Vorbereitende Schritte für die Messung der Reaktivität in Maus retinalen Arteriolen Ex Vivo

Das übergeordnete Ziel dieser Netzhautpräparationsmethode besteht darin, mithilfe der Videomikroskopie die Reaktivität der arteriellen Blutgefäße in der Mausnetzhaut zu messen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Regulation des Netzhautblutflusses zu beantworten und könnte unser Verständnis der Pathophysiologie verschiedener Augenerkrankungen vertiefen. Der Hauptvorteil dieser neuen Technik liegt darin, dass sie die Messung der Reaktivität der Netzhautgefäße mit sehr hoher optischer Auflösung ermöglicht.

Gleichzeitig benötigt es nicht viel aufwändige Ausrüstung. Im Allgemeinen können Anfänger bei dieser Methode Schwierigkeiten haben, da es schwierig sein kann, die Arteria ophthalmica und ihre Äste zu finden. Ich werde dieses Verfahren gemeinsam mit Jenia Kouchek Zadeh und Wael Omran demonstrieren, Postgraduierten-Studierenden aus meinem Labor.

Bereiten Sie die experimentellen Verfahren vor, indem Sie die erforderlichen Instrumente bereitlegen. Schneiden Sie dann mit einer Stahlschere den Schädel der Maus sagittal in zwei Hälften und entfernen Sie mit Augenscheren die Haut und das Gehirn. Entfernen Sie mit den Augenscheren den Schädelknochen, bis nur noch der Orbitalknochen übrig ist, und überführen Sie die Orbita in eine Schnellschale mit eiskaltem Krebs-Henseleit-Puffer auf Eis unter einem Operationsmikroskop.

Schneiden Sie den Orbitalknochen mit Augenscheren und entfernen Sie vorsichtig das Augapfel- und Orbitagewebe mithilfe von Präzisionspinzette Typ vier und studentischen Vannas-Springer-Scheren. Entfernen Sie mit Präzisionspinzette Typ fünf und Vannas-Kapsulotomiescheren vorsichtig die Glandula Harderii, das Bindegewebe und die extraokularen Muskeln, wobei darauf geachtet werden muss, den Hauptast der Arteria ophthalmica nicht zu beschädigen. Ligieren Sie die orbitären Äste am proximalen Ende des Hauptastes der Arteria ophthalmica mit 10-0-Nylon-Nähten und überführen Sie den Augapfel mithilfe der Präzisionspinzette Typ vier in eine Petrischale, die 70 % Ethanol enthält.

Es ist sehr wichtig, dass alle orbitären Äste der Arteria ophthalmica ligiert werden, um während des Experiments ein Austreten von Flüssigkeit zu vermeiden. Nach 10 Sekunden bringen Sie den Augapfel in die Präparierschale zurück. Die Hornhaut erscheint aufgrund der Ethanolexposition trüb-weißlich.

Ersetzen Sie den Puffer durch frische Krebs-Lösung und verwenden Sie das Mikroskop sowie eine Drei-Gauge-Nadel, um die periphere Hornhaut zu punktieren. Benutzen Sie die Vannas-Kapsulotomiescheren, um die Hornhaut zu dissezieren, und schneiden Sie das Irisgewebe vorsichtig ab. Setzen Sie dann eine scharfe Spitze der Vannas-Kapsulotomiescheren zwischen Choroidea und Retina und trennen Sie Choroidea und Sklera ab.

Um die Netzhaut in eine speziell angefertigte Perfusionskammer einzusetzen, schieben Sie zunächst mithilfe eines Nadelhalters das Ende einer Glasmikropipette mit einer 100 µm durchmessenden Spitze in die Silikonschlauchleitung der Kammer. Anschließend schließen Sie eine Spritze an das andere Ende des Schlauchs an, um die Spitze der Mikropipette von eventuellen Rückständen zu befreien. Füllen Sie die Perfusionskammer mit kaltem Krebs-Puffer und stellen Sie die Kammer unter ein Stereomikroskop.

