Name: Vorbereitung von dissoziierten Maus kortikale Neuron Kulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 2 s
Description: Lernen Sie die Herstellung dissoziierter kortikaler Neuronenkulturen aus postnatalen Mäusen für Elektrophysiologie und Calcium-Imaging. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Entwicklung und genetischer Mutationen.

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Vorbereitungen vor dem Tag der Kultivierung: <ul><li> Bereiten Sie sterile Sezieren Lösung (DS). </li><li> Bereiten NBM/B27 (Neurobasal Mediom mit B27-Ergänzungsmittel). </li><li> Autoclave ddH 2 O und sterilisieren Glas coversilps, wenn nötig. </li><li> Coat Gewebekulturschalen oder Deckgläser mit Poly-D-Lysin. </li></ul> Poly-D-Lysin-Beschichtung: Bereiten Sie den Tag vor Kultivierung unter sterilen Bedingungen. <ul><li> Thaw Aliquot 10X PDL und auf Eis stellen. </li><li> Add 9 ml sterile ultra-gefiltertes Wasser zu 1 ml PDL und gut mischen (1X). </li><li> Coat Oberflächen mit 1X PDL über Nacht bei Raumtemperatur wie folgt: <ul><li> Deckgläser (Bellco Glass, Inc. Cat # 1943-00012.): 75 ul / Deckglas OR </li><li> 24 well Zellkulturplatten: 300 ul / well OR </li><li> 35mm Kulturschale: 1ml/dish </li></ul></li><li> Spülen 5X mit sterilem Wasser (benutzen sterile Pasteur Pipetten auf Flüssigkeitsaufnahme). </li><li> Entfernen Sie das Wasser bis die Oberfläche vollständig trocken ist. </li></ul> Die Kultivierung Verfahren (done in Laminarströmungshaube unter sterilen Bedingungen) <ol><li> Cut out-Block-Agar und klebe sie auf die Unterstützung Block des Mikrotoms Vibraslicer (Campden Instruments Ltd) mit Sekundenkleber. </li><li> Bei der Verwendung von späten Embryonalstadium (E17-18) Mäusefeten, einschläfern Damm, zu entfernen Gebärmutter und freie Individuum Föten aus embryonalen Sack. Legen Sie Föten in sterile Petrischale und dann weiter wie unten beschrieben. </li><li> Enthaupten Maus Fötus oder Welpe (folgen Richtlinien von Ihrem Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt). </li><li> Entfernen Sie Haut und Schädel und Gehirn statt auf Whatman Filterpapier Festplatte in einer 60mm-Petrischale mit kaltem DS gefüllt. </li><li> Schneiden Sie das Kleinhirn mit einer sterilen Rasierklinge. </li><li> Pick up Gehirn mit einem Spatel und Drain überschüssige Flüssigkeit auf Filterpapier, dann Transfer Gehirn Vibraslicer Stützblock und Leim Gehirn statt (kaudalen Seite nach oben und ventralen zugewandte Teil Agar). </li><li> Kammer füllen mit kaltem DS. Set-Gang-Wahlschalter auf 8-9. </li><li> Cut 200-400 um Abschnitte, beginnend ab Riechkolben. Sobald die Klinge des Vibraslicer in die Hirnrinde, beginnen Schneiden 600μm koronalen Abschnitte. Ein E17-18 Maushirn typischerweise Erträge 3-4 brauchbare Scheiben, während ein P0 Maushirn Erträge 4-5 brauchbare Scheiben schneiden. </li><li> Transfer Hirnschnitten bis 35 mm Petrischale beschriftet DS 2 mit umgekehrter Ende un-plugged 10 ml Glas Pasteur-Pipette. </li><li> Dissect aus Rinde und entfernen Meningen mit Glas Nadeln von Kapillaren gezogen. </li><li> Cut kortikalen Rinde in kleine Stücke, 0,5-1 mm in der Länge. </li><li> Filter ES durch 0,2 um-Filter an einer 5-ml-Spritze in eine 35 mm Petrischale. </li><li> Übertragen