Name: Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Lernen Sie ein ChIP-Protokoll für Low-Fülle embryonale Proben zur Analyse von Histonmodifikationen in Hühnerembryonen. Diese Methode ermöglicht epigenomische Profile mit minimalem Materialaufwand.

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Die Autoren danken Jan Appel für seine hervorragende technische Unterstützung bei der Schaffung dieses Protokolls. Die Arbeit im Labor Rada-Iglesias stützt sich auf CMMC intramuralen Finanzierung, DFG Research Grants (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 und TE 1007/3-1), Gruppe der UoC fortgeschrittene Forscher Grant und CECAD Grant.

<ol><li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin.+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Characterization of human epigenomes.</a> Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Roadmap Epigenomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Benayoun, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4me3+breadth+is+linked+to+cell+identity+and+transcriptional+consistency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency.</a> Cell. 158 (3), 673-688 (2014).</li>
<li>Rehimi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics-Based+Identification+of+Major+Cell+Identity+Regulators+within+Heterogeneous+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations.</a> Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Valouev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+based+on+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data.</a> Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).</li>
<li>Dahl, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+histone+H3K4me3+domains+in+mouse+oocytes+modulate+maternal-to-zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.</a> Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+reprogramming+of+the+histone+modification+H3K4me3+in+early+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.</a> Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dynam%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).</li>
<li>Ho, J. W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+metazoan+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of metazoan chromatin organization.</a> Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).</li>
<li>Calo, E., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+enhancer+chromatin%3A+what%2C+how%2C+and+why%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?</a> Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).</li>
<li>Spitz, F., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors%3A+from+enhancer+binding+to+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcription factors: from enhancer binding to developmental control.</a> Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren müssen keine finanzielle Interessenkonflikte offen gelegt werden.

Epigenomischen Profilierung der Histon-Modifikation mit ChIP-Seq kann verwendet werden, zur Verbesserung der funktionellen Annotations vertebrate Genom in verschiedenen zellulären Kontexten4,5,18. Diese epigenomischen-Profile eingesetzt werden, unter anderem um zu identifizieren, Enhancer-Elemente, um die rechtliche Definition des Enhancer (d. h. aktiv, grundiert, oder bereit) und großen Zelle Identität Regulierungsbehö...

