikrotom und übertragen die Schnitte auf Wassertropfen auf Objektträgern mit Gelatineüberzug. Abschließend werden die Objektträger mit den Schnitten auf einen Heizblock bei 70 bis 80 °C gestellt, bis das gesamte Wasser verdunstet ist. Drei, Färbung von IFM-Schnitten.Bedecken Sie die Schnitte etwa 30 Sekunden lang mit Toluidinblau auf dem Heizblock. Spülen Sie anschließend mehrmals mit Wasser und lassen Sie die Objektträger auf einer warmen Platte, um das Wasser verdunsten zu lassen. Vier, Eindecken von IFM-Schnitten.Nehmen Sie die Objektträger, geben Sie ein oder zwei Tropfen Eindeckmedium auf die Schnitte und legen Sie ein langes Deckglas auf. Fünf, Aufnahme der Bilder und Quantifizierung der Muskeloberfläche. Verwenden Sie die ImageJ-Software, um einen Bereich auszuwählen, der nur die DLMs enthält.Nehmen Sie als Kontrolle die Abmessungen des Bildes der Fliege mit der größten Muskeloberfläche, verfeinern Sie die Bilder und löschen Sie die Bereiche oder Pixel, die nicht den Muskeln von Interesse entsprechen. Quantifizieren Sie mithilfe des Befehls „analyze“, „measurement“ und Auswahl der Option „area fraction“ den prozentualen Anteil der Pixel, die Muskelgewebe entsprechen, an der Gesamtfläche. Dieser Flächenanteil stellt eine Schätzung der DLM-Muskelmasse jeder Fliege dar.Vertretende Ergebnisse. Wir stellten fest, dass die Modelfliegen, die 250 nichtkodierende CTG-Wiederholungen im gesamten Muskelgewebe exprimieren, getrieben durch den Promotor des schweren Myosinkettengens, MhC Gal vier, eine um 50 Prozent verminderte Muskeloberfläche im Vergleich zu Kontrollfliegen aufwiesen. Im Gegensatz dazu unterdrückte die gleichzeitige Expression von Muscle blind C und expandierten CTG-Wiederholungen mit demselben Treiber diesen Phänotyp stark, und die querschnittliche Muskeloberfläche betrug 70 Prozent der Kontrollfliegen.Die Zugabe des Abp1-Hexapeptids zum Nährmedium unterdrückte ebenso das atrophische Phänotyp, und Modellfliegen, die die Substanz aufgenommen hatten, wiesen etwa 60 Prozent der normalen Muskelfläche auf statt der typischen 50 Prozent bei DF1-Fliegen. Schlussfolgerungen: Das hier vorgestellte Protokoll ist ein nützliches Werkzeug zur Quantifizierung der Muskelschädigung, die durch das Auftreten oder den Fortschritt einer bestimmten Erkrankung in einem Fliegenmodell verursacht wird. Schließlich ist diese Methode auch dafür optimiert, kleine Unterschiede in der Muskelfläche zu erkennen oder sogar die Fläche verschiedener Strukturen wie Nephrozyten zu quantifizieren.Vielen Dank fürs Zuschauen.

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Identifizierung von Mechanismen, die Schädigung der Muskulatur ist von entscheidender Bedeutung. Hier präsentieren wir die histologische Technik zur Herstellung Paraffin eingebetteten und Gefrierschnitten von Drosophila Brustmuskeln. Dies ermöglicht die Analyse von Muskel-Morphologie und Lokalisation von Proteinen und anderen Zellbestandteilen Muskel.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

Die Drosophila-Flugmuskeln werden als Modellsystem für Muskelentwicklung und Physiologie verwendet. Dieses Video beschreibt die Flugmuskulatur von Erwachsenen und zeigt ein Protokoll zur Dissektion der sich entwickelnden indirekten Flugmuskulatur, die für die RNA-Sequenzierung von Puppen geeignet ist.

Drosophila Dissektion des späten indirekten Flugmuskels (IFM): Eine Methode zur Gewebeentnahme mit hohem Durchsatz

C. elegans haben zwei Arten von Muskeln, einfache Sarkomere und multiple Sarkomere, oder quergestreifte Muskeln. Dieses Video beschreibt die Anordnung der quergestreiften Körperwandmuskulatur, die für die Fortbewegung eines Wurms verantwortlich ist, und enthält ein Beispielprotokoll zur Messung der Muskelmorphologie mit Hilfe von Bildanalysesoftware.

