Name: Induktion von Lähmung und visuelles System Verletzungen bei Mäusen durch T-Zellen spezifisch für Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie durch adoptiven Transfer von AQP4-spezifischen T-Zellen eine autoimmne ZNS-Erkrankung bei Mäusen induzieren und mittels optischer Kohärenztomographie das visuelle System nichtinvasiv überwachen.

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S.S.Z. war durch das National Institute of Health (RO1 AI073737 und RO1 NS092835-01), National Multiple Sclerosis Society (RG 4768, RG 5179 und RG 5180), Maisin Foundation und Guthy Jackson Charitable Foundation unterstützt.

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S.A. Sagan, A. Cruz-Herranz, C.M. Spencer, P.P. Ho, L. Steinman, a.j. Green und R.A. Sobel Berichten keine Angaben. S.s. Zamvil ist stellvertretender Chefredakteur der Neurologie, Neuroimmunologie und Neuroinflammation und ist Mitglied des advisory Board für die internationale Gesellschaft der Neuroimmunologie. Er ist Mitglied des Editorial Boards des Journal of Clinical Investigation, The Journal of Immunology und The Journal der neurologischen Wissenschaftenund wurde Gründungsmitglied des Zuschusses Review Committee für den nationalen Ämtern der Gesundheit (NIH) klinische Neuroimmunologie und Gehirn Tumoren (CNBT) Studie Abschnitt und der National Multiple Sclerosis Society (NMS). Er diente als Berater und erhielt Honorare von Biogen Idec, EMD Serono, Genzyme, Novartis, Roche/Genentech und Teva Pharmaceuticals, Inc., und diente oder dient auf Data Safety Monitoring Boards für Lilly, BioMS, Teva und Opexa Therapeutika. Derzeit erhält Dr. Zamvil Forschung Zuschüsse vom NIH, NMS, der Maisin Foundation, Biogen und Celgene.