Sie die kortikale Gewebestücke zu Petrischale mit gefilterten ES. </li><li> Bei 37 ° C für 30 min. </li></ol> In der Zwischenzeit: <ol><li> Clean up Kapuze, Vibraslicer und seziert Werkzeuge. </li><li> 5 ml warmem NBM/B27 in eine 60 mm Petrischale. </li></ol> Nach 30 min. Inkubationszeit: <ol><li> Transfer-Gewebe auf 10 ml DS. Lassen Sie regeln für 1 min. </li><li> Transfer-Gewebe zum ersten Hallo Röhre wirbelt und lassen niederlassen für 2-3 min. </li><li> Übertragen auf den zweiten Hallo. Wiederholen Sie wie oben beschrieben. </li><li> Transfer zum ersten Li. Wiederholen Sie wie oben beschrieben. </li><li> Übertragen auf den zweiten Li. Wiederholen Sie wie oben beschrieben. </li><li> Weitergabe an Dritte Li. Wiederholen Sie wie oben beschrieben. </li><li> Transfer-Gewebe, die 60 mm Schale mit Medien. </li></ol> Unter dem Dissektionsmikroskop: <ol><li> Reinigen Sie Schmutz von Gewebe und verreiben jedes Stück durch leichtes Passieren einer gezogenen Glaspipette (Verwendung abnehmende Bohrungen) zur Auflockerung des Gewebes. </li><li> Transfer-Zellsuspension zu 15 ml konische Röhrchen mit dem Rest der NBM + B27 (Einen insgesamt 13 ml für eine 24-Well-Platte oder 11 ml für 5 -. 35 mm Schalen vorsichtig mischen und warten große Gewebestücke zu begleichen). </li><li> Transfer-Zell-Suspension (0,5 ml / well einer 24-Well-Platte oder 2 ml / 35 mm Kulturschale). </li><li> Bei der Verwendung von Deckgläsern, fügen Sie 80 ul Zellsuspension pro Deckglas und erlauben für 1 Stunde in Gewebekultur-Inkubator für die Zellen vor dem Hochwasser der Kammer mit mehr NBM/B27 Medien einhalten. </li><li> Behalten Kulturen bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> Next Day 24 well Platte: Feed jedes Well mit 0,5 ml nicht-neuronalen Zellen konditioniert NBM/B27 Medium (cNBM/B27; Protokoll für die Vorbereitung der cNBM/B27 Medium erscheint unten) 35mm Speisen: Ersetzen Sie 0,5 ml mit cNBM/B27 Medium. Behalten Kultur durch den Austausch mit 0,5 ml Medium mit frischem cNBM/B27 alle 2-3 Tage. Obwohl die Kulturmedien nicht fördert Glia Zellproliferation, können Kulturen mit 5 &amp;mgr; M FDU (5-Fluoro-2&#39;-desoxyuridin, Sigma F0503) an Tag 3-5 in Kultur behandelt werden zur weiteren Reduzierung der Anzahl von Gliazellen, wenn nötig. SET<html> -UP für Dissection und Kultur Sterilisieren Sezieren Tools in 70% EtOH oder Autoklaven ihnen: <ul><li> Scissors (med. und klein) Spatel (med. und klein) </li><li> Pinzette (med. und klein) Razor Blade </li><li> Blade für vibraslicer Buffer Bad </li><li> Kleiner Metall-Keil für Blade-Unterstützung für Gehirn </li></ul> Andere Materialien: <ul><li> Petrischalen (60 mm) </li><li> Petrischalen (35 mm) </li><li> Filterpapier </li><li> Glaspipette 10 ml </li><li> Sterile Einweg-Pipetten, 5,10 und 25 ml </li><li> Syringe Filter, 0,2 &amp;mgr; </li><li> Spritze 5 ml </li><li> Zentrifugenröhrchen, 15 ml </li><li> Sterile Pasteur Glaspipetten </li><li> PDL beschichteten Kulturschalen oder Deckgläser </li></ul> Label sechs 15 ml-Zentrifugenröhrchen und folgen Sie der Zubereitung: Tube # 1: Enzymlösung: Add 50 U Papain (Worthington LS 03126) bis 5 ml DS enthält: <ul><li> 100 &amp;mgr; l von L-Cystein (0,8 mg) </li><li> 7 ul 0,1 N NaOH </li><li> 50 pl APV (5mm) </li></ul> Leave-Lösung bei Raumtemperatur zu löschen. Beachten Sie, dass Enzymlösung erscheint &quot;bewölkt&quot; auf den ersten und muss vor dem Gebrauch zu löschen. Tube # 2 &amp; # 3: Hallo Enzyme Inhibitor: 3 ml DS + 300 ul BSA / Ti + 30 ul APV (5mm). Vorsichtig mischen, um Luftblasen zu vermeiden, dann in zwei 1,5 ml Aliquots aufzuteilen. Tube # 4 - # 6: Low Enzyme Inhibitor: 8 ml DS + 80 ul BSA / Ti + 80 ul APV (5mm). Vorsichtig mischen, um Luftblasen zu vermeiden, in drei 2,6 ml Aliquots aufzuteilen. Die Röhrchen durchnummeriert # 2 bis # 6 auf dem Eis. Lassen Röhre # 1 (Enzymlösung) bei Raumtemperatur. SOLUTIONS und Aliquots <ul><li> Lösung A (Kochsalzlösung) Sigma Formel wt 500 ml [conc.] </li><li> Natriumchlorid NaCl S-9625 58,45 80.0g 137mm </li><li> Kaliumchlorid KCl P-4504 74,56 4.0g 5.4mm </li><li> Natriumdihydrogenphosphat wasserfreies Na 2 HPO 4 S-0876 142,0 0.24g 0,17 </li><li> Kaliumphosphat Einbasisches wasserfrei KH 2 PO 4 P-5379 136,09 0,3 g 0,22 mm </li></ul> Wiegen Sie alle Zutaten und mischen, bis auflösen mit 400 ml ultra-gefiltertes Wasser. Bringen Endvolumen von 500 ml. Legen Sie in eine saubere Flasche und Autoklaven. Lagerung bei 4 ° C und label &quot;DS-Lösung A&quot;. <ul><li> Lösung B (Hepes) Sigma Formel wt 250 ml [conc.] </li><li> Hepes Hepes H-3375 283,3 20.97g 9.9mm </li></ul> Fügen Sie ultra-gefiltertes Wasser bis zu 200 ml. Mix bis zur Lösung und bringen Endvolumen von 250 ml. Legen Sie in eine saubere Flasche und Autoklaven. Lagerung bei 4 ° C und label &quot;DS-Lösung B&quot;. <ul><li> Working-Lösung 500 ml [conc.] </li><li> Ultra-gefiltertes Wasser 400 ml </li><li> Stammlösung A 25 ml </li><li> Stammlösung B 14 ml </li><li> D (+)-Glucose Sigma G-8270 3.0 g 33.3mm </li><li> Sucrose Sigma S-0389 7,5 g 43,8 mm </li></ul> Der pH-Wert auf 7,4 mit 1 N NaOH. Bringen Endvolumen von 500 ml mit ultra gefiltertes Wasser. Dekantieren in eine saubere Glasflasche und Autoklaven. Lagerung bei 4 ° C. Label &quot;Dissecting Solution&quot;. Poly-D-Lysin Zubereitung: <ol><li> Bereiten 10x Stammlösung von Poly-D-Lysin (PDL, Sigma P-7280) in sterilem H 2 O bei 1mg/ml. </li><li> Machen Sie 1,0 ml Aliquots. Diese Lösung kann bei -20 ° C gelagert werden bis zu 3 Monaten. </li></ol> MEDIA <ol><li> Fügen Sie 10ml der B-27 Supplement (Gibco 17504-044) auf 500 ml NBM Flasche (Neurobasal Medium, Gibco 21103-049). </li><li> Machen Sie 40 ml aliquotiert und bei 4 ° C. </li></ol> APV <ol><li> 10 ml sterilem H 2 O zu Durchstechflasche mit 10 mg APV (2-Amino-5-phosphonopentanoic acid, Sigma A-5282) und gründlich mischen. </li><li> Bereiten Sie 180 ul Aliquots und bei -20 ° C. </li></ol> BSA / Ti <ol><li> 1 g BSA (Bovine Albumin. Sigma A-7030) und 1 g Trypsin Inhibitor (Sigma T-9253) in 10 ml DS. </li><li> Der pH-Wert auf 7,4 mit 1 N NaOH. </li><li> Sterilisieren durch Filtration über 0,2 &amp;mgr; Spritzenfilter. </li><li> Teilen Sie sich in 400 ul Aliquots und bei -20 ° C. </li></ol> L-Cystein In einem Eppendorf-Röhrchen lösen 0,6 mg L-Cystein (Sigma C-7755) in 200 ul DS. AGAR (4%) <ol><li> 4 g Bacto Agar (Difco 0140-01) in 100 ml sterilem Wasser. Halten Sie bei 4 ° C bis zur Kultur benötigt. </li><li> Mikrowelle Agar zu schmelzen und füllen eine 35 mm Petrischale. Lassen