Name: Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Zytotoxizität humaner NK-Zellen mittels Durchflusszytometrie quantifizieren. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von NK-Zell-Funktionen für diagnostische und therapeutische Anwendungen.

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Wir möchten Jill Narciso, UCLA Immungenetik Center, danke für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung der Handschrift.

Die Proben wurden gemäß den ethischen Richtlinien des UCLA Human Research Protection Program entnommen und vom IRB genehmigt.
1. Vorbereitung der Reagenzien
HINWEIS: Sofern nicht anders angegeben, sollten alle Reagenzien vor der Verwendung bei Raumtemperatur äquilibriert werden. Alle Reagenzien müssen steril bleiben.
<ol>
	<li>Bereiten Sie eine 2x Arbeitslösung von Tween-20 (d. h. 0,2%) vor, indem Sie 10 μl Tween-20-Lösung zu 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium und Magnesium mit einer p20-Pipette hinzufügen.
	<ol>
		<li>Angesichts der hohen Viskosität von Tween-20 sollten Sie die folgenden Schritte unternehmen, um die Genauigkeit zu gewährleisten: Sammeln Sie langsam, um Blasenbildung zu vermeiden, tauchen Sie nicht die gesamte Spitze ein, um eine Verschleppung zu vermeiden, und pipettieren Sie mehrmals in PBS auf und ab, um das gesamte Tween-20 aus der Spitze auszuwaschen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fügen Sie 2 μl IL-2-Stammlösung (2,1E6 IE/ml) zu 198 μl vollständigem Medium hinzu (d. h. 1:100 Verdünnung), was RPMI mit 1 % Penicillin-Streptomycin und 10 % fötalem Rinderserum (FBS) entspricht, und fahren Sie dann mit einer zusätzlichen Verdünnung von 1:100 fort, indem Sie 2 μl IL-2-Zwischenlösung zu 198 μl vollständigem Medium hinzufügen, um eine 7-fache Arbeitslösung (210 IE/ml) herzustellen.</li>
	<li>Fügen Sie 2 μl CFSE-Stammlösung (5 mM) zu 500 μl reinem Medium (RPMI) hinzu. Vortex, nach unten drehen, um Tropfen von der Kappe zu entfernen, dann mit einer zusätzlichen Verdünnung im Maßstab 1:20 fortfahren, indem 50 μl der CFSE-Zwischenlösung zu 950 μl reiner RPMI hinzugefügt werden, um eine 2-fache Arbeitslösung von 1 μM zu erhalten.</li>
</ol>
2. Isolierung von PBMCs als Effektorzellen
HINWEIS: Dieser Assay wurde für die effektive Anwendung mit Gesamt-PBMCs von gesunden Kontrollen validiert. Es wird jedoch empfohlen, den Gehalt an NK-Zellen bei jedem PBMC-Präparat zu überprüfen (Abbildung 1). Außerdem basiert das Volumen des Vollbluts für die Entnahme auf der Häufigkeit von NK-Zellen im peripheren Vollblut und kann von Person zu Person variieren, insbesondere zwischen gesunden Spendern und Patienten.
<ol>
	<li>Sammeln Sie mindestens 4 ml menschliches Vollblut in Natrium- oder Lithium-heparinisierten Blutentnahmeröhrchen. Lagern Sie die Blutproben bei Raumtemperatur und verwenden Sie sie innerhalb von 30 Stunden nach der Entnahme.</li>
	<li>Verdünnen Sie Vollblut mit 4 ml PBS (d. h. das gleiche Volumen an PBS wie Vollblut).</li>
	<li>Geben Sie 4 mL Dichtegradientenlösung (siehe Materialtabelle) in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Legen Sie verdünntes Vollblut vorsichtig über die Dichtegradientenlösung, indem Sie das Röhrchen kippen.</li>
	Bei <li>650 x g für 24 min bei ausgeschalteter Bremse zentrifugieren.</li>
	<li>Sammeln Sie vorsichtig die Schicht der mononukleären Zellen, d. h. die dünne weiße Schicht unter der obersten Schicht aus Plasma und Blutplättchen, in einem neuen konischen 15-ml-Röhrchen. Bringen Sie das Volumen mit PBS auf 15 ml.</li>
	<li>Bei 450 x g für 10 min bei angezogener Bremse zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 ml vollständigem Medium.</li>
	<li>Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler oder ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen, und stellen Sie die PBMC-Konzentration auf 5x106 Zellen/ml mit vollständigem Medium ein.</li>