Platzieren Sie eine transparente Kunststoffplattform mit einer 1,8 Millimeter tiefen Vertiefung auf zwei Stahldrähten mit einem Durchmesser von 1,6 Millimeter innerhalb der Perfusionskammer und setzen Sie einen Edelstahlring auf die Plattform. Übertragen Sie mit einem Löffel die Retina zusammen mit dem Sehnerv, an dem noch die A. ophthalmica angeheftet ist, auf die Plattform und entfernen Sie das angenähte Ende der A. ophthalmica. Platziere zwei vorbereitete Schlaufen aus 10-0-Nylon-Nahtmaterial auf der Mikropipette und befestigen Sie die Arterie mit den Nähten an der Mikropipette.

Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Netzhaut auf die transparente Plattform zu legen, und nutzen Sie ein zweites Paar feiner Pinzetten, um vorsichtig die vordere Linsenkapsel zu öffnen. Entfernen Sie die Linse und verwenden Sie Mikroscheren, um die gesamte Linsenkapsel sowie das Glaskörpermaterial zu entfernen. Anschließend werden vier radiale Einschnitte in die Netzhaut gesetzt, jeweils auf halber Strecke zwischen Pars plana und Sehnerv, und der Edelstahlring wird auf die Netzhaut platziert, um diese auf der Plattform zu fixieren.

Um die retinalen Arteriolen für die Analyse vorzubereiten, bringen Sie die Perfusionskammer unter ein Lichtmikroskop und wählen Sie das 100×-Wasser-Immersion-Objektiv. Schließen Sie Schläuche an die Ein- und Ausflussanschlüsse einer parazyklischen Pumpe an und zirkulieren Sie die Kammer mit mit 95 % Sauerstoff oxigeniertem und mit 5 % Kohlendioxid karbonisiertem Krebs-Puffer bei 37 Grad Celsius. Verbinden Sie den mit der Mikropipette ausgestatteten Silikon-Schlauch über einen Dreiweghahn mit einem Reservoir-Silikon-Schlauch und füllen Sie das Reservoir mit Krebs-Puffer bis zu einer Höhe, die 50 Millimeter Quecksilber entspricht.

Verwenden Sie die Objektive, um manuell auf die Netzhautoberfläche zu fokussieren und nach Blutgefäßen oder roten Blutkörperchen zu suchen. Sobald ein Blutgefäß gefunden ist, fokussieren Sie darauf und öffnen Sie den Dreifach-Hahn. Der Durchmesser des Gefäßes sollte sich sofort vergrößern, und rote Blutkörperchen sollten sichtbar werden.

Nach einer 30-minütigen Einstellphase entwickeln die Arteriolen einen schwachen intrinsischen Tonus mit einer Lumendurchmesserabnahme von weniger als 10 %. Geben Sie ein den Blutfluss im Mausretina einschränkendes Reagenz zur Badlösung hinzu und überprüfen Sie die Gefäßviabilität. Spülen Sie dann den Agonisten durch Zirkulation der Pumpe aus dem Bad aus und fügen Sie frischen Krebs-Puffer in die Kammer hinzu.

In diesem repräsentativen Experiment führte U46619, ein Thromboxan-Analogon, zu konzentrationsabhängigen vasokonstriktorischen Reaktionen in retinalen Arteriolen von Wildtyp-C57Bl/6J-Mäusen, wobei sich der Lumendurchmesser bei einer Konzentration von 1 × 10⁻⁶ M um etwa 50 % gegenüber dem Ruhezustand verringerte. In Arteriolen, die zuvor mit dem Agonisten präkonstriert worden waren, bewirkte die kumulative Gabe von Acetylcholin konzentrationsabhängige Zunahmen des Lumendurchmessers, die bei einer Acetylcholin-Konzentration von 1 × 10⁻⁵ M etwa 25 % des präkonstrierten Durchmessers erreichten, was auf ein intaktes vaskuläres Endothel hinweist. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in 90 bis 120 Minuten durchgeführt werden.

Während Sie diese Verfahren durchführen, denken Sie daran, alle retrobulbären arteriellen Äste zu ligieren, das Auge vor dem Öffnen des Bulbus in Ethanol einzutauchen, um eine Torsion der Arteria ophthalmica zu vermeiden, und schließlich die Spitzen der Glas-Mikropipetten auf Verstopfungen zu überprüfen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Mausretina für die arterielle Messung mittels Videomikroskopie in vitro vorbereitet.