Ein Flow Cytometry-basierte Zytotoxizität Assay für die Beurteilung der menschlichen NK-Zell-Aktivität

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zytotoxische Aktivität menschlicher NK-Zellen zu bewerten. Diese Methode kann zur Überwachung von Patienten mit entweder funktioneller oder klassischer NK-Zellen-Mangelerkrankung eingesetzt werden. Die wichtigsten Vorteile dieser auf Durchflusszytometrie basierenden Technik sind ihre Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und die schnellere Durchführung im Vergleich zu Standardmethoden zur Beurteilung der NK-Zellen-Funktion, wie beispielsweise dem radioaktiven Chromfreisetzungsassay.

Diese Methode kann verwendet werden, um neuartige, auf NK-Zellen abzielende Therapien zu testen, sowie zuvor nicht erreichbare, detaillierte multiparametrische Durchflusszytometrie-Analysen der NK-Zellbiologie durchzuführen. Beginnen Sie mit der Dichtegradienten-Trennung, um mononukleäre Zellen aus peripherem Blut, also PBMCs, aus Vollblutproben gemäß Standardprotokollen zu isolieren. Die Verwendung von PBMCs anstelle von gereinigten NK-Zellen ist besonders vorteilhaft bei der Arbeit mit klinischen Proben.

Verdünnen Sie die isolierten Zellen auf eine Konzentration von fünf mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter in komplettem Medium und sammeln Sie die K562-Zielzellen unverzüglich durch Zentrifugation ein. Resuspendieren Sie fünf mal 10 hoch 5 K562-Zellen in 500 µL frischem Medium, das mit 1 % FBS ergänzt wurde. Markieren Sie anschließend die Zielzellen mit 500 µL CFSE-Arbeitslösung und mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig durch dreimaliges bis fünfmaliges Auf- und Abpipettieren.

Nach 10 Minuten bei 37 Grad Celsius, lichtgeschützt, die Markierungsreaktion durch Zugabe von 10 Milliliter vollständigem Medium 10 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur abbrechen. Am Ende der Abbruchinkubation die Zellen durch Zentrifugation sammeln und die markierte Zielzellpopulation in einem Milliliter vollständigem Medium resuspendieren, um sie anzuzählen. Anschließend die Zellen auf eine Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen pro Milliliter frischem vollständigem Medium verdünnen und die Zielzellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 Prozent Kohlendioxid platzieren.

Um einen erfolgreichen Assay zu gewährleisten, minimieren Sie den Stress der Zielzellen und testen Sie die Effektorzellen so bald wie möglich nach der Gewinnung. Innerhalb von 30 Minuten nach der Markierung der Zielzellen beschriften Sie eine 96-Well-U-Boden-Zellkulturplatte gemäß der Tabelle. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter vollständiges Medium in die Wells für die Effektor- zu Zielzell-Verhältnisse von 25:1, 12,5:1 und 6,25:1 sowie in die Wells mit nur Zielzellen und die Wells mit nur Effektorzellen.

Geben Sie 100 Mikroliter Effektorzellen in die Zytotoxizitätskontrollmulden sowie in die Mulden mit einem Verhältnis von 50:1 und 25:1 (Effektorzellen zu Zielzellen). Beginnen Sie anschließend mit der Mulde im Verhältnis 25:1 (Effektorzellen zu Zielzellen) und übertragen Sie 100 Mikroliter Zellen in die Mulde mit der nächstniedrigeren Zellkonzentration für die folgenden beiden Mulden, wobei die Mulden mit nur Zielzellen übersprungen werden. Mischen Sie gründlich zwischen jeder Zellübertragung und geben Sie die letzten 100 Mikroliter Zellen in die Mulden mit ausschließlich Effektorzellen. Fügen Sie 100 Mikroliter 2X-Arbeitslösung mit 0,2 Prozent Tween zu den Tween-allein-K562-Todes-positivkontrollmulden hinzu.

Fügen Sie 30 µL der Arbeitslösung aus Fläschchen zwei zu den positiven Kontrollbohrungen für die NK-Zell-Zytotoxizität hinzu. Anschließend geben Sie 1 × 10⁵ markierte K562-Targetzellen pro Milliliter in 100 µL vollständigem Medium in alle Bohrungen außer in die Bohrungen mit nur Effektorzellen. Nachdem alle Zellen ausplattiert wurden, mischen Sie alle Bohrungen mit der Mehrkanalpipette.

Die Zellen durch eine kurze Zentrifugation sedimentieren und die Platte vier Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator stellen. Am Ende der Inkubation die Platte auf Eis oder eine kalte Unterlage stellen und 50 µL frisch zubereitete Totzell-Färbung in jedes Well geben. Anschließend alle Wells vorsichtig mischen und die Zellen per Durchflusszytometrie analysieren.

Mittels Durchflusszytometrie durchgeführte Analyse von CSFE und Totzellfärbung nach vierstündiger Kaltkultur wie gerade gezeigt, ergibt, dass die Zellen in den nur Zielzellen enthaltenden Vertiefungen eine Zelltodrate von 15 % oder weniger aufweisen. In den nur Effektorzellen enthaltenden Vertiefungen wird kein CSFE-Signal nachgewiesen, wenn in diesen Vertiefungen weniger als fünf Prozent Zelltod beobachtet werden. Während der Zelltod in den durch Tween vermittelten Zielzelllyse-Vertiefungen typischerweise über 85 % liegt, zeigt sich bei Patienten mit einem Defekt in der NK-Zellfunktion eine verminderte Abtötigungsaktivität bei den meisten oder allen getesteten Verhältnissen im Vergleich zu gesunden Individuen, was darauf hinweist, dass die NK-Zellen dieser Patienten eine differenzielle Abnahme der Zytotoxizität aufweisen, die mit einem abnehmenden Effektor-Zielzell-Verhältnis korreliert.

Nach Beherrschung dieser Technik kann sie in sechs einhalb Stunden abgeschlossen werden, einschließlich der zwei Stunden für Vorbereitung und Ausplattieren, vier Stunden Inkubation und 30 Minuten für die Datenerfassung. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Ziel- und Effektorzellen parallel vorzubereiten, um die Verzögerungszeit zwischen der Zellvorbereitung und dem Beginn der Kokultivierung zu minimieren. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die zytotoxische Aktivität menschlicher NK-Zellen gegenüber fluoreszenzmarkierten Zielzellen mittels Durchflusszytometrie gemessen werden kann.