Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bindungsprofile verschiedener Histonmodifikationen anhand von embryonalen Proben mit geringer Abundanz zu untersuchen, um die funktionelle Annotation von Wirbeltiergenomen zu verbessern. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. welche die wichtigsten Enhancer und Gene sind, die die Identität eines bestimmten embryonalen Gewebes definieren. Die Hauptvorteile dieser Techniken bestehen darin, dass sie eine begrenzte Menge an bestimmtem Material benötigen und sowohl für lokale spezifische als auch für genomweite Analysen verwendet werden können.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Transkriptionsregulation oder die zelluläre Heterogenität mit dem embryonalen Gewebe geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Patentproben angewendet werden. Um Hühnerembryonen im Stadium HH19 für dieses Experiment zu erhalten, werden fruchtbare weiße Leghorn-Hühnereier in horizontaler Ausrichtung bei 37 Grad Celsius und 80 % Luftfeuchtigkeit drei Tage lang bebrütet. Um mit der Isolierung der HH19-Embryonen zu beginnen, machen Sie sie zugänglich, indem Sie drei Milliliter Albumin mit einer 10-Millimeter-Spritze extrahieren, um das Blastoderm zu senken.

Um überschüssige embryonale Membranen zu entfernen, machen Sie mit einer feinen Schere eine kleine Öffnung im Auge. Füge einen Milliliter Lock-Lösung hinzu. Mit Hilfe einer gebogenen Nadel 0,5 Milliliter indische schwarze Tinte hinzufügen.

Verwenden Sie eine feine chirurgische Schere und Pinzette, um die zusätzliche embryonale Membran abzuschneiden, die den Embryo umgibt. Übertragen Sie dann den Embryo mit einem perforierten Löffel in eine 4,5 Zentimeter große Petrischale, die 20 Milliliter PBS-Lösung enthält. Bei der Arbeit auf Eis unter einem Stereomikroskop können Sie mit einer feinen Schere und Pinzette das Amnion und die restlichen Teile der extraembryonalen Membran sezieren und verwerfen.

Schneiden Sie dann den transversalen spinalen Neurotubus oder das SNT-Segment auf der Höhe des Brachiales des Embryos. Verlängern Sie die Dissektion kaudal in den Thoraxbereich, um das SNT zu isolieren. Zum Schluss verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe zu entfernen, das das SNT lateral und ventral umgibt.

Tauchen Sie nach der Isolierung der SNTs jedes Segment in eine 3,5 Zentimeter große Petrischale mit 37 Grad Celsius warmem Trypsin. Wenn die Lockerung des nicht-neurologischen Gewebes um das SNT unter einem Stereomikroskop sichtbar ist, übertragen Sie die Proben in kaltes 1x PBS. Um die Trypsinisierung zu stoppen, werden die Proben in eine neue Schale mit kaltem DMEM mit 10 % FBS überführt.

Verwenden Sie eine Pinzette, um das verbleibende mesenchymale und ektodermale Gewebe manuell aus dem SNT zu entfernen. Übertragen Sie diesen sauberen SNT-Abschnitt in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und frieren Sie ihn in flüssigem Stickstoff schockein. Als nächstes homogenisieren Sie das Gewebe gemäß dem Textprotokoll.

Fügen Sie 13,5 Mikroliter 37%iges Formaldehyd hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Um das Formaldehyd abzuschrecken, geben Sie 25 Mikroliter 2,5 molares Glycin in das Röhrchen und inkubieren Sie es 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Zentrifugieren Sie das Röhrchen und waschen Sie dann das Pellet gemäß dem Textprotokoll.

Nach der Vernetzung das Pellet in 300 Mikrolitern eiskaltem, vollständigem Lysepuffer durch Pipettieren wieder suspendieren. Inkubieren Sie die Proben bei vier Grad Celsius auf einer schaukelnden Plattform für 10 Minuten. Anschließend beschallen Sie die Proben bei vier Grad Celsius.

Nach der Beschallung zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 x G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Übertragen Sie den Überstand oder das Lysat in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen und entsorgen Sie das Zelltrümmerpellet. Verdünnen Sie das Lysat gemäß dem Textprotokoll.

Bewahren Sie dann ein kleines Aliquot jeder Probe als Eingangskontrolle auf und frieren Sie es bei 20 Grad Celsius ein. Die restlichen Proben, die einer Chromatinfällung oder einem Chip unterzogen werden, werden gemäß dem Textprotokoll mit geeigneten Antikörpern inkubiert. Fügen Sie dann 300 Mikroliter antikörpergebundenes Chromatin zu zuvor gewaschenen magnetischen Kügelchen hinzu.

Drehen Sie die Röhrchen um, um die Proben zu mischen. Um die Antikörper an die Kügelchen zu binden, legen Sie die Röhrchen auf einen Röhrchenrotator und drehen Sie sie mindestens vier Stunden lang vertikal bei vier Grad Celsius. Um die Chromatin-gebundenen Kügelchen zu waschen, geben Sie einen Milliliter eiskalten RIPA-Waschpuffer in das auf Eis gehaltene Röhrchen und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen umdrehen oder schnippen.