Sie sitzen, um abzukühlen und zu polymerisieren. </li></ol> Papain (Worthington LS 03126) e_title &quot;&gt; nicht-neuronalen KULTUREN IN NUNC Kulturflaschen COATING Kulturflasche (4 Nunc Flaschen) <ol><li> Add 9 ml sterilem Wasser zu jedem der 3 Röhrchen 10X PDL auf 1X PDL machen. </li><li> Transfer 30 ml 1X PDL in der ersten Flasche. </li><li> Bewegen Sie etwas, bis alle das Wachstum Flächen abgedeckt werden. Lassen Sie sitzen für 1 min. </li><li> Transfer 1x PDL auf den zweiten Flasche. Lassen Sie sitzen für 1 min. </li><li> Wiederholen Sie mit dem dritten und vierten Flaschen. </li><li> Spülen Sie alle vier Flaschen 2X mit 150 ml sterilem H 2 O. </li></ol> PREPARE Enzymlösung (ES): <ol><li> In einem 0,6 ml Zentrifugenröhrchen Gewicht aus 0,8 mg L-Cystein (Sigma C7755), add 150ml DS und vortexen, bis Kristalle gelöst sind. </li><li> Jeweils 5 ml DS zu einem 15 ml konischen Rohr, dann fügen Sie 150ml L-Cystein. </li><li> Fügen Sie 50 Einheiten Papain. (Worthington LS 03126) </li><li> Add 7ml 0,1 N NaOH. </li></ol> PREPARE MEM (GIBCO # 11090-081) <ol><li> Nehmen Sie 65 ml aus der 500 ml Flasche MEM. Sparen Sie 10 ml auf Glucose vorzubereiten. </li><li> 5 ml Pen / Strep (Gibco # 15070-063). </li><li> 10 ml 1M Glucose (Sigma G-8270) (1,8 g / 10 ml MEM) </li><li> 50 ml Fetal Bovine Serum (Gibco # 16140-071) oder bovinem Kälberserum (Omega BC-04). </li><li> Gut mischen, Aliquot und lagern bei 4 ° C. </li></ol> Neurobasalmedium MEDIUM/B-27 Supplement (NBM/B27) NBM, 500 ml (Gibco # 21103-049); B-27 (50x), 10 ml (Gibco # 17504-044) <ol><li> Fügen Sie den gesamten Inhalt des B-27 Fläschchen der NBM Flasche und mischen. </li><li> Aliquotieren und lagern bei 4 ° C. </li></ol> DISSECTION des Hirngewebes <ol><li> Dry Sezieren Tools von 70% EtOH vor ihrer Zerlegung. </li><li> Transfer 10 ml DS in jedem von 3-15 ml Tube. </li><li> Wählen Sie mit der Maus Welpen (P0 - P3), werden Sie drei Gehirne für 4 Flaschen müssen. </li><li> Add kalten DS bis 35 mm Petrischale. </li><li> Enthaupten Maus pup und sezieren aus Gehirnen. </li><li> Legen Gehirn in der Petrischale mit kaltem DS. </li><li> Hacken Gewebe in Stücke klein genug, um durch eine Glaspipette passieren. </li></ol> ENZYME Dissoziation <ol><li> Entfernen Sie so viel DS wie möglich aus der Schale mit einer Pasteurpipette. </li><li> Filter ES durch einen 0,2 um Filter und 5cc Spritze. </li><li> Legen Sie ES in die Schale mit Gewebe. </li><li> Inkubieren Gewebe bei 37 ° C Inkubator (CO 2-frei) für 30 min. </li></ol> WASCHEN TISSUE <ol><li> Transfer-Gewebes mit Glaspipette zum ersten DS Rohr, was Sie so wenig ES wie möglich zu erhalten. </li><li> Zentrifuge für 30 sec bei 1500 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Transfer-Gewebe und wiederholen Sie den Vorgang zwei weitere Male. </li></ol> Verreibung <ol><li> Platz 38 ml MEM / FBS in ein 50ml-Zentrifugenröhrchen </li><li> 3 ml MEM / FBS auf eine 35 mm-Schale und Transfer Gewebe dieser Petrischale. </li><li> Distanzieren das Gewebe durch leichtes Verreiben es durch eine 1000μl eppendorf Pipettenspitze. </li><li> Transfer-Zell-Suspension auf die Tube mit 38ml der MEM / FBS und gut mischen. </li></ol> PLATING <ol><li> Stand der Kultur-Flaschen aufrecht zu gleichen Mengen