	<li>Überprüfen Sie den NK-Zellgehalt durch Durchflusszytometrie (siehe Schritt 4).</li>
	<li>Starten Sie den Assay innerhalb von 30 Minuten. Bewahren Sie die Zellen bis zu 10 Minuten bei Raumtemperatur auf oder legen Sie sie bis zur Verwendung in einen befeuchteten 5 %CO 2 -Inkubator bei 37 °C.</li>
</ol>
3. Isolierung von NK-Zellen als Effektorzellen
HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls ist eine Alternative zur Verwendung von Gesamt-PBMCs als Effektorzellen. Die typische Ausbeute von 4 ml Vollblut von einer gesunden Person beträgt etwa 4x105 NK-Zellen oder etwa 5-15% der PBMCs, obwohl diese Häufigkeit zwischen den Spendern variiert 21. Es wird empfohlen, nach der Isolierung eine Reinheitsprüfung durchzuführen.
<ol>
	<li>Sammeln Sie mindestens 4 ml menschliches Vollblut in Natrium- oder Lithium-heparinisierten Blutentnahmeröhrchen. Entnehmen Sie 50 μl Vollblut zur Färbung als Voranreicherungsprobe.</li>
	<li>Geben Sie den Anreicherungscocktail zu Blutproben mit 50 μl/ml (siehe Materialtabelle). Gut mischen und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie ein gleiches Volumen PBS + 2 % FBS hinzu, um die Probe zu verdünnen, und mischen Sie sie vorsichtig gut.</li>
	<li>Geben Sie 4 ml Dichtegradientenlösung in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Überlagern Sie die verdünnte Probe vorsichtig mit dem Dichtegradientenmedium.</li>
	<li>Bei 1.200 x g für 10 min bei ausgeschalteter Bremse zentrifugieren.</li>
	<li>Sammeln Sie die Schicht der angereicherten Zellen vorsichtig in einem neuen konischen 15-ml-Röhrchen. Waschen Sie die Zellen, indem Sie das Volumen mit PBS + 2% FBS auf 50 ml erhöhen.</li>
	<li>Bei 300 x g 10 min zentrifugieren. Den Überstand entsorgen und den Waschgang wiederholen.</li>
	<li>Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 ml vollständigem Medium.</li>
	<li>Zählen Sie mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer die Zellen und stellen Sie die Konzentration auf 5x105 Zellen/ml ein. Nehmen Sie 50 μl gereinigte Zellsuspension zur Färbung als Probe nach der Anreicherung.</li>
	<li>Bewahren Sie die Zellen bis zu 10 Minuten bei Raumtemperatur auf oder stellen Sie sie bis zur Verwendung in einen befeuchteten 5 %CO 2 -Inkubator bei 37 °C.</li>
</ol>
4. Immunphänotypisierung zur Beurteilung des NK-Zellgehalts
<ol>
	<li>Unter Verwendung von insgesamt 50 μl isolierten PBMCs, Vollblut vor der Anreicherung oder gereinigten NK-Zellen wird mit anti-CD56-Fluorochrom-konjugierten Antikörpern als NK-Zellmarker gefärbt. Marker für andere Zelltypen und -linien (z. B. CD3+ T-Zellen, CD19+ B-Zellen) können ebenfalls einbezogen werden, um gegebenenfalls den Ursprung der Kontamination zu beurteilen.</li>
	<li>20 Minuten bei 4 °C inkubieren und mit 2 mL PBS + 2 % FBS waschen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 450 x g für 5 min.</li>
	<li>Bei PBMC- oder NK-Zellen ist der Überstand zu aspirieren und die Zellen in 100 μl PBS + 2 % FBS zu resuspendieren.</li>
	<li>Führen Sie bei Vollblutproben eine Lyse der roten Blutkörperchen (RBC) durch:
	<ol>
		<li>Nach der Zentrifugation den Überstand aspirieren und in 2 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen resuspendieren (31,75 g Ammoniumchlorid + 4,16 g Trisbase + 6,65 g EDTA, gelöst in 5000 ml deionisiertem Wasser).</li>
		<li>10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die lysierte Probe in 100 μl PBS + 2 % FBS. 
		HINWEIS: Die Erythrozytenlyse kann auch vor der Färbung durchgeführt werden.</li>
		<li>Fahren Sie mit der durchflusszytometrischen Analyse fort.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Auftauen, Kultivieren und Ernten von K562-Zielzellen
<ol>
	<li>Aliquotieren Sie 10 mL des gesamten Mediums in ein konisches 15-ml-Röhrchen und lassen Sie es in einem 37 °C warmen Wasserbad erwärmen. Verwenden Sie für das Auftauen und Kultivieren von K562-Zellen in allen Schritten nur auf 37 °C vorgewärmte Medien.</li>
