Vorbereitung von dissoziierten Maus kortikale Neuron Kulturen

Hallo, mein Name ist Hilgenberg. Ich arbeite hier an der Universität in Kalifornien in Irvine in der Abteilung für Anatomie, Neurobiologie. Heute werde ich mit Ihnen darüber sprechen, wie wir kortikale Kulturen von Mäusen präparieren.

Dies sind Mäuse nach der Geburt, von denen wir diese Neuronen präparieren. Und wir verwenden diese Kulturen in der Regel entweder für die Elektrophysiologie, für Protein- oder RNA-Präparate. Wir verwenden das gleiche Kulturpräparat für die Calcium-Bildgebung oder Natrium-Bildgebung.

Das Schöne an diesen Kulturen ist, dass es eine Adaption des Banker-Protokolls ist, aber wir züchten diese Kulturen in Abwesenheit von Glia-Feeder-Zellen, was es viel bequemer macht und die Kulturen sind in der Regel reichhaltiger an Neuronen als Gliazellen. Fangen wir also an und ich zeige Ihnen, wie wir diese Neuronen vorbereiten. Okay, jetzt sind wir an dem Punkt, an dem wir das Gehirn entfernen und mit der eigentlichen Sektion beginnen können.

Aber bevor man erwähnt, ist es wichtig zu erwähnen, dass die Deckgläser, mit denen man diese Zellen beschichten möchte, beschichtet werden müssen. Und das haben wir früher gemacht, normalerweise über Nacht bei Raumtemperatur bei einer Polylysinkonzentration von 0,1 Milligramm pro Mil. Und am nächsten Tag kommen wir, entfernen das Polylysin und waschen die Überzüge dreimal

Je nach Anwendung verwenden Sie große oder kleine Schalen oder Sie können Abdeckgläser aus Glas verwenden. Okay, das ist also der typische Aufbau für die Haube und ich habe Ihnen kurz erklärt, welche Lösungen Sie parat haben müssen und welche Instrumente sich als nützlich erweisen für die Isolierung des Gehirns, oder die Dissektion des Gehirns und dann die eigentliche Schnittung des Gehirns. Was wir hier haben, ist die Sezierlösung, die kalt ist.

Normalerweise ist es also auf Eis. Wir haben einen Viber-Slicer, den wir brauchen, um die Gehirne zu schneiden. Ich habe eines, ein Boot, das Präparierlösung enthält, auf die das Gehirn montiert und dann in Scheiben geschnitten wird.

Und ich habe verschiedene Werkzeuge, die ich brauche, um das Gehirn zu entfernen. Ich habe eine Schneckenplatte. Es ist eine 4%-Schnecke, die ich verwende, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten.

Wir brauchen eine Spritze, ein paar sterile Filter, Rotman-Papierschalen, Petrischalen in verschiedenen Größen. Und das ist mein Werkzeug zum Schlagen der Mauspipe. Ich habe hier auch Glaspipetten eingezogen.

Das sind Glaskapillaren, die ich sowohl als Präparierwerkzeug als auch zum Aufnehmen der Gehirnteile und zum Iterieren dieser im Grunde verwende. Unsere Enzymlösung enthält also eine Sezierlösung. Es ist L-Cystein enthalten, um das Pepan zu aktivieren, sowie 0,1 normales Natriumhydroxid, um den pH-Wert auszugleichen.

Sobald Sie das Pepan hinzufügen, ist die Lösung etwas undurchsichtig und muss klar werden, bevor wir sie tatsächlich für die enzymatische Verdauung des Gewebes verwenden können. Und jetzt sind wir im Grunde bereit, das Verfahren zu starten. Der Fibro Slicer ist vorbereitet.

Ich habe eine Klinge eingeführt, die mein Gehirn durchtrennt, und ich habe auch das Gefäß darunter gesteckt, das den Puffer enthält und das Gehirn stützt. Und ich bin bereit, den AGA-Block auf meine Stützplatte zu montieren, die auch das Gehirn stützt. Dieser Aga ist also ausgehärtet, es ist ein 4%Aga und ich werde einfach gehen und direkt durch einen Bereich wie diesen schneiden.