der Zellsuspension und Medien in jede Flasche zu bekommen. </li><li> Setzen Sie 90 ml MEM / FBS in jeder Kultur Flasche. </li><li> 10 ml Zellsuspension in jede Flasche. </li><li> Label: Non-Neuronal, Initialen und das Datum. Bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> FÜTTERUNG <ol><li> Am Tag 3 oder 4, Futtermittel-Zellen mit warmem MEM / FBS (dekantieren alle Medien und ersetzen Sie es mit 100 ml MEM / FBS). Kulturen können 7-10 Tage, um sich konfluent. </li><li> Am Tag 7-10 Veränderung der Medien für NBM/B27. </li><li> Am nächsten Tag sammeln die Medien. Filter mit 0,22 &amp;mgr; m </li><li> Machen Aliquots von 40 ml und Futtermitteln Kultur mit MEM / FBS. </li><li> Next 2 oder 3 Tage, ändern Medien für NBM/B27 </li><li> Am nächsten Tag, zu sammeln und den Vorgang wiederholen. </li><li> Halten Sie sammeln Medien für ca.. 2 Wochen. </li></ol>

Die Autoren haben keine Offenlegungen vorzunehmen.

<table><tbody><tr><td>5-Fluoro-2&amp;rsquo;-deoxyuridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Vibraslicer</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat, dibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat, monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>B27-Zusatz</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-Medium (NBM)</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-5-phosphonopentansäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>Rinder-Serumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsininhibitor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid, 1N-Lösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS 03126</td><td></td></tr><tr><td>Steriler 0,2 &amp;mu;m-Spritzenfilter</td><td>Fisher Scientific</td><td>DDA02025S0</td><td></td></tr><tr><td>Glas-Deckgläser, No1, 12 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-00012</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11090-081</td><td>mit Earle&amp;rsquo;s Salzen, ohne L-Glutamin, erforderlich zum Kultivieren nicht-neuronaler Zellen</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>für nicht-neuronale Kulturen</td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td>erforderlich für nicht-neuronale Kulturen</td></tr><tr><td>Nunclon &quot;Triple Flask&quot; Zellkulturgefäß</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-25</td><td>Verwendung für nicht-neuronale Kulturen. Diese Flaschen sind sehr praktisch zur Herstellung von &quot;vorbehandeltem Neurobasal-Medium/B27&quot;, aber auch andere Zellkulturgefäße oder -schalen können verwendet werden.</td></tr><tr><td>Glasboden-&quot;Imaging-Schalen&quot;</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>Glasbodenschalen, 35 mm, ideal für Calcium- oder Natrium-Imaging bei Verwendung einer invertierten Mikroskopieanordnung. Aber teuer!</td></tr></tbody></table>

vorbereitung von dissoziierten maus kortikale neuron kulturen