	<li>Legen Sie eine Durchstechflasche mit gefrorenen K562-Zellen in das 37 °C warme Wasserbad, bis der größte Teil aufgetaut ist.</li>
	<li>Die halbaufgetauten K562-Zellen werden in das auf 37 °C vorgewärmte Medium in das konische 15-ml-Röhrchen überführt. Waschen Sie das Innere des Kryofläschchens mit etwas vorgewärmtem Medium und geben Sie das Waschmittel in das 15-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Bei 140 x g 7 min bei angezogener Bremse zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL des vollständigen Mediums.</li>
	<li>Aliquotieren Sie eine angemessene Menge an Zellsuspension, um Zellen mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer zu zählen.</li>
	<li>Die Konzentration auf 1x105-2x10 5 Zellen/ml einstellen und vor der Verwendung mindestens 2 Tage lang in einem befeuchteten 5%igen CO2 -Inkubator bei 37 °C kultivieren. Halten Sie die Kultur nicht länger als 3 Monate in diesem Dichtebereich und tauen Sie dann ein neues Aliquot auf. Überschreiten Sie niemals eine Zellkonzentration von 1x106 Zellen/ml in Kultur.</li>
	<li>Für die Verwendung im Assay mischen Sie die K562-Zellkulturvertiefung mit einer serologischen 10-ml-Pipette und entfernen Sie ein Aliquot, um die Zellviabilität mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer und Trypanblau-Färbung zu zählen und zu beurteilen.
	<ol>
		<li>Wenn die Lebensfähigkeit weniger als 85 % beträgt, fahren Sie mit den folgenden Schritten zur Entfernung toter Zellen fort.
		<ol>
			<li>Geben Sie bei Bedarf 15 ml Dichtegradientenlösung in konische 50-ml-Röhrchen. Sammeln Sie alle Zellen aus der Kultur und überlagern Sie die Zellsuspension langsam über die Dichtegradientenlösung, indem Sie das Röhrchen kippen.</li>
			<li>Zentrifugieren Sie bei 650 x g für 24 min und bremsen Sie ab. Die Schicht der lebenden Zellen wird vorsichtig in ein neues konisches 15-ml-Röhrchen gegeben. Bringen Sie das Volumen mit PBS auf 50 ml.</li>
			<li>Bei 450 x g für 10 min bei angezogener Bremse zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL des vollständigen Mediums. Zählen Sie die Zellen und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen (wie in 5.7).</li>
			<li>Vor der Verwendung mindestens 2 Tage lang in einem befeuchteten 5 %CO 2 -Inkubator bei 37 °C kultivieren.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5x105 K562 Zielzellen sammeln und bei 140 x g für 7 min zentrifugieren. Den Überstand aspirieren und das Zellpellet in 500 μL in Medien mit 1% FBS resuspendieren.</li>
</ol>
6. Markierung von K562-Zielzellen
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die K562-Zellen gut resuspendiert sind, bevor Sie die CFSE-Arbeitslösung hinzufügen.
<ol>
	<li>Pipettieren Sie 500 μl der CFSE-Arbeitslösung auf die 500 μl der K562-Zellen für eine Endkonzentration von 0,5 μM. Mischen Sie sofort mit derselben 1000-1250 μl-Spitze, indem Sie vorsichtig 3-5 Mal auf und ab pipettieren.</li>
	Im <li>37 °C warmen Wasserbad oder in einem befeuchteten 5 % CO2 -Inkubator bei 37 °C für 10 min im Dunkeln inkubieren. 
	HINWEIS: Da die Verzögerung des Temperaturausgleichs im Inkubator im Vergleich zum Wasserbad länger ist, muss die Inkubationszeit möglicherweise speziell für Volumina > 1 ml angepasst werden.</li>
	<li>Die Markierungsreaktion wird mit 10 mL des vollständigen Mediums 10 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur abgeschreckt.</li>
	<li>Die markierten K562-Zellen werden 7 Minuten lang bei 140 x g zentrifugiert. Den Überstand entfernen und in 1 ml vollständigem Medium resuspendieren.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer und bringen Sie die Konzentration auf 1x105 Zellen/ml in vollständigen Medien.</li>