Und an den Seiten schneidet man im Grunde nur eine rechteckige Schnecke aus. Dann verwende ich einen Spachtel und hole dieses Stück einfach aus dem Schneckenblock. Und jetzt werde ich diese Schnecke mit der flachen Seite der Schnecke nach vorne auf meine Stützplatte kleben.

Das ist also die Stütze, auf die das Gehirn geklebt wird und die dann von dieser Schnecke an Ort und Stelle gehalten wird. Wenn wir also die Sektion auf diese Weise durchführen, bewegt sich das Gehirn nicht rückwärts. Jetzt sind wir bereit, das Gehirn zu entfernen.

Normalerweise verwenden wir eine P Null oder eine P Eins-Maus. Okay, das ist der abgetrennte Mauskopf und ich werde nur schnell den Sculp entfernen. Ich werde zuerst das Muskelband durchtrennen, das genau hier und auf der anderen Seite ist.

Und dann gehe ich mit meiner Schere rein. Und ich achte sehr darauf, dass die Innenseite der Schere das Gehirn nicht beschädigt. Und ich schneide auf beiden Seiten um den Schädel herum.

Und jetzt können wir einfach den Knorpel aufnehmen und ich werde mein kleines ULA verwenden und das Gehirn auf diese Weise entfernen. Dieses Gehirn kommt dann in meine Petrischale, die ich mit der Schnittlösung gefüllt habe, und sie hat ein Watman-Filterpapier auf dem Boden. Und was ich jetzt gerne machen würde, ist, die Basis des Gehirns zu schneiden, damit ich eine schöne, feste, flache Fläche habe, um das Gehirn auf meine Schulter zu montieren.

Also werde ich einen, sehr kleinen Tropfen Crazy auf meine Stützplatte geben. Ich werde jetzt mein Gehirn mit dem Spatel aufheben und ich benutze meine, meine Kurvenzange, um mir dabei zu helfen. Und was ich im Grunde tun möchte, ist, ein Blut von der überschüssigen Flüssigkeit abzutropfen, die ich aus der Sezierlösung habe, und ich werde das Gehirn gegen meine Schneckenhalterung montieren.

Jetzt sind wir bereit, das Gehirn in das Pufferbad zu überführen. Also füge ich diesem kleinen Gefäß eine Sezierlösung hinzu und ich werde die Stütze hinzufügen, die das Gehirn hält. Er wird mit dem Gehirn zur Klinge hin montiert.

Okay, das Gehirn ist jetzt montiert und ich werde den Fibro-Slicer verwenden und ich versuche, den Anfang des Gehirns zu finden, indem ich das Gehirn in Richtung der Klinge bewege. Und ich habe nur ein bisschen vom Geruchssinn weggelassen. Jetzt bewege ich meine Klinge etwa 600 Mikrometer nach unten und mache einen weiteren Schnitt, der direkt durch den Kortex gehen sollte.

Da geht der Kortex und er reitet auf die Klinge, auf die Klinge. Und ich bewege meine Klinge noch einmal 600 Mikrometer nach unten und schneide den zweiten Abschnitt. Es ist wichtig, dass dies kontinuierlich ohne Unterbrechung und schön und reibungslos geschieht.

Und wenn Sie die Klinge zurückziehen, stoppen Sie den Faserschneider. Jetzt werde ich eine Glaspipette verwenden, die ich falsch verwendet habe. Ich benutze tatsächlich das hintere Ende und werde diesen kortikalen Abschnitt hier nach oben verschieben und ihn in eine saubere Petrischale übertragen.

Ich gehe durch das Gehirn, immer 600 Mikrometer, bis ich etwa fünf bis sechs Scheiben für eine P null oder P eins Maus gesammelt habe. Und bis ich ganz am Ende des Kortex ankomme. Und wir sind jetzt bereit, den Kortex vom Rest des Gehirns zu isolieren.

