Protokoll für die Festphasensynthese von Oligomeren der RNA mit einem 2'- O -thiophenylmethyl-Modifikation und Charakterisierung über Kreisdichroismus
28. Juli 2017
Dieser Artikel liefert ein detailliertes Verfahren zur Festphasensynthese, -reinigung und -charakterisierung von an der C2'- O- Position modifizierten Dodecamern von RNA. UV-vis- und zirkuläre Dichroismus-photometrische Analysen dienen zur Quantifizierung und Charakterisierung von Strukturaspekten, dh Einzelsträngen oder Doppelsträngen.
Das übergeordnete Ziel dieses Berichts ist es, das Verfahren zur Gewinnung von Oligonukleotiden der RNA durch Festphasensynthese zu veranschaulichen. Dodecamer von RNA werden als Modelle synthetisiert und ihre Aufreinigung und Charakterisierung demonstriert. Durch ihre visuelle Komponente wird diese Veröffentlichung den Umfang der Methoden und Einrichtungen erweitern, die Forschern in verschiedenen Bereichen zur Verfügung stehen.
Die Bereitstellung einer visuellen Hilfe zusammen mit einem kleinen Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, diese Techniken anzuwenden. Ein Vorteil dieser Technik ist ihre Zugänglichkeit für eine Vielzahl von Modifikationen. Da die heutigen Anwendungen immer anspruchsvoller werden, ist es wichtig, ein Standardprotokoll zu haben.
Die Phosphoramidit-Chemie erlebt aufgrund der Robustheit der Methode und ihres Potenzials, Oligonukleotide für therapeutische Anwendungen zu erhalten, ein Wiederaufleben. Der Kauf von Oligonukleotiden ist zwar attraktiv, aber der Preis und die Verfügbarkeit von Modifikationen verlagern das Interesse an der Herstellung dieser Oligomere im eigenen Haus, so dass dieses Verfahren von größter Bedeutung ist. Um dieses Verfahren zu beginnen, wiegen Sie jeden Phosphoramidit in ofengetrocknete 10-Milliliter-Braunflaschen und verschließen Sie jede Flasche mit einem Septum, das zuvor mit einer 20-Gauge-Nadel perforiert wurde.
Stellen Sie die Flaschen sofort mit einem Exsikkator, der ein Trockenmittel enthält, unter Vakuum. Nachdem Sie den Exsikkator mit trockenem Argon gefüllt haben, entfernen Sie jede Flasche und fügen Sie sofort wasserfreies Acetonitril hinzu, bevor Sie es auf einem festphasenförmigen Peptidsynthesizer befestigen. Entfernen Sie als Nächstes die Septen von jeder Flasche und setzen Sie sie über eine Flaschenwechselfunktion auf den Synthesizer.
Um die Festphasensynthese einzurichten, wählen Sie das Software-Symbol aus. Wählen Sie den Namen des Synthesizers aus und klicken Sie auf OK. Erstellen Sie dann eine neue Synthese, indem Sie Datei und Neue Synthesereihenfolge auswählen. Geben Sie anschließend im Eingabeaufforderungsfenster das Ausführungsdatum, den Kunden und die Ausführungs-ID ein.Wählen Sie das Instrument, den Sequenznamen und die Sequenz aus.
Weisen Sie auf der Registerkarte Zyklus die zuvor erstellte Methode zu. Wählen Sie dann das Handbuch für das Endverfahren, bei dem das Oligonukleotid an das CPG-Harz gebunden bleibt. Wählen Sie DMT Aus aus.
Speichern Sie die Datei, indem Sie Datei und Speichern unter auswählen.Geben Sie dann einen Namen für das Experiment ein und klicken Sie auf Speichern. Senden Sie als Nächstes die Datei, um die Synthese zu starten, indem Sie "Reihenfolge" und "Bestellung an Synthesizer senden" auswählen. Wählen Sie im Eingabeaufforderungsfenster eine Spaltenposition aus und klicken Sie auf OK. Wählen Sie im Synthesizer-Fenster die Option "Trityl Monitor".
Klicken Sie auf Funktion auswählen und Trityl Monitor jeden Schritt, indem Sie 1 eingeben. Starten Sie die Synthese, indem Sie "Synthesizer" und "Startvorbereitung" auswählen. Platzieren Sie die Säulen mit dem gewünschten Drei-Prime-Ende an den auf dem Gerät angegebenen Positionen.