AQP4 wurde als das primäre Ziel in NMO-IgG in 20053identifiziert. Dann wurde es erkannt, dass es wichtig wäre, AQP4-bezogene Tiermodell der CNS Autoimmunität zu etablieren. Ein solches Modell könnte nützlich sein, zu untersuchen, wie AQP4-spezifischen T- und B-Zellen in der Entwicklung von CNS Autoimmunität teilnehmen und Kandidat Therapeutika für NMO zu testen. Obwohl die Identifikation von AQP4-spezifischen T-Zell Epitope in Wildtyp Mäusen zuerst in 201013, T-Zellen reagieren auf diese Epitope berichtet wurde histologische oder klinische Krankheit14,17nicht verursacht haben. Die Unfähigkeit, ein Modell von CNS Autoimmunität basierend auf immune Reaktivität, AQP4 erzeugen blieb ein Rätsel bis 2015 bei Jones, Et Al. 25 entdeckt, dass Spender AQP4-p135-153-grundiert-T-Zellen von AQP4- / - Mäusen verursacht klinischen und histologische Zeichen der CNS Autoimmunität bei WT Mäusen konnten. Von Interesse dürfte AQP4 p135-153 MHC-II (I-A-b) binden mit hoher Affinität17. Nur eine andere AQP4 Aminosäure-Sequenz, 201-220, wird voraussichtlich-Ab mit ähnlich hoher Affinität zu binden. In der Tat haben wir beobachtet, dass AQP4 p135-153 und p201-220 sowohl robuste Verbreitung in AQP4- / -, aber nicht WT, Mäuse zu entlocken. Hier haben wir gezeigt, wie man isolieren und insgesamt Th17 AQP4 p135-153 - und p201-220-reaktive T-Zellen von AQP4- / - Mäusen zu erweitern. Wenn in WT Empfänger Mäuse übertragen, induzierte AQP4-reaktive Th17 Spenderzellen Lähmung, begleitet von mononukleären Zellen Infiltrate in Rückenmark und Sehnerven. Afferenten Sehsystem Verletzungen ist bei Patienten mit AQP4-seropositiv NMOSD26bekannt. Hier beobachteten wir, dass Sehnerv Entzündung induziert durch AQP4-reaktive und MOG-reaktive Th17-Zellen deutlich wurde. Während AQP4-spezifische Th17-Zellen faseroptische Perineuritis induziert, induziert MOG-spezifische Th17-Zellen schwere Optikusneuritis. Wir haben auch die Techniken zur Überwachung der Sehnerv Entzündung durch AQP4-spezifische und MOG-spezifischen T-Zellen induziert serielle OCT beschrieben. Andere Forscher sollte nun in der Lage, die Protokolle, die hier beschrieben, um ihre eigenen Studien konzentrierte sich auf pathogene Mechanismen der ATCA voraus.
Leicht kann man vermeiden, dass drei potenzielle Fallstricke in unserem Protokoll. Erstens die Adoptiveltern Übertragung von ATCA erfordert Verwendung von AQP4-spezifischen T-Zellen von AQP4- / - Spender-Mäusen. Insbesondere WT AQP4 p135-153-spezifische T-Spenderzellen nicht ATCA Empfänger WT Mäusen die Ursache. Zweitens ist es wichtig, eine "Wasser-Test" mit einem Tropfen das Peptid/CFA-Emulsion vor Immunisierung von AQP4- / - Mäusen (Protokoll Schritt 1.5) durchzuführen. Die Emulsion sollte nicht im Wasser zerstreuen, wenn es zur s.c. Injektion geeignet ist. Wenn die Emulsion verteilt, sollte eine mischen die Emulsion wieder, wieder entspannen und wiederholen Sie den Wasser-Test. Zu guter Letzt induzieren aktivierten Spender CNS antigenspezifischen T-Zellen CNS Autoimmunität effizienter als ruhenden T-Zellen. Man sollte diese Kulturen unter dem Lichtmikroskop vor der Ernte der Spender-T-Zellen für Adoptiveltern Transfer Sichtkontrolle. Sich schnell teilenden Zellen kann Cluster bilden, die leicht identifiziert werden. Auch, wenn Kulturen viele aktivierte T-Zellen enthalten, können die Medien von Rosa zu Orange oder sogar gelb, durch Reduzierung des pH-Wertes Übergang. Eine kann auch Aktivierung von Spender AQP4 grundiert Lymphknoten T-Zellen zur Vermehrung von 3H-Thymidin Gesellschaftsgründung, bewerten, wie im Protokoll Schritt 3 beschrieben.
Unsere Entdeckung, dass die beiden pathogenen AQP4 T Zelle Epitope (1) vorhergesagt werden zu binden MHC-II mit hoher Affinität und (2) entlocken potente proliferative Reaktionen in AQP4- / -, aber nicht WT, Mäuse empfehlen T-Zellen gezielt jene Determinanten sind in der Regel Zebrafischembryonen negative Auslese17gesteuert. Die TCR-Repertoire genutzt für die Anerkennung von AQP4 p135-153 und p201-220 in AQP4- / - Mäuse sind einzigartig (Abbildung 2), das steht auch im Einklang mit klonalen Löschung durch Zebrafischembryonen medullären Epithelzellen vermittelt. Andere tolerogene Mechanismen können normalerweise Immunantworten auf AQP4 zurückhalten. Im Anschluss an unseren ersten Bericht17eine andere Gruppe auch gezeigt, dass AQP4 p201-220 ein insgesamt T Zelle bestimmende27enthält. Wenn α/β (TCRα- / -) T-Zell-defizienten Mäusen wurden mit AQP4- / - CD4 rekonstituiert+ T-Zellen, war es möglich, ein insgesamt AQP4-spezifischen T-Zell-Antwort, aber keine AQP4-spezifische humorale Antwort, was bedeutet, dass in entlocken WT-Mäuse AQP4-spezifische B-Zell-Antworten, ähnlich wie AQP4-spezifischen T-Zell-Antworten, unterliegen der negativen Auslese. In der Tat erfordern Verlust des Rückenmarks Axone und Routinggruppenconnectors, die nicht im WT Mäuse mit ATCA induziert durch AQP4-spezifischen T-Zellen allein zu beobachten war, Beteiligung von pathogenen AQP4-spezifischen Antikörpern. Es ist klar, dass die Maus-Modellen von AQP4-bezogene CNS Autoimmunität weiterhin entwickeln, wie wir lernen, mehr zu tolerogene Mechanismen normalerweise Steuerung AQP4-spezifischen T-Zellen und B-Zell-Immunität.
Auch andere Modelle von AQP4-bezogene CNS Autoimmunität werden entwickelten6,16,28,29,30. Jeder kann bieten Vorteile für das Studium besondere Aspekte, die für NMO Pathogenese sind. AQP4-spezifischen T-Zellen wurden im WT Ratten6,16,29nachgewiesen. Diese AQP4-spezifische T-Zellen verursacht histologische Veränderungen der CNS Autoimmunität, aber ähnlich wie bei Beobachtungen in den Mäusen, WT-Ratte-AQP4-spezifischen T-Zellen verursachen keine deutliche Anzeichen einer klinischen Erkrankung. Daher werden die Mechanismen der Toleranz, die Einschränkung der T-Zellen und B-Zellen AQP4-spezifische Immunantworten bei WT Mäusen auch in Ratten. Unabhängig davon sollte man nicht unterschätzen die Macht im Umgang mit Maus-Modellen für die Untersuchung von Mechanismen in der Pathogenese der Krankheit. Der Reichtum der Knock-out-transgenen und Reporter Mäuse kann vorteilhaft sein. Es sollte auch anerkannt werden, dass mehrere grundlegende Entdeckungen in der Autoimmunität mit EAE Mausmodellen vorgenommen wurden. Z. B. Demonstration, dass T-Zell-Klone für ein selbst-Antigen spezifischen Autoimmunerkrankung31,32, Identifizierung von die Rolle des T-Zell-Costimulation Autoimmunität33 und die Entdeckung der vermitteln kann die Developmental Weg für Th17 Differenzierung34 wurden erstmals beschrieben mit EAE Mausmodellen. Mit der Maus-Modell der ATCA, die wir entwickelt haben, muss man nun die Mittel zur Entwicklung und Regulierung der pathogenen AQP4-spezifische Immunantworten in vivo Studie die wichtige Erkenntnisse im Zusammenhang mit NMO Pathogenese bieten sollte.