	<li>Die Zellen werden bis zur Verwendung in einen befeuchteten 5 %CO 2 -Inkubator bei 37 °C gelegt. Die Zellen können bis zu 10 Minuten bei Raumtemperatur oder in einem befeuchteten CO2 -Inkubator bei 37 °C bis zur Verwendung aufbewahrt werden. Nicht im Kühlschrank aufbewahren.</li>
</ol>
7. Plattieren
HINWEIS: Wenn die NK-Zellen begrenzt sind, kann die Konzentration sowohl der K562- als auch der NK-Zellen halbiert werden, so dass die Hälfte der Zellen im Assay plattiert wird. Der Assay liefert vergleichbare Ergebnisse mit der Hälfte der Zellanzahl (solange die Verhältnisse konstant bleiben).
<ol>
	<li>Bei Verwendung von PBMCs insgesamt ist eine mit Gewebekulturen behandelte 96-Well-Platte mit U-Boden für die folgenden Bedingungen pro Vertiefung zu markieren: (1) Effektor (E) : Ziel (T) = 50 : 1 + IL-2 - Positivkontrolle für Zytotoxizität von NK-Zellen; (2) E : T = 50 : 1; (3) E : T = 25 : 1; (4) E : T = 12,5 : 1; (5) E : T = 6,25 : 1; (6) T - nur Zielzellen - Negativkontrolle für den Tod von K562; (7) E - nur Effektorzellen; (8) T + Tween - Positivkontrolle für den Tod von K562</li>
	<li>Bei Verwendung von gereinigten NK-Zellen ist eine mit 96 Wells behandelte Platte mit U-Boden für die folgenden Bedingungen pro Vertiefung zu markieren: (1) Effektor (E) : Ziel (T) = 5: 1 + IL-2 - Positivkontrolle für die Zytotoxizität von NK-Zellen; (2) E : T = 5 : 1; (3) E : T = 2,5 : 1; (4) E : T = 1,25 : 1; (5) E : T = 0,625 : 1; (6) T - nur Zielzellen - Negativkontrolle für den Tod von K562; (7) E - nur Effektorzellen; (8) T + Tween - Positivkontrolle für den Tod von K562</li>
	<li>100 μl des vollständigen Mediums werden unter den Bedingungen 3, 4, 5, 6 und 7 zugegeben. Verwenden Sie für diesen und alle folgenden Schritte (empfohlen) eine Mehrkanalpipette.</li>
	<li>100 μl Effektorzellen (PBMCs bei 5x106 Zellen/ml oder gereinigte NK-Zellen bei 5x105 Zellen/ml) zu den Bedingungen 1, 2, 3 hinzufügen. Fügen Sie Effektorzellen für die Bedingungen 4-7 durch serielle Verdünnung hinzu. Wechseln Sie die Spitzen nicht von Zustand zu Zustand.
	<ol>
		<li>Bedingung 3 mischen, 100 μl entnehmen und in Bedingung 4 überführen.</li>
		<li>Mischen Sie Bedingung 4, nehmen Sie 100 μl und übertragen Sie sie auf Bedingung 5.</li>
		<li>Bedingung 5 mischen, 100 μl entnehmen und in Bedingung 7 überführen; Bedingung 6 verfügt nicht über Effektorzellen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>100 μl der vorbereiteten 2x 0,2%igen Tween-Arbeitslösung zu Bedingung 8 geben (Endkonzentration: 0,1 % Tween-20); Bedingung 8 enthält keine Effektorzellen.</li>
	<li>30 μl IL-2-Arbeitslösung zu Bedingung 1 hinzufügen. IL-2 sollte der Effektorzellsuspension vor der Zugabe der Zielzellsuspension zugesetzt werden (Endkonzentration: 27 IE/ml).</li>
	<li>Fügen Sie 100 μl Zielzellen (markierte K562-Zellen bei 1x105 Zellen/ml) zu den Bedingungen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 hinzu. Bedingung 7 verfügt nicht über Zielzellen.</li>
	<li>Mischen Sie alle Wells mit einer Mehrkanalpipette und zentrifugieren Sie die Platte bei 120 x g für 2 min.</li>
	<li>In einem befeuchteten CO2 -Inkubator bei 37 °C für 4 h inkubieren. Legen Sie die Platte am Ende der Inkubation auf Eis und fahren Sie innerhalb von 30 Minuten mit der Viabilitätsfärbung fort.</li>
</ol>
8. Färben für Lebensfähigkeit und Erwerb
<ol>
	<li>Bereiten Sie die Färbung toter Zellen vor (siehe Materialtabelle), indem Sie 3 μl der 5 μM Stammlösung zu 600 μl PBS hinzufügen.</li>
	<li>Geben Sie 50 μl verdünnte Totzellfärbung in jede Vertiefung, um ein Endvolumen von 250 μl und eine Endkonzentration von 0,005 μM zu erhalten. Mischen Sie die Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette.</li>
	<li>Fahren Sie mit der durchflusszytometrischen Analyse fort. Erfassen Sie mit einem Durchflusszytometer mindestens 1.000 Ereignisse im Zielzell-Gate (Abbildung 2), um statistisch aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten.</li>
</ol>

