Vorbereitende Schritte für die Messung der Reaktivität in Maus retinalen Arteriolen Ex Vivo

Das übergeordnete Ziel dieser Netzhautpräparationsmethode ist es, mit Hilfe der Videomikroskopie die arterielle Reaktivität der Maus zu messen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Regulierung des Blutflusses der Netzhaut zu beantworten und unser Verständnis der Pathophysiologie verschiedener Augenerkrankungen zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser neuen Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, die Reaktivität der retinalen Blutgefäße mit sehr hoher optischer Auflösung zu messen.

Und gleichzeitig braucht es nicht viel ausgeklügelte Ausrüstung. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig sein kann, die Augenarterie und ihre Äste zu finden. Ich werde dieses Verfahren zusammen mit Jenia Kouchek Zadeh und Wael Omran, Doktoranden aus meinem Labor, demonstrieren.

Bereiten Sie sich auf die experimentellen Verfahren vor, indem Sie die erforderlichen Instrumente auslegen. Schneide dann mit einer Stahlschere den Schädel der Maus sagittal in zwei Hälften und entferne mit einer Augenschere die Haut und das Gehirn. Entfernen Sie mit der Augenschere den Schädelknochen, bis nur noch der Augenhöhlenknochen übrig ist, und übertragen Sie die Augenhöhle in eine Präparierschale mit eiskaltem Krebs-Henseleit-Puffer auf Eis unter einem Operationsmikroskop.

Schneiden Sie den Augenhöhlenknochen mit einer Augenschere ab und verwenden Sie eine Präzisionspinzette vom Typ vier und eine Federschere von Vannas, um den Augengloben und das Augenhöhlengewebe vorsichtig zu entfernen. Entfernen Sie mit einer Präzisionspinzette vom Typ fünf und einer Kapsulotomieschere von Vannas vorsichtig die Harder'sche Drüse, das Bindegewebe und die extraokulären Muskeln und achten Sie darauf, den Hauptast der Augenarterie nicht zu beschädigen. Verwenden Sie 10-0 Nylon-Nähte, um die Orbitaäste am proximalen Ende des Hauptastes der Augenarterien zu ligieren, und verwenden Sie die Präzisionspinzette vom Typ vier, um den Augenballen in eine Petrischale mit 70% Ethanol zu übertragen.

Es ist sehr wichtig, dass alle Orbitaäste der Arteria ophthalmica ligiert werden, um Leckagen während des Experiments zu vermeiden. Nach 10 Sekunden legen Sie den Augengloben wieder in die Sezierschale. Die Hornhaut erscheint durch die Ethanol-Exposition weißlich.

Ersetzen Sie den Puffer durch frische Krebslösung und verwenden Sie das Mikroskop und eine Drei-Gauge-Nadel, um die periphere Hornhaut zu punktieren. Verwenden Sie die Kapsulotomieschere von Vannas, um die Hornhaut zu präparieren und das Irisgewebe vorsichtig abzuschneiden. Platzieren Sie dann eine spitze der Vannas Kapsulotomieschere zwischen Aderhaut und Netzhaut und schneiden Sie die Aderhaut und Sklera ab.

Um die Netzhaut in eine maßgefertigte Perfusionskammer zu montieren, schiebt man zunächst mit einem Nadelhalter das Ende einer Glasmikropipette mit einer Spitze von 100 Mikrometern Durchmesser in den Silikonschlauch der Kammer. Schließen Sie dann die Spritze an das andere Ende des Schlauchs an, um die Spitze der Mikropipette von Schmutz zu befreien. Füllen Sie die Perfusionskammer mit kaltem Krebspuffer und legen Sie die Kammer unter ein Stereomikroskop.