Neuromyelitis Optica (NMO) ist ein zentrales Nervensystem (ZNS) entzündliche demyelinisierende Autoimmunerkrankung, die wiederkehrende Episoden von Lähmung und Sehverlust führt zu dauerhafter neurologischer Behinderung1verursacht. NMO gilt heute in erster Linie auf eine humorale Autoimmunerkrankung2 sein, da sie Antikörper (Igs) gezielt Aquaporin-4 (AQP4), einem Wasserkanal ausgedrückt reichlich am Astrozyten3,4zugeordnet ist. CNS Entzündung ist jedoch eine Voraussetzung für CNS-Eintrag von AQP4 Ig5,6. So war es nicht möglich, ein Modell der NMO durch Übertragung von Anti-AQP4 Igs allein zu etablieren. Die Ergebnisse, dass (1) Pathogene AQP4-spezifische Igs in NMO Patienten IgG11,2sind, ist eine T-Zell-abhängigen Ig Unterklasse7 (2) T-Zellen in NMO Läsionen8,9 (3) NMO identifiziert werden verbunden mit bestimmten MHC-II-Gene (z. B. HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10und (4) proinflammatorischen AQP4-reaktive DR-eingeschränkte Th17 Zellen werden in NMO Patienten11,12 alle erweitert geht hervor, dass AQP4-spezifischen T-Zellen eine wichtige Rolle in NMO Pathogenese. Daher ist es wichtig, entwickeln Tiermodelle um festzustellen, wie AQP4-spezifischen T-Zellen zur NMO Pathogenese beitragen können.
Vor einigen Jahren wurden mehrere AQP4 T Zelle Epitope in Wildtyp (WT) Mäuse13,14 und Ratten15identifiziert. Während es beobachtet wurde, dass AQP4-reaktive T-Zellen Opticospinal Entzündung im naive Empfänger Ratten15,16auslösen könnte, wurden deutliche klinische Anzeichen der CNS Krankheit nicht beobachtet. In ähnlicher Weise direkte Immunisierung von Mäusen, WT mit Peptiden mit AQP4 T Zelle Epitope14,17, oder Übertragung von proinflammatorischen T-Zellen gezielt jene Determinanten17, nicht die Ursache für klinische Symptome oder histologische Nachweis der CNS Autoimmunität.
Vor kurzem, es wurde beobachtet, dass Immunisierung von Mäusen C57BL/6 AQP4-defizienten (AQP4- / -) mit AQP4-Peptid (p) 135-153 oder p201-220, zwei Determinanten binden MHC-II (I-A-b) voraussichtlich mit hoher Affinität18, löste starke CD4 + T-Zell-Antworten-17. Im Gegensatz dazu löste diese zwei Peptide nur bescheidene proliferative Reaktionen bei WT-Mäusen. Darüber hinaus war der T-Zell-Rezeptor (TCR) Repertoire zur Anerkennung dieser Determinanten von T-Zellen von AQP4- / - Mäusen einzigartig. Diese Feststellungen zufolge gemeinsam Zebrafischembryonen negative Auslese T Zelle Anerkennung von AQP4 geregelt ist. AQP4 p135-153 oder p201-220-spezifische Th17 Zellen von AQP4- / - Spender Mäusen induzierte Paralyse in fast 100 % der naive Empfänger WT Mäuse; Dies war verbunden mit Opticospinal Infiltrate von T-Zellen, B-Zellen und Monozyten. Serielle Opticospinal Kohärenztomografie (OCT) demonstriert dynamische visuelle System Beteiligung. Mäuse mit T-Zell-vermittelten AQP4-bezogene CNS Autoimmunität (ATCA) von Lähmung und visuelles System Verletzungen erholt. Im Gegensatz zu EAE induziert durch Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG) p35-55-spezifische T-Zellen, was zu persistent klinischen Erkrankung führte, war ATCA induziert durch T-Zellen allein nicht axonalen Verlust oder Reduzierung der retinalen Ganglienzellen (Routinggruppenconnectors) zugeordnet. Unsere Ergebnisse haben deutlich gezeigt, dass gibt es mehrere Pathogene AQP4 T Zelle Determinanten. Dieses neue Modell der ATCA eignet sich für die Untersuchung der Mechanismen, die Entwicklung der pathogenen AQP4-spezifischen T-Zellen, lernen, wie diese Zellen CNS Entzündung auslösen und wie sie zusammenarbeiten können, mit AQP4-spezifische B-Zellen und Antikörper, NMO Pathogenese zu fördern .
In diesem Bericht beschreiben wir die verwendeten Protokolle zum induzieren und T-Zell-induzierte ATCA zu bewerten. Wir beginnen mit den Techniken für Immunisierung, T-Zell-Kultur und Th17 Polarisation zur Erzeugung von pathogener AQP4-spezifischen T-Zellen, Flow-Zytometrie-Analyse, Polarisation und Adoptiveltern Übertragung dieser T-Zellen zu bestätigen. Wir beschreiben dann Methoden zur Bewertung von klinischen und histologischen Krankheit und die Verwendung von seriellen OCT, visuelle System Verletzungen im Empfänger Mäuse zu überwachen.