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Dieses Video wird Sie durch den Prozess zur Erzeugung von kortikalen neuronalen Kulturen vom späten Embryo und frühen postnatalen Gehirn der Maus. Diese Kulturen können für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Immunzytochemie, Biochemie, Elektrophysiologie, Calcium und Natrium Imaging-, Protein-und / oder RNA-Isolierung verwendet werden. Diese Kulturen auch eine Plattform, um die neuronale Entwicklung von transgenen Tieren, die ein Ende der embryonalen oder postnatale tödlichen Gen-Mutation tragen zu studieren. Das Verfahren ist relativ einfach, erfordert eine gewisse Erfahrung in der Gewebekultur Technik und sollten nicht länger als zwei Minuten vor drei Stunden, wenn Sie richtig vorbereitet sind. Eine sorgfältige Trennung der kortikalen Rinde von den thalamo-kortikalen Fasern Trakt verringert sich die Anzahl der unerwünschten nicht-neuronalen Zellen. Zur Erhöhung der Erträge von neuronalen Zellen verreiben die Stücke des kortikalen Gewebes sanft nach der Enzyminkubation Schritt. Dies ist zwingend notwendig, da es unnötige Verletzungen verhindert, Zellen und vorzeitigem Zelltod. Da diese Kulturen in der Abwesenheit von Gliazellen Feeder-Zellen gehalten werden, sie bieten auch einen zusätzlichen Vorteil der wachsenden Kulturen in Neuronen angereichert.

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Erzeugung von neuronalen Kulturen vom späten Embryo und frühen postnatalen Maus Kortex. Diese Kulturen können für Immunzytochemie, Biochemie, Elektrophysiologie, Calcium und Natrium Bildgebung verwendet werden und bieten eine Plattform, um die neuronale Entwicklung von transgenen Tieren, die ein postnatale tödlichen Gen-Mutation tragen zu studieren.

Vorbereitung von dissoziierten Maus kortikale Neuron Kulturen

Dieses Video wird Sie durch den Prozess der Generierung kortikaler Neuronenkulturen aus späten Embryonen und dem frühen postnatalen Mausgehirn führen. Diese Kulturen ...

Hallo, mein Name ist Hilgenberg. Ich arbeite hier an der Universität in Kalifornien in Irvine in der Abteilung für Anatomie und Neurobiologie. Heute werde ich Ihnen erläutern, wie wir kortikale Kulturen von Mäusen herstellen.Dies sind Mäuse am postnatalen Tag, von denen wir diese Neuronen gewinnen. Üblicherweise verwenden wir diese Kulturen entweder für Elektrophysiologie oder für die Gewinnung von Protein oder RNA. Die gleiche Kulturpräparation nutzen wir für Calcium-Bildgebung oder Natrium-Bildgebung.Das Schöne an diesen Kulturen ist, dass es sich im Grunde um eine Abwandlung des Banker-Protokolls handelt, aber wir kultivieren diese Zellen ohne gliale Fütterzellen, was die Handhabung deutlich einfacher macht, und die Kulturen enthalten in der Regel mehr Neuronen als gliale Zellen. Beginnen wir also, und ich zeige Ihnen, wie wir diese Neuronen präparieren. Gut, jetzt sind wir so weit, dass wir das Gehirn entnehmen und mit der eigentlichen Dissektion beginnen können.Doch vorher ist es wichtig zu erwähnen, dass die Deckgläser, in denen Sie diese Zellen kultivieren möchten, beschichtet werden müssen. Üblicherweise erfolgt dies über Nacht bei Raumtemperatur mit einer Polylysin-Konzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter. Am nächsten Tag entfernen wir das Polylysin und waschen die Deckgläser dreimal nacheinander. Je nach Anwendung verwenden Sie große oder kleine Schalen oder Sie können Deckgläser verwenden. Gut, dies ist die typische Einrichtung für den Abzug, und ich habe Ihnen kurz erklärt, welche Lösungen Sie vorbereitet haben sollten und welche Instrumente für die