Platzieren Sie eine transparente Kunststoffplattform mit einer Vertiefung von 1,8 Millimetern auf zwei Stahldrähten mit einem Durchmesser von 1,6 Millimetern in der Perfusionskammer und platzieren Sie einen Edelstahlring auf der Plattform. Verwenden Sie einen Löffel, um die Netzhaut mit dem Sehnerv zu übertragen, wobei die Augenarterie noch auf der Plattform befestigt ist, und entfernen Sie das vernähte Ende der Augenarterie. Legen Sie zwei Schlaufen aus 10-0 Nylon-Naht auf die Mikropipette und befestigen Sie die Arterie mit den Nähten an der Mikropipette.

Platzieren Sie die Netzhaut mit einer Feinpunktpinzette auf der transparenten Plattform und reißen Sie mit einer zweiten Feinpunktpinzette vorsichtig die vordere Linsenkappe auf. Ziehen Sie die Linse heraus und entfernen Sie mit einer Mikroschere die gesamte Linsenkapsel und den Glaskörper. Machen Sie dann vier radiale Schnitte in die Netzhaut, die Hälfte des Abstands von der Pars plana bis zum Sehnerv und platzieren Sie den Edelstahlring auf der Netzhaut, um die Netzhaut auf der Plattform zu fixieren.

Um die retinalen Arteriolen für die Analyse vorzubereiten, übertragen Sie die Perfusionskammer unter ein Lichtmikroskop und wählen Sie die 100-fache Wasserimmersionsobjektivlinse. Schließen Sie die Schläuche an die Ein- und Auslassöffnungen einer parazyklischen Pumpe an und zirkulieren Sie die Kammer mit 37 Grad Celsius Krebspuffer, der mit 95 % Sauerstoff und kohlensäurehaltig mit 5 % Kohlendioxid angereichert ist. Verbinden Sie das mit der Mikropipette ausgestattete Silikonröhrchen über einen Dreiwege-Absperrhahn mit einem Silikonschlauch aus dem Reservoir und füllen Sie das Reservoir mit Krebspuffer bis zu einer Höhe, die 50 Millimeter Quecksilber entspricht.

Fokussieren Sie mit den Objektiven manuell auf die Netzhautoberfläche, um nach Blutgefäßen oder roten Blutkörperchen zu suchen. Wenn ein Blutgefäß gefunden wird, fokussiere dich auf das Gefäß und öffne den Dreiwege-Absperrhahn. Der Durchmesser des Gefäßes sollte sofort zunehmen und es sollten rote Blutkörperchen erscheinen.

Nach einer 30-minütigen Äquilibrierungsphase entwickeln die Arteriolen schwache Eigentöne mit einer Verringerung des luminalen Durchmessers von weniger als 10 %. Geben Sie ein Reagenz zur Einschränkung der Mausnetzhaut in die Badelösung und bestätigen Sie die Lebensfähigkeit des Gefäßes. Lassen Sie dann die Pumpe zirkulieren, um den Agonisten aus dem Bad zu waschen, und geben Sie frischen Krebspuffer in die Kammer.

In diesem repräsentativen Experiment erzeugte U46619, ein Thromboxan-Mimetikum, konzentrationsabhängige Vasokonstriktorreaktionen in retinalen Arteriolen von Wildtyp-C57Bl/6J-Mäusen zu einer etwa 50%igen Verringerung des luminalen Durchmessers von der Ruhe bei eins mal 10 auf die negative sechste molare Konzentration. In Arteriolen, die mit dem Agonisten präkonstriktiert waren, führte die kumulative Verabreichung von Acetylcholin zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg des luminalen Durchmessers auf etwa 25% des präkonstriktierten Durchmessers bei einem einmaligen 10-mal-Anstieg der negativen fünften molaren Acetylcholinkonzentration, was auf ein intaktes vaskuläres Endothel hinweist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 90 bis 120 Minuten ausgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Denken Sie beim Versuch dieser Eingriffe daran, alle retrobulbären arteriellen Äste zu ligatisieren, um das Auge in Ethanol zu tauchen, bevor Sie die Kugel öffnen, um eine Torsion der Augenarterie zu vermeiden, und schließlich die Glasspitzen der Mikropipetten auf Verschluss zu überprüfen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Netzhaut der Maus für die arterielle Messung mit Videomikroskopie in vitro vorbereiten können.