<table><tbody><tr><td>M. tuberculosis H37Ra</td><td>BD Difco</td><td>231141</td><td>Ausgetrocknet, getötet M. tuberculosis</td></tr><tr><td>unvollständiges Freund's Adjuvans</td><td>BD Difco</td><td>263910</td><td></td></tr><tr><td>AQP4 Peptid p135-153</td><td>Genemed</td><td>Benutzerdefinierte Synthese</td><td>Peptidsequenz: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN</td></tr><tr><td>AQP4 Peptid p201-220</td><td>Genemed</td><td>Custom Synthesis</td><td>Peptidsequenz: HLFAINYTGASMNPARSFGP</td></tr><tr><td>MOG Peptid p35-55</td><td>Genemed / Auspep</td><td>Custom Synthesis</td><td>Peptidsequenz: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td></tr><tr><td>3-Wege Stopcock</td><td>Kimble</td><td>420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fetal Rinderserum (charakterisiert)</td><td>GE Gesundheitswesen</td><td>Biowissenschaften SH30071</td><td></td></tr><tr><td>rekombinante Maus IL-23</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>1887-ML</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus IL-6</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus IL-12</td><td>R& D Systems (BioTechne)</td><td>419-ML</td><td></td></tr><tr><td>Thymidin [Methyl-3H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET027</td><td></td></tr><tr><td>Glasfaser-Filtermatten</td><td>PerkinElmer</td><td>1450-421</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-Antikörper</td><td>eBioscience (Affymetrix)</td><td>[diverse]</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-TCR V&beta; Screening-Panel</td><td>BD Biosciences</td><td>557004</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixierbarer Fleck für tote Zellen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>[various]</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (16%)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Fixations-/Permeabilisierungslösungskit mit GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Iomomycin (Calciumsalz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Pertussis-Toxin aus B. pertussis</td><td>List Biological Laboratories</td><td>181</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalin</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe mit variablem Durchfluss</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td></td></tr><tr><td>Schaumstoff-Biopsie-Pads, rechteckig</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-221</td><td></td></tr><tr><td>Isothesie (Isofluran, USP)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>050033</td><td>NDC : 11695-0500-2</td></tr><tr><td>Tropicamid Ophthalmic Solution, USP (1%)</td><td>Akorn</td><td></td><td>NDC: 17478-102-12</td></tr><tr><td>Spectralis Diagnostic Imaging Platform</td><td>Heidelberg Engineering</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

induktion von lähmung und visuelles system verletzungen bei mäusen durch t-zellen spezifisch für neuromyelitis optica autoantigen aquaporin-4

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

Während es erkannt wird, dass Aquaporin-4 (AQP4)-spezifischen T-Zellen und Antikörper zu beteiligen, in der Pathogenese der Neuromyelitis Optica (NMO), menschliche Zentralnervensystem (ZNS) demyelinisierende Autoimmunerkrankung, Schaffung eines Modells AQP4 gezielt mit den beiden klinische und histologische Manifestationen von CNS Autoimmunität bewährt herausfordernd. Immunisierung der Wildtyp (WT) Mäuse mit AQP4 Peptide löste T-Zell-Proliferation, obwohl diese T-Zellen nicht Krankheit auf naive Empfänger Mäuse übertragen könnte. Vor kurzem, zwei Roman AQP4 T Zelle Epitope, Peptid (p) 135-153 und p201-220, wurden identifiziert als Studium Immunantworten auf AQP4 in AQP4-defizienten (AQP4- / -) Mäuse, was auf T-Zell-Reaktivität auf diese Epitope normalerweise durch Zebrafischembryonen gesteuert wird negative Auslese. AQP4- / - Th17 polarisiert T-Zellen grundiert, p135-153 oder p201-220 induzierte Paralyse im Empfänger WT Mäuse, die überwiegend Leptomeningeal Entzündung des Rückenmarks und des Sehnerven zugeordnet war. Umliegenden Sehnerven Entzündung und Beteiligung der Netzhaut Innenlagen (IRL) wurden durch Änderungen in serielle Optische Kohärenztomografie (OCT) manifestiert. Hier zeigen wir die Ansätze zur Erstellung dieses neue in-Vivo -Modell von AQP4-bezogene CNS Autoimmunität (ATCA), die jetzt eingesetzt werden können, um Mechanismen zu studieren, die Entwicklung der pathogenen AQP4-spezifischen T-Zellen und wie sie mit B zusammenarbeiten können zulassen Zellen in der Pathogenese der NMO.