Post-translationalen Modifikationen der Histone sind verschiedene Chromatin-abhängige Prozesse, einschließlich Transkription, Replikation und DNA-Reparatur1,2,3direkt beteiligt. Darüber hinaus verschiedene Histon Änderungen zeigen positive (z. B. H3K4me3 und H3K27ac) oder negativ (z. B. H3K9me3 und H3K27me3) Korrelationen mit Genexpression und kann im großen und ganzen definiert als aktivierende oder repressive Histon markiert, bzw.2,3. Infolgedessen sind globale Histon Änderung Karten, auch bezeichnet als epigenomischen Karten als mächtiges und universelles Werkzeug funktionell vertebrate Genom4,5Anmerkungen zu entstanden. Z. B. distalen regulatorische Sequenzen wie Enhancer identifiziert werden können abhängig vom Vorhandensein von spezifischen Chromatin Unterschriften (z. B. aktive Enhancer: H3K4me1 und H3K27ac), die von proximalen Promoter-Regionen unterscheiden (z.B. aktive Promotoren: H3K4me3)6,7,8. Auf der anderen Seite befinden sich Gene mit großen Zelle Identität regulatorische Funktionen in der Regel mit breiten Chromatin Domains mit H3K4me3 oder H3K27me3, abhängig vom Status der zugrunde liegenden Gene transcriptionally aktiv oder inaktiv gekennzeichnet bzw.9 ,10. Ebenso scheint der Ausdruck der großen Zelle Identität Gene häufig von mehreren und räumlich gesteuert werden gruppierten Enhancer (d. h. Super-Enhancer), die als breite H3K27ac versehenen Domänen11identifiziert werden können.
Derzeit entstehen Histon Änderung Karten mit ChIP-Seq-Technologie, bietet im Vergleich zu bisherigen Ansätzen wie ChIP-Chip (ChIP mit Microarrays gekoppelt) höheren Auflösung, weniger Artefakte, weniger Lärm, mehr Reichweite und geringer kostet12. Dennoch hat die Generation der epigenomischen-Karten mit ChIP-Seq-Technologie seiner inhärenten Einschränkungen, meist verbunden mit der Fähigkeit, erfolgreich ChIP in den Proben von Interesse zu erfüllen. Traditionellen ChIP Protokolle benötigt in der Regel Millionen von Zellen, welche Grenzen der Anwendbarkeit dieser Methode zur in-vitro- Zelle Zeilen oder Zellen, die isoliert in Vivo (z. B. Blutzellen) problemlos. In den letzten Jahren wurden eine Reihe von modifizierten ChIP-Protokollen kompatibel mit niedrigen Zellzahlen beschrieben13,14,15,16. Aber diese Protokolle sind speziell mit Next Generation Sequencing (z.B. ChIP-Seq) gekoppelt werden, und in der Regel verwenden sie ad-hoc- Bibliothek Vorbereitung Methoden13,14, 15 , 16.
Wir beschrieben hier ein ChIP-Protokoll, das verwendet werden kann, zu untersuchen, Histon-Änderung-Profile mit niedrigen bis mittleren Zellzahlen (5 x 104 - 5 x 105 Zellen) an beiden ausgewählten Loci (z.B. ChIP-qPCR) oder Global (d. h. ChIP-Seq) (Abbildung 1). Wenn ChIP-Seq-Technologie gekoppelt, kann unser ChIP-Protokoll zusammen mit Standardbibliothek Zubereitungsmethoden, wodurch es allgemein zugänglich, viele Labors10verwendet werden. Dieses Protokoll wurde verwendet, um mehrere Histon-Marken untersuchen (z. B. H3K4me3, H3K27me3 und H3K27ac) in verschiedenen Huhn embryonalen Geweben (z. B. spinale Neuralrohr (SNT), frontonasalen Protuberanzen und Epiblast). Allerdings erwarten wir, dass es breit anwendbar auf andere Organismen sein sollte, in denen biologisch bzw. klinisch relevante Proben nur in geringen Mengen erreicht werden können.

<table><tbody><tr><td>ReagenzBSA-Pulver</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Carl Roth</td><td>3737.3</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat-Kochsalzpuffer (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL pH 8.0</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-Desoxycholat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750-24</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>61743-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Applichem</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Carl Roth</td><td>3739.2</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>1833</td><td></td></tr><tr><td>Protein G/magnetische Kügelchen</td><td>Invitrogen</td><td>1004D</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Peqlab</td><td>12-RA-03</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46,35 E</td><td></td></tr><tr><td>Na-Butyrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>SLB2659V</tr><tr><td>Proteinase-Hemmer</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>SYBRgreen