Nachdem Sie das Rohr bei Raumtemperatur in die Magnethalterung gelegt haben, warten Sie, bis sich die Kügelchen an der Seite abgesetzt haben. Gießen Sie die klare Flüssigkeit ab und wiederholen Sie diese Wäsche noch dreimal. Nachdem Sie einen Milliliter TE 50 millimolares Natriumchlorid in das Röhrchen gegeben haben, übertragen Sie die chromatingebundenen Kügelchen in dieser Lösung in ein frisches 1,5-Millimeter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Setzen Sie das Röhrchen in die Magnethalterung ein und gießen Sie die Flüssigkeit ab, wenn sich die Kügelchen abgesetzt haben. Anschließend zentrifugieren Sie die Kügelchen bei 900 x G bei vier Grad Celsius drei Minuten lang in einer vorgekühlten Zentrifuge. Nachdem sich die Kügelchen in der Magnethalterung abgesetzt haben, entfernen Sie alle verbleibenden TE mit einer Gelladespitze.

Bei Raumtemperatur 210 Mikroliter Elutionspuffer zu den Kügelchen geben und durch Schnippen wieder suspendieren. Inkubieren Sie das Röhrchen in einem vorgewärmten Heizblock bei 65 Grad Celsius für 15 Minuten unter Schütteln. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Röhrchen mit den Kügelchen eine Minute lang bei 16.000 x G bei Raumtemperatur.

Sobald sich die Kügelchen in der Magnethalterung abgesetzt haben, geben Sie den Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Tauen Sie die zuvor eingefrorene Eingangskontrollprobe von 20 Grad Celsius auf Raumtemperatur auf. Geben Sie 90 Mikroliter Elutionspuffer in die Probe und mischen Sie sie durch kurzes Vortexen.

Um die Vernetzungen umzukehren, inkubieren Sie den Chip und die Kontrollproben über Nacht bei 65 Grad Celsius. Bei Raumtemperatur ein Volumen TE-Puffer pro Röhrchen zugeben und zum Mischen invertieren. Um die RNA zu verdauen, geben Sie RNAse A zu den Kontroll- und Chipproben auf eine Endkonzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter und drehen Sie die Röhrchen um, um sie zu mischen.

Inkubieren Sie die Röhren in einem vorgewärmten Heizblock bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Um das Protein für die anschließende DNA-Aufreinigung zu verdauen, geben Sie Protease K in einer Endkonzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter in die Röhrchen und drehen Sie die Röhrchen um, um sie zu mischen. Inkubieren Sie die Röhren in einem vorgewärmten Heizblock bei 55 Grad Celsius für zwei Stunden.

Extrahieren und reinigen Sie die DNA gemäß den Zusatzmaterialien. Diese DNA kann nun für die quantitative PCR und die Vorbereitung von Chip-Seek-Bibliotheken verwendet werden. Die für einen erfolgreichen Chip unerlässliche Beschallungseffizienz wird durch die Agarose-Gelelektrophorese der Eingangskontrollproben bestätigt.

In diesem Beispiel wurden unter Verwendung von spinalen Neuralrohr- oder SNT-Schnitten eines Huhns 11 Ultraschallzyklen verwendet, um eine optimale Fragmentgröße von 200 bis 500 Basenpaaren zu erhalten. Die gechippte DNA wurde mittels quantitativer PCR analysiert, um die Anreicherungsniveaus von aktivierenden und repressiven Histonmarkierungen um die Promotorregionen von Genen zu messen, die im Hühner-SNT aktiv und inaktiv sind. Dies zeigt, dass es möglich ist, die gechippte Qualität zu bewerten, indem nur wenige Low-Side quantifiziert werden, ohne viel DNA für die weitere Analyse zu verlieren.

Nachdem die Chip-Seek-Bibliotheken sequenziell vorbereitet wurden, wird eine repräsentative Heuschrecke für H3K27-Trimethylierungs- und H3K4-Trimethylierungs-Chip-Seek-Daten gezeigt, die in Hühner-SNT erzeugt wurden. Ähnliche Chip-Suchprofile wurden auch erfolgreich in verschiedenen embryonalen Geweben von Hühnern erstellt, wie z. B. Oberkieferprotuberanzen und Embryonen im Stadium HH3. Dies zeigt, dass das hier vorgestellte Chip-Protokoll verwendet werden kann, um epigenomische Profile aus begrenzten Mengen verschiedener embryonaler Gewebe zu erstellen.

Bei der Verwendung dieses Protokolls zur Generierung der Histonmodifikationsprofile in einem embryonalen Gewebe ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Signale von allen verschiedenen Zelltypen kommen, die in einem solchen Gewebe vorhanden sind. Nach diesem Protokoll und unter Verwendung von mehr biologischem Ausgangsmaterial sollte es möglich sein, die Bindungsprofile anderer Proteine zu untersuchen, die an der Transkriptionsregulation beteiligt sind, wie z. B. Transkriptionsfaktoren, Co-Aktivatoren oder RNA-Polymerase-2-Untereinheiten. Sobald diese Protokolle etabliert sind, werden sie es Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie oder der medizinischen Genetik ermöglichen, die funktionelle Veränderung des Genoms von Wirbeltieren zu verbessern und wichtige Einblicke in die molekularen Grundlagen der Myogenese, der Evolution und der menschlichen Krankheit zu gewinnen.