In diesem Protokoll verwendeten wir Spenderzellen T von C57BL/6 AQP4- / - Mäusen. Subkutane Immunisierung von diesen Mäusen mit AQP4 p135-153 oder p201-220, die pathogenen T-Zell-Epitope enthalten, löste starke proliferative T-Zell-Reaktionen in Lymphknoten (Abbildung 1), während diese beiden Peptide viel schwächeren T-Zellen induziert Verbreitung in WT-Mäuse. Im Vergleich, Immunisierung mit AQP4 p91-110, die ein nicht-pathogenen AQP4 T Zelle bestimmende13oder MOG p35-55, ein Myelin-Peptid, die T-Zellen aktiviert, die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE)22,23 verursachen ,24, induzierte ähnlichen Größenordnung der T-Zell-Proliferation in AQP4- /- und WT-Mäuse. Analyse der TCR Auslastung von Flow Cytometry Färbung für individuelle Vβ oder Vβ Familien gezeigt, dass p135-153 und p201-220-spezifische T-Zellen von AQP4- / - Mäusen einzigartige TCR Repertoire genutzt. Selektive hyper-Proliferation von AQP4 p135-153 und p201-220 in AQP4- / - Mäusen, sowie die einzigartige TCR Auslastung (Abbildung 2), darauf hingewiesen, dass die pathogenen T-Zell-Reaktionen zu dieser Determinanten wird normalerweise durch Zebrafischembryonen negativ reguliert Auswahl, unterstreicht die Bedeutung für die Verwendung von AQP4- / - Spender T-Zellen in diesem Protokoll.
Vor Adoptiv Übertragung für die Induktion von ATCA waren Lymphknotenzellen von AQP4 Peptid-vorbereitete Mäusen Th17 oder Th1 polarisierenden Bedingungen für drei Tage in vitro kultiviert. Das Ausmaß der Polarisierung des Spenders CD4+ T Zellen bestätigt durch intrazelluläre Zytokin Färbung (ICS) und Durchflusszytometrie (Abbildung 3) gemessen wurde. Naive Empfänger Mäuse wurden mit 2 x 107 Spender AQP4-Peptid-spezifischen T-Zellen intravenös injiziert. Nach etwa sechs Tagen entwickelt fast 100 % der Empfänger Mäuse klinische Anzeichen von CNS Autoimmun-Krankheit, einschließlich schlaff Hind Leib und Schweif Lähmung (Abbildung 4). TH17-polarisierten AQP4-spezifischen T-Zellen induziert schwerere klinische Krankheit als Th1-polarisierte AQP4-spezifischen T-Zellen. Video 1zeigt eine repräsentative Maus, die Th17 AQP4-Peptid-spezifische erhalten und entwickelt komplette Hind Extremität Lähmung (Paraplegie). Im Gegensatz zu Mäusen, die EAE nach Verabreichung von MOG-spezifische Th17-Zellen entwickelt, erholte sich Empfänger Mäuse von klinischen Erkrankung durch AQP4-spezifische Th17-Zellen induziert. Wie bei EAE durch MOG p35-55-spezifische Th17 Zellen induziert klinische Krankheit induziert durch AQP4 p135-153-spezifische oder p201-220-spezifische Th17 Zellen wurde im Zusammenhang mit Infiltration von mononukleären Zellen im CNS Parenchym und Hirnhaut (Abbildung 5). Läsionen waren häufiger in der Hirnhäute als in das Parenchym für CNS Autoimmunität durch AQP4-spezifische Th17-Zellen induziert.
Sehnerv Beteiligung zeigte sich durch histologische Auswertung und von seriellen OCT. AQP4-spezifische und MOG-spezifische Th17 Zellen beide induzierte Sehnerv Entzündung, die durch Anwesenheit von mononukleären Zellen gekennzeichnet war. Während AQP4-spezifische Th17 Zellen faseroptische Perineuritis verursacht, induziert MOG-spezifische Th17-Zellen schwere Optikusneuritis (Abbildung 5). Mit seriellen OCT, Sehnerv Entzündung zeigte sich durch Schwellungen und erhöhte innere Netzhaut (IRL) Schichtdicke für klinische Krankheit induziert durch AQP4-spezifische oder MOG-spezifische Th17 Zellen (Abbildung 6). Für CNS AQP4 Th17-induzierte Autoimmunität, IRL Dicke wieder zum Ausgangswert als Mäuse von klinischen Erkrankung erholt. Im Gegensatz dazu Persistenz von EAE induziert durch MOG-spezifische Th17 korrespondierte mit IRL Ausdünnung und wie wir bisher17, nachgewiesen wurde im Zusammenhang mit Verlust von retinalen Ganglienzellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : AQP4 p135-153 und p201-220 entlocken robuste T-Zell-Proliferation in AQP4- / - Mäuse, aber nicht WT Mäuse. Mäuse wurden immunisiert s.c. mit der angegebenen Peptide in CFA. Elf Tage später, wurden Lymphknoten entfernt, und dann gezüchtet mit entweder kein Antigen oder das Peptid für Immunisierung verwendet. Verbreitung wurde durch 3H-Thymidin Einbau (Mittelwert ± SEM, Vertreter von 5 Experimenten) gemessen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : AQP4-spezifischen T-Zellen von AQP4- / - Mäusen nutzen einzigartige TCR Repertoire. AQP4- /- und WT-Mäusen wurden mit den angegebenen Peptide immunisiert. Elf Tage später, wurden Lymphknoten entfernt und mit Peptid zur Immunisierung kultiviert. Zellen wurden geerntet. TCR Vβ Nutzung wurde durch Durchflusszytometrie analysiert (meine ± SEM, n = 5). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig3.jpg"> 
Abbildung 3 : Proinflammatorischen Polarisierung der Spenderzellen AQP4-spezifischen T. Elf Tage nach der Immunisierung mit AQP4 p135-153 oder p201-220, wurden Lymphknotenzellen geerntet und mit das Peptid zur Immunisierung in nicht polarisierenden Bedingungen, Th1 oder Th17-polarisierende Art kultiviert. TH17 oder Th1 Polarisation wurde von ICS und Flow Cytometry für IL-17 oder IFN-γ, untersucht. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig4.jpg"> 
Abbildung 4 : Th17-polarisierten AQP4-spezifischen T-Zellen induzieren Lähmung im Empfänger Mäuse WT. WT Empfänger Mäuse erhielt 2 x 107 Spender Th17-polarisierten AQP4 p135-153 oder p201-220-spezifische T-Zellen von AQP4- / - Mäusen. TH17-polarisierten MOG-spezifischen T-Zellen als positive Kontrolle diente. Ergebnisse sind repräsentativ für 8 Experimente (n = 5/Gruppe). * p &#60; 0,05, ** p &#60; 0,01, *** p &#60; 0,001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig5.jpg"> 
Abbildung 5 : AQP4-spezifische Th17-Zellen induzieren Opticospinal Entzündung bei Mäusen WT. Empfänger Mäuse erhielten 2 x 107 Spender Th17 AQP4 p135-153 - oder p201-220-grundiert Th17 Zellen von AQP4- / - Mäusen oder Th17 MOG p35-55-spezifische und 10 Tage später geopfert wurden. Rückenmark und Sehnerven Gewebe wurden vorbereitet und befleckt mit H &#38; E/LFB auf Anzeichen von Entzündungen und Demyelinisierung bewerten, beziehungsweise. Ergebnisse sind repräsentativ für 5 Mäuse/Gruppe. Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig6.jpg"> 
Abbildung 6 : Sehnerv Entzündung durch AQP4-spezifische Th17-Zellen induziert durch longitudinale retinalen Okt. überwacht werden kann WT Empfänger Mäuse erhielten 2 x 107 Spender Th17-polarisierten AQP4 p201-220-spezifische oder MOG p35-55-spezifische T-Zellen am Tag 0. Sie wurden von OCT am Tag 0 (vor der Verabreichung von T-Zellen) geprüft und dann an Tagen 4, 7, 8, 9, 10, 11 14 und 21. IRL-Dicke wurde gemessen (Mittelwert ± SEM). Statistiken zeigen einen Vergleich mit naiv-Steuerung. Ergebnisse sind repräsentativ für 3 Versuche (5 Mäuse/Gruppe). * p &#60; 0,05, ** p &#60; 0,01, *** p &#60; 0,001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Lähmung und Opticospinal Entzündung durch Übertragung von Aquaporin-4 (AQP4) induzieren-spezifischen T-Zellen von AQP4- / - Mäusen in WT-Mäuse. Darüber hinaus führen wir serielle optische Kohärenztomographie verwenden, um visuelle System Funktionsstörung zu überwachen.