Mix</td><td>biozym</td><td>617004</td><td></td></tr><tr><td>dH2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Leiter</td><td>Thermofisher</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma Alrich</td><td>03756-25</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Octylphenolethoxylat (Triton x 100)</td><td>Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&akut; s Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Ladespitzen Multiflex</td><td>A.Hartenstein</td><td>GS21</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Platten</td><td>Sarstedt</td><td>721.985.202</td><td></td></tr><tr><td>384 well</td><td>Sarstedt</td><td>721.985.202</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1.000 &micro; L Filterspitzen</td><td>Sarstedt</td><td>70,762,211</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 &micro; L Filterspitzen</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>2 - 200 &micro; L Filterspitzen</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,211</td><td></td></tr><tr><td>0,5 - 10 &micro; L Filterspitzen</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3 Antikörper</td><td>Active Motif</td><td>39155</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac Antikörper</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3 Antikörper</td><td>Active Motif</td><td>39159</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me2 Antikörper</td><td>Active Motif</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>End Repair Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Paramagnetische Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Resuspensionspuffer</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>A-Tailing Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Ligation Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>RNA Adapter Indexes</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td><td></td></tr><tr><td>Stop Ligation</td><td>Buffer Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Primer-Cocktail</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Erweiterter PCR-Mix</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>Genomische DNA-Leiter</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Elutionspuffer</td><td>Agilent</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Probenpuffer</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Bibliotheksquantifizierungskit</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4835 &ndash; 07960204001</td><td></td></tr><tr><td>Fruchtbare Hühnereier</td><td>LSL Rhein Main</td><td>KN: 15968</td><td></td></tr><tr><td>Nadel (Neoject)</td><td>A.Hartenstein</td><td>10001</td><td></td></tr><tr><td>Spritze (Ecoject 10 mL)</td><td>Dispomed witt oHG</td><td>21010<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Name</td><td>Unternehmen<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Hermle</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>ITABIS</td><td>MKR13</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Active Motive</td><td>EpiShear Sonde Sonicator</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>Bioruptor Plus</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>Variables Volumen (5 &ndash; 1.000 &mu; L) Pipetten</td>: <td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Sigma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Magnethalter</td>, <td>Thermo Fisher</td><td>DynaMag-2 12321D</td><td></td></tr><tr><td>Tischspinner</td><td>Heathrow Scientific</td><td>Sprossenmischer</td><td></td></tr><tr><td></td><td>LMS</td><td>VTX 3000L</td><td></td></tr><tr><td>Real-Time PCR Cycler</td>, <td>Roche</td><td>Light Cycler; Serial Nr.5662</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Gene Amp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>DNA- und RNA-Qualitätskontrollsystem</td><td>Agilent</td><td>Agilent 4200 TapeStation System</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Dumont</td><td>5-Inox-H</td><td></td></tr><tr><td>Perforierter Löffel</td><td>World Präzisionsinstrumente</td><td>501997</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunopräzipitation (chip) protokoll für low-fülle embryonalen proben