Klicken Sie dann auf Start und Nein auf dem Instrument. Sobald die Synthese abgeschlossen ist, nehmen Sie die Säule aus dem Instrument und legen Sie sie in einen Kolben mit rundem Boden. Trocknen Sie die Säule unter reduziertem Druck für ca. 0,5 Stunden.
Übertragen Sie das weiße Harz aus der Säule in ein 1,6-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 0,5 Milliliter einer wässrigen Methylamin- und Ammoniaklösung hinzu. Befestigen Sie den Deckel des Zentrifugenröhrchens mit Parafilm und erhitzen Sie den Inhalt eineinhalb Stunden lang auf 60 Grad Celsius. Legen Sie einen schweren Gegenstand auf die Röhrchen, um sicherzustellen, dass die Konzentration konstant bleibt.
Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird die Probe kurz zentrifugiert, um den Inhalt zu reduzieren. Übertragen Sie dann den Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen. Kühlen Sie das Röhrchen auf 70 Grad Celsius ab, indem Sie es fünf Minuten lang in ein Trockeneis-Ethanolbad legen, und konzentrieren Sie es dann, bis es mit einem Speed-Vac-Konzentrator trocken ist.
Nun resuspendieren Sie die Feststoffe in 0,4 Millilitern einer Amin-Trihydrafluorid-Lösung und befestigen Sie die Kappe dann mit Laborfolie. Erhitze die Lösung eineinhalb Stunden lang auf 60 Grad Celsius. Legen Sie einen schweren Gegenstand auf die Röhrchen, um eine konstante Konzentration zu gewährleisten.
Nachdem Sie die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt haben, fügen Sie 0,04 Milliliter einer Natriumacetatlösung hinzu und mischen Sie sie vorsichtig mit einer Pipettenspitze. Fügen Sie einen Milliliter Ethanol hinzu und kühlen Sie die Lösung mit einem Trockeneis-Ethanolbad 15 Minuten lang auf etwa 70 Grad Celsius ab. Anschließend zentrifugieren Sie die Lösung bei 15.000 U/min bei vier Grad Celsius für zehn Minuten.
Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu extrahieren, und trocknen Sie das resultierende Pellet unter reduziertem Druck. Nach dem Trocknen wird der erhaltene Fest- und Ladepuffer resuspendiert und gemischt, bis die Lösung homogen ist. Laden Sie dann die Suspension auf ein zuvor vorbereitetes Polyacrylamid-Gel.
Wenden Sie einen Strom durch das Gel an, bis sich der bromethymolblaue Marker zwischen der Hälfte und zwei Dritteln des Gels befindet. Nachdem Sie das Gel vom Ständer genommen haben, übertragen Sie den Gelinhalt aus dem Glas auf die Plastikfolie und legen Sie ihn auf eine dünne, mit Siliziumdioxid bedeckte Chromatographieplatte, um die Banden mit einer UV-Lampe sichtbar zu machen. Markiere mit einem Markierer die Stelle, an der sich das obere Band befindet, und schneide es mit einer Rasierklinge ab.
Geben Sie das Gel mit der RNA in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und zerkleinern Sie es mit einem Glasstab in kleine Stücke. Suspendieren Sie nun die Gelreste in einer wässrigen Natriumchloridlösung und schütteln Sie die Suspension 12 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie die Suspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie dann zehn Minuten lang bei 3400 U/min.
Um die Probe mit einer Umkehrphasen-C18-Kartusche zu entsalzen, waschen Sie die Kartusche zuerst mit Acetonitril, Wasser, wässrigem Ammoniumchlorid und der RNA-Lösung, wobei Sie die Gelrückstände zurücklassen. Nach dem Waschen mit Wasser eluieren Sie die RNA aus der Säule mit drei Millilitern 60%iger wässriger Methanollösung in drei verschiedene Reagenzgläser. Kühlen Sie die Röhrchen fünf Minuten lang in einem Trockeneisbad auf 70 Grad Celsius ab und konzentrieren Sie den Inhalt dann mit einem Speed-Vac-Konzentrator auf Trockenheit.
Nachdem Sie das Eluant unter reduziertem Druck konzentriert haben, lösen Sie den Rückstand in 0,3 Millilitern RNase-freiem Wasser wieder auf. Nach dem Verdünnen der Lösung einen Mikroliter auf das UV-Vis-Instrument auflegen, um das UV-Vis-Spektrum zwischen 200 und 450 Nanometern zu messen. Für die MALDI-TOF-Analyse waschen Sie zuerst eine C18-Pipettenspitze mit 50 % Acetonitril.