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<li>Angelo, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+NK+cell+phenotyping+and+variability+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults.</a> Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).</li>
<li>Zons, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+europium+and+chromium+release+assays%3A+cytotoxicity+in+healthy+individuals+and+patients+with+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).</li>
<li>Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+sex%2C+menstrual+cycle%2C+and+oral+contraceptives+on+the+number+and+activity+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells.</a> Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).</li>
<li>Laue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+NK+cell+function+in+obese+healthy+humans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Obes%22%5BJournal%5D)">Altered NK cell function in obese healthy humans.</a> BMC Obes. 2, 1(2015).</li>
<li>Hazeldine, J., Lord, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+ageing+on+natural+killer+cell+function+and+potential+consequences+for+health+in+older+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults.</a> Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine finanziellen Interessenkonflikte.

Die hier beschriebene Methode bietet eine einfache und kostengünstige Alternative zu den traditionellen 51Cr Release Assay zytotoxische NK-Zell-Aktivität zu bewerten. Diese Methode ist empfindlich, reproduzierbare und weniger zeitaufwändig als die bisherigen Standardmethoden wie CRA, und eignet sich für beide klinischen und Forschung Anwendungen.
Während des Tests mit insgesamt PBMCs und angereicherte NK-Zellen arbeitet, ist die Option PBMCs Zellpopulationen zu reinigen ohne die Not...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56191/a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk">A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity</a>. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
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<img alt="Target cell death vs effector ratio graph; healthy donor vs patient comparison, percent cell death." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">
to:
<img alt="Effector:Target cell death comparison graph, healthy donor vs patient, cytotoxicity analysis." src="/files/ftp_upload/56191/56191fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4">

