Induktion von Lähmung und visuelles System Verletzungen bei Mäusen durch T-Zellen spezifisch für Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, eine Autoimmunerkrankung des Zentralnervensystems oder des ZNS durch den adoptiven Transfer von Aquaporin-4-spezifischen T-Zellen zu induzieren und die daraus resultierenden Auswirkungen auf das ZNS und das dynamische visuelle System zu überwachen. Diese Methode wird dazu beitragen, Schlüsselfragen zur Rolle von Aquaporin 4, allgemein bekannt als AQP4, spezifischen T-Zellen bei Neuromyelitis optica sowie anderen entzündlichen Sehstörungen zu beantworten. Der Hauptvorteil der optischen Kohärenztomographie ist die Möglichkeit, eine longitudinale Überwachung von Netzhautverletzungen auf nicht-invasive Weise durchzuführen.

Das Verfahren wird von Sharon Sagan, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin in meinem Labor, sowie Andreas Cruz Harans, einem Fellow im RE Greens Laboratory, demonstriert. Beginnen Sie damit, einen Drei-Wege-Nylonhahn mit zwei Luer-Lock-Anschlüssen an einer Luer-Lock-Spritze aus Glas ohne Kolben anzubringen. Drehen Sie den Absperrhahnhebel in Richtung der Spritze, um den Absperrhahn zu schließen, und positionieren Sie die Spritze mit dem offenen Ende nach oben.

Geben Sie nach dem Vortexen ein Eins-zu-Eins-Volumen Peptid und Complete Freund's Adjuvans Lösung in die Spritze und setzen Sie den Glaskolben wieder in die Spritze ein. Halten Sie den Kolben fest, drehen Sie die Spritze so um, dass der Absperrhahn nach oben zeigt, und schalten Sie den Hebel auf den unbenutzten weiblichen Anschluss. Drücken Sie vorsichtig auf den Kolben, um die überschüssige Luft aus der Spritze zu entfernen.

Die Lösung füllt den zweiten männlichen Luer-Lock-Anschluss des Absperrhahns. Befestigen Sie dann eine zweite Glasspritze, wobei der Kolben vollständig in den zweiten männlichen Luer-Lock-Anschluss eingeführt ist. Um eine Emulsion zu erzeugen, drücken Sie abwechselnd die Kolben, um die Lösung etwa zwei Minuten lang zwischen den beiden Spritzen zu leiten, und kühlen Sie die Lösung etwa 10 Minuten lang ab, bis sich die Viskosität der Lösung sichtbar ändert.

Wenn sich eine sehr steife weiße Emulsion bildet, geben Sie die gesamte Lösung in eine der Spritzen und ersetzen Sie die leere Spritze durch eine neue Ein-Millimeter-Luer-Lock-Spritze. Füllen Sie die neue Spritze mit der Emulsion. Nehmen Sie die Spritze aus dem Absperrhahn und befestigen Sie sie an einer 25-Gauge-Nadel.

Um die Konsistenz der Emulsion mit Wasser zu testen, geben Sie einen Tropfen der Emulsion in eine kleine Schüssel mit Wasser. Wenn sich die Emulsion nicht dispergiert, ist sie zur Injektion geeignet. Injizieren Sie dann jede Spender-AQP4-Knockout-Maus einmal subkutan in jede Seite des Unterbauchs und in jede Seite der Brustwand medial zur Achselhöhle.

Machen Sie 10 bis 12 Tage nach der Immunisierung einen Mittellinienschnitt in der Haut von der Leiste bis zum Hals und an jedem Bein der ersten Maus entlang. Ziehen Sie die Haut vom Bauchfell weg und befestigen Sie sie fest auf dem Brett. Entnehmen Sie dann die Leisten- und Achsellymphknoten und geben Sie das Gewebe in ein Zellsieb in einer Petrischale, die das vollständige Medium enthält.

Wenn alle Lymphknoten gesammelt wurden, legen Sie das Zellsieb auf ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit frischem vollständigem Medium auf Eis und drücken Sie die Lymphknotenzellen mit dem flachen Ende eines sterilen Fünf-Milliliter-Spritzenkolbens durch das Filternetz. Spülen Sie das Netz mit 20 bis 30 Millilitern Vollmedium, um die Zellrückgewinnung zu erleichtern, gefolgt von zwei Zentrifugationswäschen. Nach der zweiten Zentrifugation wird das Pellet zur Zählung in T-Zell-Medium resuspendiert.