In Ordnung, also benutze ich diese Glaspipetten, die so scharf gezogen werden wie Präparierwerkzeuge. Und normalerweise beginne ich mit dem ersten Abschnitt, den ich habe, der kleinste und der Geruchssinn, den wir entfernen müssen. Und ich versuche auch, die Hirnhäute aus dieser Vorbereitung zu entfernen.

Entfernen Sie wieder den Geruchssinn dieses Stücks, schälen Sie es, schälen Sie es von den Hirnhäuten. Manchmal gibt es Teile, die man nicht so leicht trennen kann, also mach einfach weiter und lass diese hinter den guten Stücken. Ich bewege mich immer auf ein Ende zu und arbeite mich durch einen Abschnitt nach dem anderen.

Es ist wichtig, dass Sie die Hirnhäute loswerden, und auch wenn Sie sich diese Abschnitte ansehen, möchten Sie sie manchmal umdrehen, damit Sie besser sehen können, wo sich der Fasertrakt befindet, der die meisten nicht-neuronalen Zellen enthält, die Sie in diesem Präparat nicht wirklich haben möchten. Okay, in diesem Abschnitt können Sie diesen Fasertrakt unter der kortikalen Schicht deutlich sehen. Also stiche ich genau dazwischen, wo die kortikale Schicht endet, und ich zeige auf den Fasertrakt, der die meisten neuronalen nicht-neuronalen Zellen enthält, die wir in dieser Vorbereitung zu vermeiden versuchen.

Also schneide ich entlang dieser Linie und versuche, die Faserbahnen hinter mir zu lassen. Dies ist der Schritt, bei dem Sie das Gewebe in kleine Würfel hacken. In Ordnung, ich sterilisiere meine Enzymlösung jetzt durch einen 0,2-Mikron-Filter, der an einer Spritze befestigt ist.

Und das füge ich direkt auf meine kortikalen Stücke hinzu, einfach so. Achten Sie darauf, dass genügend Flüssigkeit vorhanden ist, die alle kortikalen Teile umgibt und diese kortikalen Teile dann für 30 Minuten in einen 37 Grad heißen Inkubator kommen, der das Gewebe ganz erheblich lockern sollte. Es sind also 30 Minuten vergangen, dass diese kortikalen Teile im Inkubator inkubiert wurden.

In der Zwischenzeit habe ich einige neurobasale Medien mit B 27 Supplement erwärmt, in denen diese Zellen schließlich landen. Ich habe hier auch einige Lösungen vorbereitet. Die erste ist die Sezierlösung.

Es ist also eine einfache Sezierlösung. Dann werden sie in eine Lösung mit hohem Trypsin-Inhibitor übertragen, die BSA als Fänger und ein PV enthält, um die NMDA-Rezeptorkomponente zu blockieren. Und dann durchlaufen sie drei Waschgänge mit niedrigem Trypsin-Inhibitor BSA und A PV. Ich werde diese Stücke jetzt aus der Propanlösung entfernen und sie in ein konisches Röhrchen mit DS-Dissektionslösung übertragen.

Diese Klumpen bewegen sich einfach durch die Schwerkraft nach unten und es kann ein oder zwei Minuten dauern, bis sie sich alle im konischen Teil der Röhre abgesetzt haben. Und dann nehme ich sie einfach wieder auf und übertrage sie in die Lösung, die den hohen Trypsin-Inhibitor enthält. Und auch hier wollen wir warten, bis sich diese Klumpen am Boden der Röhre absetzen.

Es gibt eine weitere Wäsche durch eine Lösung mit hohem Trypsin-Inhibitor und dann werden diese Klumpen in einem niedrigen Trypsin-Inhibitor gewaschen. Nach meiner letzten Wäsche und dem niedrigen Enzyminhibitor werde ich die Zellen in meinem vorwarmen Neuro-Basalmedium übertragen und ich beginne, die Zellen mechanisch zu dissoziieren, indem ich sie in einer Glaskapillare mit abnehmender Bohrungsgröße auf und ab trippe. Ich gehe jetzt zu den Zellen und das Gewebe verklumpt.