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine weit verbreitete Technik zur Kartierung der Lokalisierung von posttranslational modifizierte Histone, Histon-Varianten, Transkriptionsfaktoren oder Chromatin-modifizierende Enzyme, die an einen bestimmten Ort oder auf einer genomweiten Skala. Die Kombination von ChIP-Assays mit Next Generation Sequencing (z.B. ChIP-Seq) ist ein leistungsfähiger Ansatz weltweit genregulatorischer Netzwerke aufzudecken und die funktionale Anmerkung von Genomen, insbesondere von nicht-kodierenden regulatorischen Sequenzen zu verbessern. ChIP-Protokolle erfordern normalerweise große Mengen von Zellmaterial, damit die Anwendbarkeit dieser Methode zu untersuchen, seltene Zelltypen oder kleine Gewebebiopsien entgegensteht. Um die ChIP-Assay kompatibel mit der Menge des biologischen Materials vornehmen, die in der Regel in Vivo in der frühen Embryogenese vertebrate gewonnen werden können, beschreiben wir hier eine vereinfachte ChIP-Protokoll, in dem die Anzahl der Schritte erforderlich, um abzuschließen, die Assay wurden reduziert, um die Probenverlust zu minimieren. Dieses ChIP-Protokoll wird erfolgreich eingesetzt, um verschiedene Histon-Modifikationen in verschiedenen embryonalen und adulten Maus Geweben mit niedrigen bis mittleren Zellzahlen (5 x 104 - 5 x 105 Zellen) zu untersuchen. Wichtig ist, dieses Protokolls ist kompatibel mit ChIP-Seq-Technologie mit Standardbibliothek Zubereitungsmethoden, wodurch globale epigenomischen-Karten von hochaktuellen embryonalen Gewebe.

Um die Leistung unserer ChIP-Protokoll zu veranschaulichen, haben wir ChIP-Seq-Experimente mit gepoolten SNT Abschnitte von HH19 Hühnerembryos, maxillaris Protuberanzen HH22 Embryonen, und Bühne-HH3 Hühnerembryos zu untersuchen, die verbindliche Profile von Huhn verschiedenen Histon-Modifikationen (z. B. H3K4me2, H3K27ac, H3K4me3 und H3K27me3). Das gewonnene ChIP DNAs waren wurde die Beschallung Effizienz durch Agarose-Gelelektrophorese der entsprechenden Eingabe DNAs (<strong cl...