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56191/a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk">A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity</a>. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.

Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Natürliche killer (NK)-Zellen sind eine anspruchsvolle Teilmenge der menschlichen angeborenen Lymphozyten kritisch beteiligt bei der Beseitigung von viral infizierte Zellen, transformierten Zellen und anderen pathogenen Bedrohungen 1,2. NK-Zellen lytische Granulat Haus zytotoxische Proteine, wie Perforin und Granzyme. Nach der Aktivierung NK-Zellen bilden ein komplexes Zusammenspiel mit ihren Zielen bekannt als immunologische Synapse, wobei diese Zytolyse Moleküle lokal freigesetzt werden, was direkte Ziel Zelle Lysis und Apoptose, zusammen mit Freisetzung von Zytokinen und Chemokin und letztlich in der Induktion von einem entzündlichen Zustand 1,3,4.
NK-Zell-Aktivierung beinhaltet eine komplexe Reihe von Aktivierung und hemmende Interaktionen zwischen NK Zell-Rezeptoren und Liganden auf der Oberfläche der Zielzellen, bilden ein streng regulierte System ausgedrückt. Einer der am besten untersuchten Mechanismen der NK-Zell-Aktivierung ist das "fehlende selbst". In der Tat, fehlende Erkennung der Klasse, die ich major Histocompatibility complex (MHC) oder human Leukocyte Antigen (HLA) Moleküle auf infiziert oder Zellen Trigger NK Zelle Zytotoxizität umgewandelt. Tumor und Virus-infizierten Zellen in der Regel Downregulate diese Antigene T zellvermittelte Immunität, so zum primären NK entkommen Zelle Ziele 1,3,4.
Bewertung der NK-Zell-Funktion ist in erster Linie in Degranulation oder Zytotoxizität kategorisiert Assays. Degranulation Assays, wie die Strömung durchflusszytometrischen Erkennung des Degranulation-assoziierten Markers CD107a, sind jedoch nur Richtwerte der NK-Zell-Aktivierung und nicht ihre ultimative Funktion, die direkte Tötung von Ziel Zellen 5,6,7,8. Daher hat diese Einschränkung Ermittler Zytotoxizität Assays als mehr erzählen und direktere Alternative geschenkt.
Die langjährigen "Goldstandard" für die Beurteilung der zellvermittelten zytotoxische Aktivität von T- und NK-Zellen ist die Chrom-Release-Assay (CRA). CRA beinhaltet radioaktiv Kennzeichnung von Zielzellen mit 51Cr und Bebrüten sie gemeinsam mit Effektorzellen. Dieser Assay ist durchdrungen von dem Grundsatz, dass diese Zelle lyse in der Version des proteingebundenen 51Cr in der Überstand ergibt sich die durch Gamma zählen gemessen werden kann. Dieser Assay, während wirksam, ist für eine Vielzahl von Gründen problematisch: hohe Materialkosten, Handhabung und Entsorgung von radioaktiven 51Cr, spontane Freisetzung von 51Cr und schwierigen Standardisierung - so dass es insgesamt unpraktisch 9,10.
Eine Reihe von nicht-radioaktiven Assays mit fluoreszierenden Kennzeichnung, Enzymfreisetzung und sogar Biolumineszenz, wurden seitdem als Alternativen zum CRA 11,12,13,14entwickelt. Wir beschreiben hier eine Flow Cytometry basierende Methode zur Messung der NK Zelle zytotoxische Aktivität auf K562 Zielzellen, einfache, sensitive und reproduzierbar ist. K562-Zellen sind eine menschliche Erythroleukemic Zelle Linie mit reduzierten Expression von HLA Klasse I und erhöhten Ausdruck von Liganden für activatory NK-Rezeptoren, wodurch sie besonders anfällig für NK zellvermittelte Zytotoxizität 15. In diesem Assay K562 Zellen vorab mit Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester (CFSE-) gekennzeichnet sind und Co kultiviert in verschiedenen Verhältnissen mit entweder peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder NK-Zellen 1gereinigt. CFSE ist eine stabile, Proteinbindung Fluoreszenzfarbstoff, der Diskriminierung von Zielzellen von Effektor NK Zellen 16,17erlaubt. Nach der Co Inkubation dient ein Nukleinsäure-Fleck, speziell durchdringt die Membran von abgestorbenen Zellen, getöteten Zielzellen identifizieren (siehe Tabelle der Materialien). Die Proben werden dann auf einem Durchflusszytometer zu bestimmen, den Anteil der Toten (d. h. Fleck +) erworben CFSE-+ Zielzellen.
Dieser Test kann verwendet werden als diagnostische Reihenuntersuchung für monogene Mängel beeinträchtigen die NK Zellkompartiment, davon gibt es etwa 30 bekannte Mängel verursacht entweder funktionelle oder klassische NK-Zelle-Mangel, und bei primären oder sekundären Hemophagocytic Lymphohistiocytosis. Es ist auch sinnvoll, NK-Zell-Aktivität bei Patienten mit wiederkehrenden, schweren viralen Herpesinfektionen, Immunrekonstitution nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation oder Post immunmodulatorische Therapie 18,19,20, bewerten und für eine Vielzahl von Anwendungen in der grundlegenden Forschung zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x, ohne Ca2+ und Mg2+)</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td>Stammlösung bei 10.000 U/ml</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>R& D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>Lyophilisiert aus einem 0,2 μ; m filtrierte Lösung in Acetonitril und TFA mit BSA als Trägerprotein. Rekonstituieren mit 500 ul bei 100 &mu; g/ml in steriler 100 mM Essigsäure mit mindestens 0,1 % Rinderserumalbumin (2,1 x 10E6 I.E./ml)</td></tr><tr><td>K562 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>Krebszelllinie&nbsp;</td></tr><tr><td>T-75 Zellkulturflaschen</td><td>Corning</td><td>431464</td> CFSE-Zellproliferationskit <td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies (CellTrace)</td><td>C34554</td><td>Rekonstituieren Sie das I-Fläschchen mit 18 μl DMSO zur Herstellung einer 5 mM-Stammlösung. Nicht einfrieren/auftauen.</td></tr><tr><td>Sytox Red</td><td>Life Technologies</td><td>S34859</td><td>Stammlösung wird zu 5 &mu; bereitgestellt M in 1 mL DMSO. Die DMSO-Lösung kann mehreren Gefrier-Auftau-Zyklen unterzogen werden, ohne dass das Reagenz abgebaut wird.</td></tr><tr><td>Natrium/Lithium-Heparin-Blutentnahmeröhrchen</td><td>BD</td><td>02-687-95</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit U-Boden</td><td>Corning</td><td>CLS3897</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden (5 ml)</td><td>BD Falcon</td><td>14959-5</td><td></td></tr><tr><td>konisches Röhrchen aus Polypropylen 50</td><td>mL BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konisches Röhrchen aus Polypropylen</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzreservoir</td><td>USA Scientific</td><td>2321-2230</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail zur Anreicherung menschlicher NK-Zellen</td><td>StemCell Technologies (RosetteSep)</td><td>15065</td><td></td></tr></tbody></table>

ein flow cytometry-basierte zytotoxizität assay für die beurteilung der menschlichen nk-zell-aktivität