Aber bevor ich das tue, werde ich alle Trümmer entfernen, die hier zu sehen sind. Es gibt zum Beispiel Proteine und DNA, die aus den Zellen austreten und diesen Wattebausch bilden, wie Stoff, der an den Gewebeklumpen hängt. Sie möchten diese zuerst entfernen, weil sie Ihre Pipettenspitze verstopft und Sie das Gewebe durch zwei kleinere Durchmesser drücken.

Und dann werde ich einige dieser Glaskapillaren aufbrechen, um die richtige Öffnung zu bekommen, um meine Zellen in die Öffnung hinein und aus ihr heraus zu bewegen. Dies ist eine gute Pipette. Hier sieht man, dass es schön rund ist und keine scharfen Kanten hat.

Ich werde das in meinen Mauspfeifenschläger stecken. Dazwischen befindet sich ein 0,2-Mikron-Filter, und ich werde nun das Gewebe in meine Glaskapillare hinein- und herausbewegen. Der erste Vorgang sollte also ziemlich reibungslos ablaufen, da die Gewebeklumpen nicht viel größer sind als die Pipettenöffnung.

Alles, was Sie tun möchten, ist, das Gewebe zu lockern. Und dann gehe ich mit einer etwas kleineren Pipettenspitze hinein. Ich hätte gerne eine schöne, saubere, runde Pipettenspitze.

Das sieht gut aus. Und wieder werden alle Klumpen auf einmal in das Rohr hinein und wieder heraus bewegt. Das Gewebe ist jetzt sehr weich und aufgelockert, so dass die Zellen im Grunde herausfallen, wenn man diese Klumpen in Medien aufhängt.

Ich werde jetzt alle meine dissoziierten Zellen in ein frisches konisches 15-Milliliter-Milliliter-Röhrchen überführen und sie vielleicht noch zwei oder drei weitere Male kühlen, vorsichtig auf und ab, um Zellen aufzubrechen, die sich noch in diesen größeren Klumpen befinden. Und dann wollen wir ein oder zwei Minuten warten, bis sich die großen Stücke, die noch da drin sind, gesetzt haben. Es kann auch sein, dass du Glasstücke von deinen Glaskapillaren abgebrochen hast und die sich auf dem Boden absetzen sollten.

Und dann können wir Aliquots davon verwenden, um sie auf vollständig beschichtete Deckgläser oder Schalen zu plattieren. Und ich plattiere 80 Mikroliter auf dieses Glasdeckglas, das zuvor mit Polylysin beschichtet wurde, und es bildet sich eine schöne Blase. Die Zellen setzen sich schließlich ab und haften an dem Glasdeckglas.

Nach etwa einer Stunde haben sich die Zellen abgesetzt und ich werde ganz vorsichtig etwas mehr Medium auf das gesamte Gericht geben. Kann ihm so einen sanften Wirbel geben. Und dann kommen diese Zellen bei 37 Grad in den Inkubator und morgen füttere ich sie mit konditionierten Medien.

Aber gut, das sind die kortikalen Zellen. Sie sind nur ein bisschen weniger als einen Tag alt. Sie wurden gestern plattiert und man kann sehen, dass es viele Neuronen gibt, alle haben viele Lungenneuronen, und es gibt auch einige Zelltrümmer darin.

Das sind die Zellen, die es nicht geschafft haben. Und diese werden sich in den nächsten Fütterungen auswaschen. Bei den abgestorbenen Zellen handelt es sich um die sehr kleinen Rundzellen mit den gekräuselten Membranen.

Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie Sie diese dissoziierten kortikalen Kulturen vorbereiten können. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass, wenn Sie die kortikale Rinde aus den Gehirnschnitten entfernen, Sie sie von der Daumen-Sala-Kortikalfaser trennen, da sie viele nicht-neuronale Zellen enthält. Auch wenn Sie die Zellen schätzen, sind sie nicht vorbei, da dies im Grunde die meisten der isolierten Zellen tötet, die Sie bis jetzt erzeugt haben.

Gehen Sie also vorsichtig mit den Gewebescheiben um und Sie werden eine schöne Kultur haben. Viel Glück bei Ihren Experimenten.