Geben Sie die entsprechenden Konzentrationen von Antigen, rekombinanter Maus Interleukin Maus 23 und rekombinanter Maus IL-6 zu den Zellen und fügen Sie zwei Milliliter Zellen pro Vertiefung in dieser Th17-Polarisationsmischung in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte hinzu. Stellen Sie die Platte dann für 72 Stunden in einen befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator mit 5 % CO2. Am dritten Tag der Polarisation zerreiben Sie die Kulturen in jeder Vertiefung einige Male, um die polarisierten Zellen zu entfernen, und poolen Sie sie zum Zählen in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis.

Nach zwei Waschgängen in PBS verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von eins mal 10 bis acht Zellen pro Milliliter in PBS und mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig durch Schwenken. Übertragen Sie die Zellen innerhalb einer Stunde nach ihrer Entnahme in eine Ein-Milliliter-Spritze und geben Sie jedem Empfängertier intravenös 200 Mikroliter Zellen durch die Schwanzvene zu. Dann injizieren Sie jeder Maus sofort intraperitoneal und zwei Tage später 200 Nanogramm B-Pertussis-Toxin, verdünnt in 200 Mikrolitern PBS.

Für die In-vivo-Netzhautbildgebung der Empfängertiere mittels optischer Kohärenztomographie erweitern Sie fünf Minuten vor der Bildgebung die Pupillen mit einem Tropfen 1 % Tropicamid pro Auge und schalten Sie die Heizmatte ein. Platzieren Sie die Maus auf dem Bildgebungszylinder und lenken Sie den Anästhesiefluss entsprechend um. Schützen Sie die Augen mit 0,3 % Hydroxypropylmethylcellulose, um sie feucht zu halten und die Kontinuität der Brechung zu gewährleisten, und setzen Sie eine individuelle Kontaktlinse auf das zu untersuchende Auge.

Richten Sie den Laser anhand des Infrarot-Fundusbildes auf das mit Linsen bedeckte Auge und achten Sie darauf, dass der Strahl auf den Sehnervenkopf zentriert ist. Führen Sie 25 B-Scans im hochauflösenden Modus durch und rastern Sie die Bilder aus 30 gemittelten A-Scans. Nachdem Sie beide Augen abgebildet haben, ersetzen Sie die Kontaktlinse durch ein ophthalmisches Gel und legen Sie die Maus in einen warmen Erholungskäfig.

Um die aufgenommenen Bilder mit der modularen Bildgebungssoftware für die automatisierte Segmentierung zu analysieren, korrigieren Sie zunächst manuell die Segmente, die der inneren Grenzmembran und der inneren plexiformen Schicht entsprechen, um die Grenzen der inneren Netzhautschichten darzustellen. Stellen Sie dann sicher, dass sich die retinalen Nervenfaser- und Ganglienzellschichten innerhalb der Grenzen der inneren Netzhautschicht befinden und sich nicht überlappen. Die subkutane Immunisierung mit AQP4-Peptiden, die pathogene T-Zell-Epitope enthalten, löst in den drainierenden Lymphknoten von AQP4-Knockout-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-T-Zell-Antworten starke proliferative T-Zell-Antworten aus.

Durchflusszytometrische Analysen der individuellen V-beta-Expression zeigen, dass T-Zellen, die für AQP4-Peptide spezifisch sind, die pathogene T-Zell-Epitope enthalten, einzigartige TCR-Repertoires verwenden und eine selektive Hyperproliferation aufweisen, was darauf hindeutet, dass pathogene T-Zell-Antworten auf diese Determinanten normalerweise durch thymusnegative Selektion reguliert werden. Etwa sechs bis neun Tage nach der polarisierten T-Zell-Injektion entwickelten fast alle Empfängermäuse klinische Anzeichen einer ZNS-Autoimmunerkrankung, einschließlich einer Lähmung des schlaffen Schwanzes und der hinteren Gliedmaßen. Mit Th17-polarisierten AQP4-spezifischen T-Zellen, die eine schwerere klinische Erkrankung induzieren als Th1-polarisierte AQP4-spezifische T-Zellen.

Zum Beispiel entwickelte diese Maus nach Verabreichung von Th17-polarisierten AQP4-Peptid-spezifischen T-Zellen eine vollständige Lähmung der hinteren Gliedmaßen. Eine klinische Erkrankung, die durch AQP4-Peptid-spezifische Th17-Zellen induziert wird, ist auch mit einer Infiltration mononukleärer Zellen in das ZNS-Parenchym und die Hirnhäute sowie mit einer Entzündung des Sehnervs verbunden, was sich auch in einer Schwellung und zunehmenden Dicke der inneren Netzhautschicht zeigt, die zum Ausgangswert zurückkehrt, wenn sich die Mäuse von der Krankheit erholen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine AQP4-gerichtete Autoimmunität induziert und überwacht, was weitere Studien ermöglicht, um zu verstehen, wie T-Zellen an Neuromyelitis optica beteiligt sind.