Induktion von Lähmung und visuelles System Verletzungen bei Mäusen durch T-Zellen spezifisch für Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Die allgemeinen Ziele dieses Protokolls bestehen darin, eine Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS) durch adoptive Übertragung von auf Aquaporin 4 spezifischen T-Zellen auszulösen und die daraus resultierenden Auswirkungen auf das zentrale Nervensystem sowie auf das dynamische Sehsystem zu überwachen. Diese Methode trägt dazu bei, zentrale Fragen zur Rolle von auf Aquaporin 4, allgemein bekannt als AQP4, spezifischen T-Zellen bei der Neuromyelitis optica sowie bei anderen entzündlichen Sehstörungen zu beantworten. Der entscheidende Vorteil der optischen Kohärenztomographie liegt in der Möglichkeit, Verletzungen der Netzhaut auf nichtinvasive Weise über einen längeren Zeitraum hinweg zu verfolgen.Den Ablauf wird Sharon Sagan, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin in meinem Labor, sowie Andreas Cruz Harans, ein Fellow im Labor von RE Green, demonstrieren. Befestigen Sie zunächst einen dreifachen Nylon-Hahn mit zwei männlichen Luer-Lock-Anschlüssen an einer Glas-Luer-Lock-Spritze ohne Kolben. Stellen Sie den Hahnhebel in Richtung der Spritze, um den Hahn zu schließen, und positionieren Sie die Spritze mit dem offenen Ende nach oben. Nach dem Wirbeln eine gleiche Menge Peptid und Complete Freund's Adjuvant-Lösung in die Spritze geben und den Glasstopfen wieder in die Spritze einsetzen. Den Stopfen festhaltend, die Spritze umdrehen, sodass der Hahn nach oben zeigt, und den Hebel auf die unbenutzte weibliche Anschlussstelle umstellen. Den Stopfen vorsichtig niedrücken, um die überschüssige Luft aus der Spritze zu entfernen.Die Lösung füllt die zweite männliche Luer-Lock-Verbindung des Hahns. Anschließend eine zweite Glasspritze mit vollständig eingeführtem Kolben in die zweite männliche Luer-Lock-Verbindung einsetzen. Um eine Emulsion zu erzeugen, die Kolben abwechselnd niedrücken, um die Lösung etwa zwei Minuten lang zwischen den beiden Spritzen hin und her zu bewegen, und danach die Lösung etwa 10 Minuten lang kühlen, bis eine sichtbare Änderung der Viskosität der Lösung eintritt.Wenn sich eine sehr zähe weiße Emulsion bildet, überführen Sie die gesamte Lösung in eine der Spritzen und ersetzen Sie die leere Spritze durch eine neue Ein-Milliliter-Luer-Lock-Spritze. Füllen Sie die neue Spritze mit der Emulsion. Nehmen Sie die Spritze vom Hahn ab und befestigen Sie eine 25-Gauge-Nadel.Um die Emulsion auf Konsistenz zu testen, eine Tropfen der Emulsion in eine kleine Schale mit Wasser abgeben. Wenn sich die Emulsion nicht verteilt, ist sie zur Injektion geeignet. Anschließend jedes spendende AQP4-Knockout-Maus einmalig subkutan in jede Seite des unteren Bauchbereichs und in jede Seite der Brustwand medial zur Achselhöhle injizieren.10 bis 12 Tage nach der Immunisierung einen medianen Schnitt in der Haut vom Leistenbereich bis zum Hals und entlang jedes Beins der ersten Maus durchführen. Die Haut vom Peritoneum lösen und straff auf einem Brett fixieren. Anschließend die inguinalen und axillären Lymphknoten entnehmen und das Gewebe in einen Zellfilter in einer Petrischale mit komplettem Medium geben.Nachdem alle Lymphknoten gesammelt wurden, das Zellsieb auf ein 50-Milliliter-Konischgefäß mit frischem vollständigem Medium auf Eis stellen und das flache Ende eines sterilen 5-Milliliter-Spritzenstößels verwenden, um die Lymphknotenzellen durch die Siebmembran zu drücken. Die Membran mit 20 bis 30 Millilitern vollständigem Medium spülen, um die Zellgewinnung zu erleichtern, gefolgt von zwei Zentrifugationswäschen. Nach der zweiten Zentrifugation das Pellet in T-Zell-Medium zur Zellzählung resuspendieren.Fügen Sie die entsprechenden Konzentrationen des Antigens, rekombinantes Maus-Interleukin-23 und rekombinantes Maus-IL-6 zu den Zellen hinzu und geben Sie zwei Milliliter Zellen pro Vertiefung dieser Th17-polarisierenden Mischung in jede Vertiefung einer 12-Loch-Platte. Anschließend stellen Sie die Platte 72 Stunden lang in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2. Am