Äquilibrieren Sie die Pipettenspitze mit 0,1 % Trifluoressigsäure. Beladen Sie dann die Pipettenspitze mit einer Lösung, die 100 bis 150 Pikosolen Probe enthält. Nachdem Sie die Pipettenspitze mit 0,1 % TFA und Wasser gewaschen haben, eluieren Sie die Probe in eine Lösung, die die gewünschte Matrix enthält.
0,9 Mikroliter der Lösung auf eine MALDI-Platte geben und die Probe trocknen lassen. Für die RNA-Strukturanalyse wird die RNA-haltige Probe in eine Mikroküvette überführt und in den Probenwechsler eines Zirkulardichroismus-Instruments gelegt. Öffnen Sie den Stickstofftank, um einen Durchfluss zu erzeugen, der den am Instrument befindlichen Luftschwimmer auf ca. 40 bewegt.
Schalten Sie dann den Kühler ein. Schalten Sie nun das Instrument ein. Öffnen Sie die Software, indem Sie auf das Symbol Spectrum Manager klicken, und öffnen Sie dann das Erfassungsfenster, indem Sie auf Spektrummessung klicken.
Nachdem Sie das Gerät mit Stickstoff gespült haben, erfassen Sie die Zirkulardichroismus-Spektren, indem Sie Messen und Parameter auswählen. Wählen Sie auf der Registerkarte Allgemein 200-350 Nanometer für den Scan, CD und HT für die Kanäle, 0,1 Nanometer für den Datenabstand, 100 Nanometer pro Minute für die Scangeschwindigkeit, einen Nanometer für die Bandbreite und fünf für die Anzahl der Akkumulationen aus. Wählen Sie auf der Registerkarte Cell Unit die Option 20 Grad Celsius aus.
Wählen Sie auf der Registerkarte Steuerung die Option Verschluss wird automatisch geöffnet und geschlossen. Geben Sie auf der Registerkarte Informationen den Namen der Probe, den Bediener, die Konzentration und das Lösungsmittel ein. Navigieren Sie auf der Registerkarte Daten zum gewünschten Ordner und klicken Sie auf OK. Erfassen Sie die Spektren, indem Sie auf Messen und Probenmessung klicken.
Identifizieren Sie abschließend die Positionen der Küvetten in den Probenwechslern eins bis sechs und klicken Sie auf OK. Die vier RNA-Stränge wurden durch Festphasensynthese gewonnen und ergaben nach der Reinigung zwischen 300 und 700 Nanomol jedes Oligonukleotids. Hier sind die MALDI-TOF-Chromatogramme der Oligonukleotide dargestellt. Beim Vergleich der Bande bei 260 Nanometern mit kanonischen und modifizierten Oligonukleotiden wird kein wesentlicher Unterschied in den normierten UV-Vis-Spektren beobachtet, unabhängig davon, ob einzelsträngige Proben oder Duplexstrukturen verglichen werden.
Bei der Messung ihrer Zirkulardichroismus-Spektren werden jedoch geringfügige Veränderungen beobachtet. Darüber hinaus zeigten Tm-Messungen der drei Duplexstrukturen einen eindeutigen Wert, der auf die Destabilisierung hindeutete, die durch den Einbau der beiden Haupt-Othyophenylmethylmodifikationen auf einem der Stränge induziert wurde. Es ist wichtig zu bedenken, dass die Ausbeute der Festphasensynthese von der Reinheit des Reagenzes abhängt.
Feuchtigkeit wirkt sich negativ auf jeden Schritt aus, da die vorhandene Wassermenge immer reagens sein muss. Die berichtete Methodik soll als allgemeine Ressource für Wissenschaftler dienen. Die Technik kann je nach gewünschter Modifikation, verfügbarer Instrumentierung oder zeitlichen Einschränkungen variieren.
Die Art der Chemie, die hier verwendet wird, stellt eine sehr robuste Methode dar, die seit den 1980er Jahren verwendet wird und immer noch stark in akademischen und industriellen Umgebungen verwendet wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, die Synthese, Reinigung und Charakterisierung Ihrer eigenen modifizierten oder kanonischen Oligonukleotide von RNA oder DNA durchzuführen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit den notwendigen Reagenzien gefährlich sein kann und Schutzausrüstung wie Schutzbrille, Handschuhe und Laborkittel jederzeit getragen werden sollte.