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Innerhalb des angeborenen Immunsystems spielen Effektor-Lymphozyten, die sogenannten natürlichen killer (NK)-Zellen eine wesentliche Rolle in der Wirt Verteidigung gegen anomale Zellen, insbesondere Beseitigung Tumor und viral infizierte Zellen. Ca. 30 bekannten monogenen Defekte, zusammen mit einer Vielzahl von anderen pathologischen Zuständen verursachen entweder funktionelle oder klassische NK Zelle Mangel, manifestiert sich in reduziert oder fehlend zytotoxische Aktivität. In der Vergangenheit wurde Zytotoxizität mit radioaktiven Methoden untersucht die mühsam, teuer und potenziell gefährlich sind. Dieser Artikel beschreibt eine optimierte, klinisch einsetzbaren Flow Cytometry basierende Methode um zytotoxische NK-Zell-Aktivität zu quantifizieren. In diesem Test sind peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) oder gereinigte NK Zelle Vorbereitungen Co inkubierten bei unterschiedlichen Verhältnissen eine Ziel-Tumor-Zell-Linie bekannt, empfindlich gegen NK zellvermittelte Zytotoxizität (NKCC) sein. Die Zielzellen sind bereits beschriftet mit einem Fluoreszenzfarbstoff ermöglicht ihre Diskriminierung aus den Effektorzellen (NK-Zellen). Nach der Inkubationszeit sind getöteten Zielzellen durch eine Nukleinsäure-Fleck, identifiziert, die speziell die abgestorbenen Zellen durchdringt. Diese Methode ist geeignet, um sowohl Diagnose- und Anwendungen in der Forschung und, Dank an die Multiparameter-Fähigkeiten der Durchflusszytometrie, hat den zusätzlichen Vorteil der potenziell ermöglicht eine tiefere Analyse der NK Zelle Phänotyp und Funktion.

Vor der Inbetriebnahme der Assay empfiehlt es sehr, dass NK Zellinhalt in der Effektor Bevölkerung Wahl beurteilt werden. Abbildung 1 zeigt eine typische CD56 Färbung vor (hellblau) und nach (rot) NK Zelle Bereicherung. NK-Zellen sollte bestehen aus bis zu 15 % der PBMCs und mindestens 80 % rein nach der Bereicherung.
Durchflusszytometrischen Analyse in diesem Assay umfasst Erkennung von zwei Parame...

Eine Flow Cytometry basierende Methode quantitativ bestimmen die zytotoxische Aktivität des menschlichen natürliche Killerzellen wird hier angezeigt.

Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zytotoxische Aktivität menschlicher NK-Zellen zu bewerten. Diese Methode kann zur Überwachung von Patienten mit entweder funktioneller oder klassischer NK-Zellen-Mangelerkrankung eingesetzt werden. Die wichtigsten Vorteile dieser auf Durchflusszytometrie basierenden Technik sind ihre Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und die schnellere Durchführung im Vergleich zu Standardmethoden zur Beurteilung der NK-Zellen-Funktion, wie beispielsweise dem radioaktiven Chromfreisetzungsassay.Diese Methode kann verwendet werden, um neuartige, auf NK-Zellen abzielende Therapien zu testen, sowie zuvor nicht erreichbare, detaillierte multiparametrische Durchflusszytometrie-Analysen der NK-Zellbiologie durchzuführen. Beginnen Sie mit der Dichtegradienten-Trennung, um mononukleäre Zellen aus peripherem Blut, also PBMCs, aus Vollblutproben gemäß Standardprotokollen zu isolieren. Die Verwendung von PBMCs anstelle von gereinigten NK-Zellen ist besonders vorteilhaft bei der Arbeit mit klinischen Proben.Verdünnen Sie die isolierten Zellen auf eine Konzentration von fünf mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter in komplettem Medium und sammeln Sie die K562-Zielzellen unverzüglich durch Zentrifugation ein. Resuspendieren Sie fünf mal 10 hoch 5 K562-Zellen in 500 µL frischem Medium, das mit 1 % FBS ergänzt wurde. Markieren Sie anschließend die Zielzellen mit 500 µL CFSE-Arbeitslösung und mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig durch dreimaliges bis fünfmaliges Auf- und Abpipettieren.Nach 10 Minuten bei 37 Grad Celsius, lichtgeschützt, die Markierungsreaktion durch Zugabe von 10 Milliliter vollständigem Medium 10 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur abbrechen. Am Ende der Abbruchinkubation die Zellen durch Zentrifugation sammeln und die markierte Zielzellpopulation in einem Milliliter vollständigem Medium resuspendieren, um sie anzuzählen. Anschließend die Zellen auf eine Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen pro Milliliter frischem vollständigem Medium verdünnen und die Zielzellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 Prozent Kohlendioxid platzieren.Um einen erfolgreichen Assay zu gewährleisten, minimieren Sie den Stress der Zielzellen und testen Sie die Effektorzellen so bald wie möglich nach der Gewinnung. Innerhalb von 30 Minuten nach der Markierung der Zielzellen beschriften Sie eine 96-Well-U-Boden-Zellkulturplatte gemäß der Tabelle. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter vollständiges Medium in die Wells für die Effektor- zu Zielzell-Verhältnisse von 25:1, 12,5:1 und 6,25:1 sowie in die Wells mit nur Zielzellen und die Wells mit nur Effektorzellen.Geben Sie 100 Mikroliter Effektorzellen in die Zytotoxizitätskontrollmulden sowie in die Mulden mit einem Verhältnis von 50:1 und 25:1 (Effektorzellen zu Zielzellen). Beginnen Sie anschließend mit der Mulde im Verhältnis 25:1 (Effektorzellen zu Zielzellen) und übertragen Sie 100 Mikroliter Zellen in die Mulde mit der nächstniedrigeren Zellkonzentration für die folgenden beiden Mulden, wobei die Mulden mit nur Zielzellen übersprungen werden. Mischen Sie gründlich zwischen jeder Zellübertragung und geben Sie die letzten 100 Mikroliter Zellen in die Mulden mit ausschließlich Effektorzellen. Fügen Sie 100 Mikroliter 2X-Arbeitslösung mit 0,2 Prozent Tween zu den Tween-allein-K562-Todes-positivkontrollmulden hinzu.Fügen Sie 30 µL der Arbeitslösung aus Fläschchen zwei zu den positiven Kontrollbohrungen für die NK-Zell-Zytotoxizität hinzu. Anschließend geben Sie 1 × 10⁵ markierte K562-Targetzellen pro Milliliter in 100 µL vollständigem Medium in alle Bohrungen außer in die Bohrungen mit nur Effektorzellen. Nachdem alle Zellen ausplattiert wurden, mischen Sie alle Bohrungen mit der Mehrkanalpipette. Die Zellen durch eine kurze Zentrifugation sedimentieren und die Platte vier Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator stellen. Am Ende der Inkubation die Platte auf Eis oder eine kalte Unterlage stellen und 50 µL frisch zubereitete Totzell-Färbung in jedes Well geben. Anschließend alle Wells vorsichtig mischen und die Zellen per Durchflusszytometrie analysieren.Mittels Durchflusszytometrie durchgeführte Analyse von CSFE und Totzellfärbung nach vierstündiger Kaltkultur wie gerade gezeigt, ergibt, dass die Zellen in den nur Zielzellen enthaltenden Vertiefungen eine Zelltodrate von 15 % oder weniger aufweisen. In den nur Effektorzellen enthaltenden Vertiefungen wird kein CSFE-Signal nachgewiesen, wenn in diesen Vertiefungen weniger als fünf Prozent Zelltod beobachtet werden. Während der Zelltod in den durch Tween vermittelten Zielzelllyse-Vertiefungen typischerweise über 85 % liegt, zeigt sich bei Patienten mit einem Defekt in der NK-Zellfunktion eine verminderte Abtötigungsaktivität bei den meisten oder allen getesteten Verhältnissen im Vergleich zu gesunden Individuen, was darauf hinweist, dass die NK-Zellen dieser Patienten eine differenzielle Abnahme der Zytotoxizität aufweisen, die mit einem abnehmenden Effektor-Zielzell-Verhältnis korreliert.Nach Beherrschung dieser Technik kann sie in sechs einhalb Stunden abgeschlossen werden, einschließlich der zwei Stunden für Vorbereitung und Ausplattieren, vier Stunden Inkubation und 30 Minuten für die Datenerfassung. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Ziel- und Effektorzellen parallel vorzubereiten, um die Verzögerungszeit zwischen der Zellvorbereitung und dem Beginn der Kokultivierung zu minimieren. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die zytotoxische Aktivität menschlicher NK-Zellen gegenüber fluoreszenzmarkierten Zielzellen mittels Durchflusszytometrie gemessen werden kann.

a-flow-cytometry-based-cytotoxicity-assay-for-assessment-human-nk

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

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Zellbasierter Durchflusszytometrie-Assay zur Messung der zytotoxischen Aktivität

Eine einfache und zuverlässige Methode wird hier beschrieben eine Reihe von NK-Zellfunktionen wie Degranulierung, Zytokin und Chemokin-Produktion in verschiedenen NK-Zelluntergruppen zu analysieren.

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