Hier beschreiben wir eine Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) und ChIP-Seq Bibliothek Vorbereitung Protokoll zum globalen epigenomischen Profile aus Low-Fülle Huhn embryonalen Proben zu generieren.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bindungsprofile verschiedener Histonmodifikationen anhand von embryonalen Proben mit geringer Abundanz zu untersuchen, um die funktionelle Annotation von Wirbeltiergenomen zu verbessern. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. welche die wichtigsten Enhancer und Gene sind, die die Identität eines bestimmten embryonalen Gewebes definieren. Die Hauptvorteile dieser Techniken bestehen darin, dass sie eine begrenzte Menge an bestimmtem Material benötigen und sowohl für lokale spezifische als auch für genomweite Analysen verwendet werden können.Obwohl diese Methode Einblicke in die Transkriptionsregulation oder die zelluläre Heterogenität mit dem embryonalen Gewebe geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Patentproben angewendet werden. Um Hühnerembryonen im Stadium HH19 für dieses Experiment zu erhalten, werden fruchtbare weiße Leghorn-Hühnereier in horizontaler Ausrichtung bei 37 Grad Celsius und 80 % Luftfeuchtigkeit drei Tage lang bebrütet. Um mit der Isolierung der HH19-Embryonen zu beginnen, machen Sie sie zugänglich, indem Sie drei Milliliter Albumin mit einer 10-Millimeter-Spritze extrahieren, um das Blastoderm zu senken.Um überschüssige embryonale Membranen zu entfernen, machen Sie mit einer feinen Schere eine kleine Öffnung im Auge. Füge einen Milliliter Lock-Lösung hinzu. Mit Hilfe einer gebogenen Nadel 0,5 Milliliter indische schwarze Tinte hinzufügen.Verwenden Sie eine feine chirurgische Schere und Pinzette, um die zusätzliche embryonale Membran abzuschneiden, die den Embryo umgibt. Übertragen Sie dann den Embryo mit einem perforierten Löffel in eine 4,5 Zentimeter große Petrischale, die 20 Milliliter PBS-Lösung enthält. Bei der Arbeit auf Eis unter einem Stereomikroskop können Sie mit einer feinen Schere und Pinzette das Amnion und die restlichen Teile der extraembryonalen Membran sezieren und verwerfen.Schneiden Sie dann den transversalen spinalen Neurotubus oder das SNT-Segment auf der Höhe des Brachiales des Embryos. Verlängern Sie die Dissektion kaudal in den Thoraxbereich, um das SNT zu isolieren. Zum Schluss verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe zu entfernen, das das SNT lateral und ventral umgibt.Tauchen Sie nach der Isolierung der SNTs jedes Segment in eine 3,5 Zentimeter große Petrischale mit 37 Grad Celsius warmem Trypsin. Wenn die Lockerung des nicht-neurologischen Gewebes um das SNT unter einem Stereomikroskop sichtbar ist, übertragen Sie die Proben in kaltes 1x PBS. Um die Trypsinisierung zu stoppen, werden die Proben in eine neue Schale mit kaltem DMEM mit 10 % FBS überführt.Verwenden Sie eine Pinzette, um das verbleibende mesenchymale und ektodermale Gewebe manuell aus dem SNT zu entfernen. Übertragen Sie diesen sauberen SNT-Abschnitt in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und frieren Sie ihn in flüssigem Stickstoff schockein. Als nächstes homogenisieren Sie das Gewebe gemäß dem Textprotokoll.Fügen Sie 13,5 Mikroliter 37%iges Formaldehyd hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Um das Formaldehyd abzuschrecken, geben Sie 25 Mikroliter 2,5 molares Glycin in das Röhrchen und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Zentrifugieren Sie das Röhrchen und waschen Sie dann das Pellet gemäß dem Textprotokoll.Nach der Vernetzung das Pellet in 300 Mikrolitern eiskaltem, vollständigem Lysepuffer durch Pipettieren wieder suspendieren. Inkubieren Sie die Proben bei vier Grad Celsius auf einer schaukelnden Plattform für 10 Minuten. Anschließend beschallen Sie die Proben bei vier Grad Celsius.Nach der Beschallung zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 x G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Übertragen Sie den Überstand oder das Lysat in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen und entsorgen Sie das Zelltrümmerpellet. Verdünnen Sie das Lysat gemäß dem Textprotokoll.Bewahren Sie dann ein kleines Aliquot jeder Probe als Eingangskontrolle auf und frieren Sie es bei 20 Grad Celsius ein. Die restlichen Proben, die einer Chromatinfällung oder einem Chip unterzogen werden, werden gemäß dem Textprotokoll mit geeigneten Antikörpern inkubiert. Fügen Sie dann 300 Mikroliter antikörpergebundenes Chromatin zu zuvor gewaschenen magnetischen Kügelchen hinzu.Drehen Sie die Röhrchen um, um die Proben zu mischen. Um die Antikörper an die Kügelchen zu binden, legen Sie die Röhrchen auf einen Röhrchenrotator und drehen Sie sie mindestens vier Stunden lang vertikal bei vier Grad Celsius. Um die Chromatin-gebundenen Kügelchen zu waschen, geben Sie einen Milliliter eiskalten RIPA-Waschpuffer