dritten Polarisierungstag pipettieren Sie die Kulturen in jeder Vertiefung mehrmals auf und ab, um die polarisierten Zellen zu lösen, und sammeln sie in einem 50-Milliliter-Konischgefäß auf Eis zur Zellzählung.Nach zwei Waschungen in PBS verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von einer mal 10 hoch acht Zellen pro Milliliter in PBS und mischen die Zellsuspension vorsichtig durch Schwenken. Innerhalb einer Stunde nach ihrer Gewinnung überführen Sie die Zellen in eine Ein-Milliliter-Spritze und verabreichen jedem Empfängertier 200 Mikroliter Zellen intravenös über die Schwanzvene. Anschließend injizieren Sie jeder Maus unmittelbar und zwei Tage später 200 Nanogramm B-Pertussis-Toxin, das in 200 Mikrolitern PBS verdünnt ist, intraperitoneal.Um eine in-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Empfängertiere mittels optischer Kohärenztomographie durchzuführen, weiten Sie fünf Minuten vor der Bildgebung die Pupillen mit einem Tropfen 1 % Tropicamid pro Auge und schalten Sie die Heizmatte ein. Stellen Sie die Maus auf den Bildgebungs-Zylinder und leiten Sie den Anästhesiestrom entsprechend um. Schützen Sie die Augen mit 0,3 % Hydroxypropylmethylcellulose, um sie feucht zu halten und eine kontinuierliche Lichtbrechung sicherzustellen, und platzieren Sie eine speziell angefertigte Kontaktlinse auf dem zu untersuchenden Auge.Gestützt durch das infrarote Fundusbild lenken Sie den Laser auf das mit einer Linse bedeckte Auge, wobei darauf zu achten ist, dass der Strahl auf dem Sehnervenkopf zentriert ist. Führen Sie 25 B-Scans im Hochauflösungsmodus durch und rastern Sie die Bilder aus 30 gemittelten A-Scans. Nach der Bildgebung beider Augen ersetzen Sie die Kontaktlinse durch Augengel und stellen die Maus in einen warmen Erholungskäfig.Um die gewonnenen Bilder mithilfe der modularen Bildanalyse-Software für die automatisierte Segmentierung auszuwerten, korrigieren Sie zunächst manuell die Segmente, die der inneren Begrenzungsmembran und der inneren Plexiformschicht entsprechen, um die Grenzen der inneren Netzhautschichten darzustellen. Überprüfen Sie anschließend, ob die Nervenfaserschicht und die Ganglienzellschicht innerhalb der Grenzen der inneren Netzhautschicht liegen und sich nicht überlappen. Eine subkutane Immunisierung mit AQP4-Peptiden, die pathogene T-Zell-Epitope enthalten, führt im Vergleich zu Wildtyp-T-Zell-Antworten bei AQP4-Knockout-Mäusen zu starken proliferativen T-Zell-Antworten in den drainierenden Lymphknoten.Die Durchflusszytometrie-Analyse der einzelnen V-Beta-Expression zeigt, dass T-Zellen, die spezifisch für AQP4-Peptide sind und pathogene T-Zell-Epitope enthalten, einzigartige TCR-Repertoires nutzen und eine selektive Hyperproliferation aufweisen, was darauf hindeutet, dass pathogene T-Zell-Antworten gegen diese Determinanten normalerweise durch die negative Selektion im Thymus reguliert werden. Ungefähr sechs bis neun Tage nach der Injektion polarisierter T-Zellen entwickelten nahezu alle empfängenden Mäuse klinische Anzeichen einer autoimmunen Erkrankung des ZNS, einschließlich schlaffer Schwanzlähmung und Lähmung der Hintergliedmaßen. Th17-polarisierte, AQP4-spezifische T-Zellen verursachten dabei eine schwerere klinische Erkrankung als Th1-polarisierte, AQP4-spezifische T-Zellen.Beispielsweise entwickelte diese Maus eine vollständige Lähmung der Hintergliedmaßen nach der Verabreichung von Th17-polarisierten, AQP4-Peptid-spezifischen T-Zellen. Die durch AQP4-Peptid-spezifische Th17-Zellen ausgelöste klinische Erkrankung ist ebenfalls mit einer Infiltration mononukleärer Zellen in das ZNS-Gewebe und die Meningen sowie mit einer Entzündung des Sehnervs assoziiert, was sich unter anderem in einer Schwellung und Zunahme der Dicke der inneren Netzhautschicht zeigt, die sich wieder normalisiert, wenn die Mäuse sich von der Erkrankung erholen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine auf AQP4 gerichtete Autoimmunität auslöst und überwacht, was weitere Untersuchungen ermöglicht, um zu verstehen, wie T-Zellen an der Neuromyelitis optica beteiligt sind.