Alle Reagenzien sollten mit Vorsicht gehandhabt werden und sich gegebenenfalls in einem Abzug befinden.
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Übersicht
In diesem Artikel wird das Verfahren zur Gewinnung von RNA-Oligonukleotiden mittels Festphasensynthese beschrieben, wobei der Schwerpunkt auf Dodekameren liegt. Es umfasst Methoden zur Reinigung und Charakterisierung, die die Methodik der Forschenden verbessern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biochemie
- Molekularbiologie
- Nukleinsäurechemie
Hintergrund
- Die Festphasensynthese ist eine weit verbreitete Technik zur Herstellung von Oligonukleotiden.
- Die Charakterisierung von RNA-Strukturen ist entscheidend, um ihre Funktionen zu verstehen.
- Visuelle Hilfsmittel können das Verständnis komplexer Methoden verbessern.
- Standardprotokolle sind für die Reproduzierbarkeit in der Forschung unerlässlich.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung zur Synthese von RNA-Dodekameren bereitstellen.
- Reinigungs- und Charakterisierungsmethoden demonstrieren.
- Den Umfang der Methoden, die Forschern zur Verfügung stehen, erweitern.
Verwendete Methoden
- Festphasensynthese von RNA-Dodekameren.
- Reinigungstechniken für Oligonukleotide.
- UV-Vis-photometrische Analyse zur Quantifizierung.
- Kreisdichroismus zur strukturellen Charakterisierung.
Hauptergebnisse
- Die erfolgreiche Synthese von RNA-Dodekameren wurde erreicht.
- Die Charakterisierung bestätigte die strukturelle Integrität der synthetisierten RNA.
- Die dargestellten Methoden sind auf verschiedene RNA-Modifikationen anwendbar.
- Visuelle Hilfsmittel verbessern das Verständnis der Protokolle erheblich.
Schlussfolgerungen
- Das vorgestellte Protokoll ist eine wertvolle Ressource für Forscher.
- Standardisierte Methoden verbessern die Reproduzierbarkeit der RNA-Synthese.
- Weitere Anwendungen können mit den beschriebenen Techniken untersucht werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die interne Synthese modifizierter RNA-Oligonukleotide und unterstützt so die Zielvalidierung und die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten in der nukleinsäurebasierten Therapie. Durch die Bereitstellung einer robusten, auf Verträglichkeit basierenden Methode zum Einbau von 2'-O-Thiophenylmethyl-Modifikationen wird die Abhängigkeit von externen Anbietern verringert und die präklinische Risikominimierung beschleunigt. Die Einbindung der Kreiselpolarisationsmessung (Circular Dichroism) zur strukturellen Beurteilung erhöht den Vorhersagewert des frühen Oligonukleotid-Designs.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch standortspezifische Einbindung von 2'-O-Thiophenylmethyl-Modifikationen, um deren funktionelle Auswirkungen auf die RNA-Struktur und -Stabilität zu bewerten.
- Operationaler Wert: Unterstützt die schnelle Generierung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR-Daten), indem die Synthese von Oligonukleotiden mit null, einer oder zwei Modifikationen an definierten Positionen ermöglicht wird.
- Prädiktiver Wert: Daten aus der Circulardichroismus-Messung liefern quantitative strukturelle Aussagen, die helfen, Hypothesen zur Zielstrukturnbindung vor zellulären oder in-vivo-Tests abzusichern.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt gereinigte, quantifizierbare RNA-Dodekamere, die als Sonden oder Standards in Bindungsassays und strukturellen Screening-Verfahren geeignet sind.
- Operativer Wert: Ein standardisierter Workflow aus Festphasensynthese und Aufreinigung (CPG-Träger, AMA-Abspaltung, HF/TriEtOH-Behandlung, PAGE und C18 RP-HPLC) gewährleistet die Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge für die Assay-Entwicklung.
- Skalierbarkeit: Die Methodik eignet sich für parallele Synthese und kann an verschiedene Modifikationen angepasst werden, wodurch die Erzeugung von Oligonukleotiden im mittleren Durchsatz für Screening-Kampagnen unterstützt wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht die Erzeugung modifizierter RNA-Konstrukte, die potenzielle therapeutische Kandidaten nachahmen, und erleichtert die Übertragung von chemischen Modifikationen auf biologische Aktivität.