in das auf Eis gehaltene Röhrchen und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen umdrehen oder schnippen.Nachdem Sie das Rohr bei Raumtemperatur in die Magnethalterung gelegt haben, warten Sie, bis sich die Kügelchen an der Seite abgesetzt haben. Gießen Sie die klare Flüssigkeit ab und wiederholen Sie diese Wäsche noch dreimal. Nachdem Sie einen Milliliter TE 50 millimolares Natriumchlorid in das Röhrchen gegeben haben, übertragen Sie die chromatingebundenen Kügelchen in dieser Lösung in ein frisches 1,5-Millimeter-Mikrozentrifugenröhrchen.Setzen Sie das Röhrchen in die Magnethalterung ein und gießen Sie die Flüssigkeit ab, wenn sich die Kügelchen abgesetzt haben. Anschließend zentrifugieren Sie die Kügelchen bei 900 x G bei vier Grad Celsius drei Minuten lang in einer vorgekühlten Zentrifuge. Nachdem sich die Kügelchen in der Magnethalterung abgesetzt haben, entfernen Sie alle verbleibenden TE mit einer Gelladespitze.Bei Raumtemperatur 210 Mikroliter Elutionspuffer zu den Kügelchen geben und durch Schnippen wieder suspendieren. Inkubieren Sie das Röhrchen in einem vorgewärmten Heizblock bei 65 Grad Celsius für 15 Minuten unter Schütteln. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Röhrchen mit den Kügelchen eine Minute lang bei 16.000 x G bei Raumtemperatur.Sobald sich die Kügelchen in der Magnethalterung abgesetzt haben, geben Sie den Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Tauen Sie die zuvor eingefrorene Eingangskontrollprobe von 20 Grad Celsius auf Raumtemperatur auf. Geben Sie 90 Mikroliter Elutionspuffer in die Probe und mischen Sie sie durch kurzes Vortexen.Um die Vernetzungen umzukehren, inkubieren Sie den Chip und die Kontrollproben über Nacht bei 65 Grad Celsius. Bei Raumtemperatur ein Volumen TE-Puffer pro Röhrchen zugeben und zum Mischen invertieren. Um die RNA zu verdauen, geben Sie RNAse A zu den Kontroll- und Chipproben auf eine Endkonzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter und drehen Sie die Röhrchen um, um sie zu mischen.Inkubieren Sie die Röhren in einem vorgewärmten Heizblock bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Um das Protein für die anschließende DNA-Aufreinigung zu verdauen, geben Sie Protease K in einer Endkonzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter in die Röhrchen und drehen Sie die Röhrchen um, um sie zu mischen. Inkubieren Sie die Röhren in einem vorgewärmten Heizblock bei 55 Grad Celsius für zwei Stunden.Extrahieren und reinigen Sie die DNA gemäß den Zusatzmaterialien. Diese DNA kann nun für die quantitative PCR und die Vorbereitung von Chip-Seek-Bibliotheken verwendet werden. Die für einen erfolgreichen Chip unerlässliche Beschallungseffizienz wird durch die Agarose-Gelelektrophorese der Eingangskontrollproben bestätigt.In diesem Beispiel wurden unter Verwendung von spinalen Neuralrohr- oder SNT-Schnitten eines Huhns 11 Ultraschallzyklen verwendet, um eine optimale Fragmentgröße von 200 bis 500 Basenpaaren zu erhalten. Die gechippte DNA wurde mittels quantitativer PCR analysiert, um die Anreicherungsniveaus von aktivierenden und repressiven Histonmarkierungen um die Promotorregionen von Genen zu messen, die im Hühner-SNT aktiv und inaktiv sind. Dies zeigt, dass es möglich ist, die gechippte Qualität zu bewerten, indem nur wenige Low-Side quantifiziert werden, ohne viel DNA für die weitere Analyse zu verlieren.Nachdem die Chip-Seek-Bibliotheken sequenziell vorbereitet wurden, wird eine repräsentative Heuschrecke für H3K27-Trimethylierungs- und H3K4-Trimethylierungs-Chip-Seek-Daten gezeigt, die in Hühner-SNT erzeugt wurden. Ähnliche Chip-Suchprofile wurden auch erfolgreich in verschiedenen embryonalen Geweben von Hühnern erstellt, wie z. B. Oberkieferprotuberanzen und Embryonen im Stadium HH3. Dies zeigt, dass das hier vorgestellte Chip-Protokoll verwendet werden kann, um epigenomische Profile aus begrenzten Mengen verschiedener embryonaler Gewebe zu erstellen.Bei der Verwendung dieses Protokolls zur Generierung der Histonmodifikationsprofile in einem embryonalen Gewebe ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Signale von allen verschiedenen Zelltypen kommen, die in einem solchen Gewebe vorhanden sind. Nach diesem Protokoll und unter Verwendung von mehr biologischem Ausgangsmaterial sollte es möglich sein, die Bindungsprofile anderer Proteine zu untersuchen, die an der Transkriptionsregulation beteiligt sind, wie z. B. Transkriptionsfaktoren, Co-Aktivatoren oder RNA-Polymerase-2-Untereinheiten. Sobald diese Protokolle etabliert sind, werden sie es Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie oder der medizinischen Genetik ermöglichen, die funktionelle Veränderung des Genoms von Wirbeltieren zu verbessern und wichtige Einblicke in die molekularen Grundlagen der Myogenese, der Evolution und der menschlichen Krankheit zu gewinnen.