induction-paralysis-visual-system-injury-mice-t-cells-specific-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Das Video zeigt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell durch Injektion einer Kombination aus Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinen und inaktiviertem Mycobacterium tuberculosis. Das Modell ermöglicht es Forschenden, Krankheitsmechanismen zu untersuchen und therapeutische Interventionen zu testen.

Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

Dieses Video zeigt die Methode zur Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) durch Injektion von Myelin-abgeleiteten Peptiden mit einem Adjuvans, um autoreaktive T-Zellen zu aktivieren, die ins Gehirn wandern. Pertussis-Toxin wird verabreicht, um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass diese T-Zellen und andere Immunzellen in das Gehirn eindringen können. Diese Immunzellen verursachen eine Demyelinisierung, die zu einer gestörten...

Generierung einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

In diesem Video wird ein Mausmodell für Multiple Sklerose mit Hilfe der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) erstellt. Der Maus wird eine Emulsion injiziert, die ein neuronales Peptid und ein Adjuvans enthält, wodurch eine Immunantwort ausgelöst wird, die autoreaktive T-Zellen aktiviert. Darauf folgt eine Injektion von Pertussis-Toxin (PTX), um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass die autoreaktiven T-Zellen das Gehirn infiltrieren können. Diese...

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Induktion von Lähmungen durch Übertragung von aktivierten Th17-Zellen, die auf Aquaporin-4 abzielen, in ein Mausmodell. Im zentralen Nervensystem interagieren die aktivierten Th17-Zellen mit Aquaporin-4-exprimierenden Astrozyten und lösen eine Immunantwort aus, die bei der Maus zu einer Lähmung von Schwanz und Gliedmaßen führt.

Induktion von Lähmungen in einem Mausmodell durch Transfer von Aquaporin-4-spezifischen Th17-Zellen

Dieses Video zeigt den Prozess der Beurteilung der motorischen Dysfunktion in einem Mausmodell durch die Verabreichung von Pertussis-Toxin und einem Inokulum, das Myelin-imitierende Peptide und Adjuvantien enthält, gefolgt von Laufbandtests, um die motorische Funktion zu beurteilen und die daraus resultierenden Nervenschäden aufgrund von Immunaktivierung und Demyelinisierung zu bewerten.

Bewertung der motorischen Funktion in einem experimentellen Mausmodell für Autoimmunneuritis

Wir beschreiben eine Methode zur Implantation und Aufrechterhaltung von Glasfenstern über dem freiliegenden Rückenmark erwachsener Mäuse zur Untersuchung der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis. Diese Fenster bieten einen chronischen optischen Zugang zum Rückenmark zur Überwachung der Zelldynamik auf subzellulärer Ebene bei lebenden Tieren mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Implantation von gläsernen Rückenmarksfenstern bei erwachsenen Mäusen mit experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zur Induktion und Bewertung des experimentellen Modells der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), zusammen mit der Beurteilung der Immunzellverteilung und der mRNA-Zytokinspiegel in Lymphknoten, Milz, Blut und Rückenmark mittels Durchflusszytometrie bzw. quantitativer PCR in verschiedenen Krankheitsstadien.

Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben

Dieser Bericht beschreibt einen einfachen Ansatz, um erfolgreich experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) mit dem Myelin Protein zero (P0)180-199 Peptid in Kombination mit Freunds kompletten Adjuvans und Pertussis-Toxin zu induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine ausgereifte Paradigma in der Lage, präzise Bewertung des Ausmaßes der funktionelle Defizite und Neuropathologie, die in diesem EAN auftreten.

Ein einfacher Ansatz, experimentelle Autoimmune Neuritis bei C57BL/6 Mäusen für funktionale und neuropathologische Bewertungen zu induzieren

Zellbasierte Assays ist eine weit verbreitete Methode zur Erkennung von Serum Anti-Aquaporin-4 Immunglobulin G. Diese Methode könnte auf klinische Diagnose und wissenschaftlichen Forschungen der Neuromyelitis-optisches Spektrum-Störungen angewendet werden.

Humanem Serum Anti-Aquaporin-4 Immunglobulin G Erkennung durch zellbasierte Assays

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell unter Verwendung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die Überwachung des Krankheitsprozesses mit einem klinischen Scoring-System. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis-bezogene Symptome werden mittels Mausfemur-Mikro-Computertomographie und Freilandtest analysiert, um den Krankheitsprozess umfassend zu beurteilen.

Induktion und diverse Bewertungsindikatoren der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Tiermodell für Multiple Sklerose (MS), das mit der menschlichen Krankheit eine robuste humorale Autoimmunreaktion teilt. In dieser Arbeit berichten wir über ein einfaches und flexibles ELISA-Protokoll zur Quantifizierung von Autoantikörpern im Serum von EAE-immunisierten Mäusen.

Quantifizierung autoreaktiver Antikörper in Mäusen nach experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Erfahren Sie, wie Sie durch adoptiven Transfer von AQP4-spezifischen T-Zellen eine autoimmne ZNS-Erkrankung bei Mäusen induzieren und mittels optischer Kohärenztomographie das visuelle System nichtinvasiv überwachen.

Induktion von Lähmung und visuelles System Verletzungen bei Mäusen durch T-Zellen spezifisch für Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4 (Video) | JoVE Journal

Induktion von Lähmung und visuelles System Verletzungen bei Mäusen durch T-Zellen spezifisch für Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

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