- Präklinische Risikominimierung: Beobachtete Veränderungen in den zirkularen Dichroismus-Spektren und den Schmelztemperaturen (Tm-Werte) liefern frühe Hinweise auf strukturelle Störungen und Duplexdestabilisierung und unterstützen Entscheidungen über die Weiterentwicklung.
- Mechanistische Erkenntnisse: Ermöglicht die Korrelation der 2'-O-Thiophenylmethyl-Einlagerung mit veränderter RNA-Konformation und unterstützt so das mechanistische Verständnis der Auswirkungen von Modifikationen auf die Zielbindung oder die Resistenz gegenüber Ribonuklease.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und unterstützt die Identifizierung von Leitstrukturen durch die gezielte Generierung von Oligonukleotiden und deren biophysikalische Charakterisierung vor dem Übergang zur präklinischen Entwicklung.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die hypothesengeleitete Synthese modifizierter RNA zur Untersuchung von Struktur-Funktions-Beziehungen und zur Zielvalidierung durch chemische Störung.
- Screening: Bereitstellung quantifizierbarer, strukturell charakterisierter Oligonukleotide, die für affinitätsbasierte oder funktionelle Screening-Assays geeignet sind.
- Analytik: Die UV/VIS-Spektroskopie ermöglicht eine genaue Quantifizierung; die Kreiselpolarisation liefert Metriken zur Sekundärstruktur (z. B. Änderungen der Elliptizität), die einen Vergleich zwischen modifizierter und kanonischer RNA erlauben.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase, indem modifizierte RNA-Spezies bereitgestellt werden, die hinsichtlich Stabilität, Bindung und funktioneller Aktivität in nachgeschalteten Modellen evaluiert werden können.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die Phosphoramidit-basierte Festphasensynthese ist eine Plattformtechnologie, die auf mehrere Oligonukleotidprojekte angewendet werden kann, wodurch der Aufwand für erneute Validierungen verringert und eine modulare Anpassung an neue Chemien ermöglicht wird.
Operationelle und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Zielvertrauen, indem eine präzise Platzierung von Modifikationen ermöglicht und die strukturellen Konsequenzen direkt mittels circularer Dichroismus beurteilt werden können.
- Operativer Wert: Liefert reproduzierbare, gereinigte RNA-Oligonukleotide mit definierten Modifikationsmustern und verringert so die Variabilität in nachfolgenden Experimenten.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem die interne Herstellung komplexer, modifizierter Oligonukleotide ermöglicht wird, die kostspielig oder kommerziell nicht verfügbar sein könnten.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem frühzeitige biophysikalische Daten (z. B. Tm, CD-Verschiebungen) bereitgestellt werden, um die Weiterentwicklung von Leitkandidaten zu informieren.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Phosphoramidit-Chemie, im Umgang mit Oligonukleotiden und unter wasserfreien Bedingungen, um fehlerhafte Synthesen durch Feuchtigkeit zu vermeiden.
- Benötigt Zugang zu einem Nukleinsäure-Synthesizer, HPLC- oder C18-Festphasen-Extraktionsausrüstung, einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Ausrüstung und einem Kreis dichroismus-Spektrometer mit Temperatursteuerung.
- Setzt standardisierte Arbeitsabläufe für Synthese, Spaltung, Deprotektion, gelförmige Reinigung, Entsalzung und Qualitätskontrolle voraus, um eine Konsistenz zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen sicherzustellen.
- Muss modificationsabhängige Kupplungseffizienzen und mögliche sterische Effekte während der Festphasensynthese berücksichtigen, insbesondere bei voluminösen 2'-O-Thiophenylmethyl-Gruppen.
- Ist durch den Bedarf an speziellen Reagenzien (z. B. HF/TriEtOH zur Deprotektion) und Sicherheitsinfrastruktur aufgrund des Umgangs mit gefährlichen Chemikalien eingeschränkt.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Solid-phase Synthesis of RNA Oligonucleotides
3:25
Deprotection and Purification of RNA Oligonucleotides
7:12
Characterization via MALDI-TOF and RNA Structure Analysis vi CD
9:24
Results: Characterization of RNA Oligomers Containing 2'-Othiophenylmethyl Modification
10:25
Conclusion
![Festphasen-Synthese von [4,4] Spirocyclic Oximes](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F58508.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A20.274Z&w=384&q=75)