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Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Die Differenzierung der ESC deckt sich mit Zelltyp-spezifische Veränderungen in der Struktur und Zusammensetzung des Chromatins. Der Nachweis dieser Veränderungen bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die stemcellness und der Zelldifferenzierung zu definieren. Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) stellt eine wertvolle Methode, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Stammzell-Differenzierung zu sezieren.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

Wir zeigen eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Methode, um Wechselwirkungen zwischen Faktoren bei Gewebe-spezifische Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Gen-Expression in embryonalen Maus-Gewebe zu identifizieren. Dieses Protokoll sollte allgemein anwendbar für die Untersuchung von Gewebe-spezifische Genaktivierung, wie es während der normalen Embryonalentwicklung auftritt.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Wir beschreiben eine robuste Methode zur Chromatinimmunpräzipitation mit primären T-Zellen. Die Methode basiert auf Standard-Ansätzen gegründet, nutzt aber einen bestimmten Satz von Bedingungen und Reagenzien, die Effizienz für begrenzte Mengen von Zellen einer zu verbessern. Wichtig ist, dass auf eine detaillierte Beschreibung des Datenanalysephase dargestellt.

Effiziente Chromatin Immunopräzipitation mit limitierende Mengen an Biomasse

Die Kombination von Chromatinimmunpräzipitation und ultra-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (Chip-seq) zu identifizieren und abzubilden Protein-DNA-Wechselwirkungen in einem bestimmten Gewebe oder Zelllinie. Skizziert ist, wie man eine hohe Qualität ChIP Vorlage für anschließende Sequenzierung mit Erfahrung mit dem Transkriptionsfaktor TCF7L2 als Beispiel zu generieren.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Die Frage, wie Chromatin Regulierungsbehörden und Chromatin-Staaten betreffen das Genom in vivo ist der Schlüssel zum Verständnis, wie frühe Zellschicksal Entscheidungen werden in den sich entwickelnden Embryo gemacht. ChIP-Seq-die beliebteste Ansatz zur Chromatin Funktionen auf globaler Ebene, wird hier für Xenopus Embryonen beschrieben untersuchen.

Genomweite Snapshot von Chromatin Regulierungsbehörden und Staaten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen von ChIP-Seq

Eine Feinabstimmung Regulation der Gen-Transkription zugrunde liegt, embryonale Zellschicksal Entscheidung. Hier beschreiben wir Immunpräzipitationstests Chromatin verwendet epigenetischen Regulation sowohl der Herz Differenzierung von Stammzellen und kardialen Entwicklung von Mäuseembryos untersuchen.

Epigenetische Regulation der Herz Differenzierung von embryonalen Stammzellen und Gewebe

Hier beschreiben wir Methoden zum Ausführen von ChIP-Seq und CARIP-FF, einschließlich der Bibliothek Vorbereitung auf Next Generation Sequencing, global epigenomischen und Chromatin-assoziierter RNA zu generieren-Karten von ES-Zellen.

CARIP-Seq und ChIP-Seq: Methoden zur Ermittlung von Chromatin-assoziierter RNA und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonale Stammzellen

Hier beschreiben wir ein Protokoll für effiziente Chromatin Immunopräzipitation (ChIP), gefolgt von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-Seq) von braunen Fettgewebe (BAT) isoliert von einer Maus. Dieses Protokoll eignet sich für sowohl mapping Histon Änderungen und genomweite Lokalisierung von Histonproteine von Interesse in Vivozu untersuchen.

Chromatin Immunopräzipitation der murinen braunen Fettgewebe

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Genregulation. Das Verfahren birgt jedoch Schwierigkeiten bei der Erlangung reproduzierbarer Chromatinfragmentierung durch mechanisches Scheren. Hier bieten wir ein verbessertes Protokoll für einen ChIP-Assay mit enzymatischer Verdauung.

Chromatin Immunoprecipitation Assay mit Mikrokokken-Nukleasen in Säugetierzellen

Dieser Artikel beschreibt ein halbautomatisches, mikroskaliertes ChIP-Seq-Protokoll von DNA-Regionen, die mit einer spezifischen Histonmodifikation (H3K27ac) unter Verwendung einer ChIP-Liquid-Handler-Plattform assoziiert sind, gefolgt von der Bibliotheksvorbereitung mittels Tagmentation. Das Verfahren umfasst eine Kontrollbewertung für Qualitäts- und Quantitätszwecke und kann auf andere Histonmodifikationen oder Transkriptionsfaktoren angewendet werden.

Ein halbautomatisches ChIP-Seq-Verfahren für groß angelegte epigenetische Studien

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Chromatinpräparation aus tiefgefrorenem Gewebe und eignet sich für die Vernetzung der Chromatin-Immunpräzipitation (X-ChIP), gefolgt von einer quantitativen PCR-Analyse (X-ChIP-qPCR) oder einem Next-Generation-Sequencing-Ansatz (X-ChIP-seq).

Chromatinextraktion aus gefrorenem chimärem Lebergewebe für die Chromatin-Immunpräzipitationsanalyse

Lernen Sie ein ChIP-Protokoll für Low-Fülle embryonale Proben zur Analyse von Histonmodifikationen in Hühnerembryonen. Diese Methode ermöglicht epigenomische Profile mit minimalem Materialaufwand.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

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