Messung der Muskelfläche von C. elegans: Eine standardisierte Methode zur Quantifizierung der Morphologie der quergestreiften Muskeln

In diesem Protokoll demonstrieren wir die Anwendung der seriell-Abschnitt Elektron Tomographie, mitochondriale Struktur in Drosophila indirekte Flüge Muskel aufzuklären.

3D mitochondrialen Ultrastruktur von Drosophila indirekte Flüge Muskel von Serial-Abschnitt Elektron Tomographie aufgedeckt

Hier präsentieren wir eine einfach zu bedienende und vielseitige Methode ausführen live imaging von Entwicklungsprozessen im allgemeinen und Muskel-Sehnen-Morphogenese insbesondere in lebenden Drosophila Puppen.

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Drosophila Flugmuskel ist ein leistungsfähiges Modell, um Transkriptionsregulation, alternative Spleißung, Stoffwechsel und Mechanobiologie zu studieren. Wir präsentieren ein Protokoll zur Zerlegung von fluoreszierend markierten Flugmuskeln aus lebenden Pupas, um hoch angereicherte Proben zu erzeugen, die ideal für Proteomik und Tiefensequenzierung sind. Diese Proben können wichtige mechanistische Einblicke in verschiedene Aspekte der Muskelentwicklung bieten.

Dissektion von Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Es wird ein Protokoll vorgestellt, das die Visualisierung intakter Drosophila melanogaster in jedem Entwicklungsstadium mittels Mikrocomputed Tomographie ermöglicht.

Ganztierbildgebung von Drosophila melanogaster mittels Mikrocomputed Tomographie

Wir beschreiben eine Dissektionstechnik, die die Architektur der neuromuskulären Verbindung bewahrt und eine detaillierte immunzytochemische Untersuchung von Motoneuronen im adulten Drosophila-Bein ermöglicht.

Dissektion und Immunhistochemie des Drosophila Adult Leg zur Erkennung von Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung für ein identifiziertes Motoneuron

Drosophila ist ein etabliertes Modell für die Untersuchung von Schlüsselmolekülen, die die Myogenese regulieren. Derzeitige Methoden reichen jedoch nicht aus, um die Dynamik der mRNA-Transkription und die räumliche Verteilung innerhalb der Synzytien zu bestimmen. Um diese Einschränkung zu beheben, haben wir eine RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsmethode optimiert, die den Nachweis und die Quantifizierung von mRNAs auf Einzelmolekülebene ermöglicht.

Untersuchung der Transkriptionsdynamik von Muskeln auf Einzelmolekülskalen in Drosophila

Hier stellen wir einen schnellen, kostengünstigen Workflow für die hochauflösende Bildgebung von erwachsenen Drosophila-Augen vor, um Musterbildung und Wachstumsdefekte zu quantifizieren. Wir beschreiben unser Protokoll für die Probenvorbereitung durch Punktmontage, hochauflösende Bildaufnahme und Bildanalyse.

Ein schneller, einfacher Workflow zur Quantifizierung externer adulter Drosophila-Strukturen

Drosophila ist ein leistungsfähiges Modell, um die grundlegenden Mechanismen der Myogenese zu verstehen. Dieses Protokoll für die Dissektion und Präparation von Thorax-Hemisektionen ermöglicht die mikroskopische Analyse des indirekten Flugmuskels sowohl im Puppen- als auch im Erwachsenenstadium. Dieses Protokoll ermöglicht die konfokale Bildgebung der zellulären Morphologie, der Proteinlokalisierung, der Muskelstruktur und mehrerer anderer Aspekte der Myogenese.

Dissektion von Drosophila melanogaster Indirekte Flugmuskulatur für Mikroskopie-Ansätze

Lernen Sie die optische Querschnittsbestimmung von Muskelbereichen bei Drosophila melanogaster-Erwachsenen. Diese Methode ermöglicht die indirekte Quantifizierung der Muskelmasse und unterstützt Forscher bei der Untersuchung von Muskelerkrankungen wie der Myotonen Dystrophie.

Optische Cross-sectional Muskel Bereich Bestimmung von Drosophila Melanogaster Erwachsenen indirekten Flugmuskeln

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