Isolierung beziehungsweise die Dissektion des Gehirns sowie für den eigentlichen Schnitt des Gehirns hilfreich sind. Was wir hier haben, ist die kalte Dissektionslösung.Normalerweise liegt es auf Eis. Wir verfügen über einen Vibrationschneider, mit dem wir die Gehirne schneiden müssen. Ich habe ein Bad, das Schnittlösung enthält, in dem das Gehirn montiert und anschließend geschnitten wird.Und ich habe verschiedene Werkzeuge, die ich für die Entnahme des Gehirns benötige. Ich habe eine Bohrplatte. Es ist eine 4%-Bohrvorrichtung, die ich verwende, um das Gehirn an Ort und Stelle zu halten.Wir benötigen eine Spritze, einige sterile Filter, Rotman-Papierschalen und Petrischalen verschiedener Größen. Und dies ist mein Werkzeug zum Schlagen von Mausrohren. Außerdem habe ich hier gezogene Glaspipetten.Das sind Glas-Kapillaren, die ich sowohl als Dissektionswerkzeuge verwende als auch, um die Gehirnstücke aufzunehmen und im Wesentlichen zu durchlaufen. Unsere Enzymlösung enthält daher Dissektionslösung. Darin befindet sich L-Cystein zur Aktivierung der Pepsinase sowie 0,1 normale Natronlauge zur Einstellung des pH-Werts.Nachdem Sie das Pepan zugegeben haben, ist die Lösung etwas trüb, und sie muss sich klären, bevor wir sie tatsächlich zur enzymatischen Gewebeverdauung verwenden können. Jetzt sind wir im Grunde bereit, mit dem Verfahren zu beginnen. Der Fibro-Slicer wurde vorbereitet.Ich habe eine Klinge eingesetzt, die mein Gehirn schneidet, und außerdem den Behälter darunter befestigt, der den Puffer enthält und das Gehirn stützt. Nun bin ich bereit, den AGA-Block auf meine Trägerplatte zu montieren, die ebenfalls das Gehirn stützen wird. Dieses Agar hat ausgehärtet, es handelt sich um 4 % Agar, und ich werde nun direkt durch einen Bereich wie diesen schneiden.Und an den Seiten wird im Grunde nur eine rechteckige Schnecke ausgeschnitten. Dann nehme ich einen Spatel und hebe dieses Stück aus dem Schneckenblock heraus. Nun werde ich diese Schnecke mit der flachen Seite nach vorne auf meine Trägerplatte kleben.Das ist also die Unterlage, auf die das Gehirn geklebt wird und die es mit dem Bohrer fixiert hält. Wenn wir nun in dieser Richtung schneiden, bewegt sich das Gehirn nicht rückwärts. Jetzt sind wir bereit, das Gehirn zu entnehmen.Normalerweise verwenden wir eine P0- oder P1-Maus. Gut, dies ist der abgetrennte Mauskopf, und ich werde nun schnell die Haut entfernen. Zuerst schneide ich den Muskelstrang hier und auf der gegenüberliegenden Seite durch.Dann gehe ich mit meiner Schere hinein. Dabei achte ich sehr darauf, dass die Innenseite der Schere das Gehirn nicht beschädigt. Ich schneide auf beiden Seiten um den Schädel herum.Und jetzt können wir einfach den Knorpel anheben, und ich werde meine kleine ULA verwenden, um das Gehirn auf diese Weise zu entfernen. Dieses Gehirn kommt dann in meine Petrischale, die ich mit Schnittlösung gefüllt habe und die ein Watman-Filterpapier auf dem Boden enthält. Als Nächstes möchte ich die Basis des Gehirns abschneiden, sodass ich eine schöne, feste, ebene Fläche habe, um das Gehirn auf meiner Schulter zu befestigen.Ich werde nun einen sehr kleinen Tropfen Kleber auf meine Trägerplatte geben. Ich nehme mein Gehirn mit dem Spatel auf und verwende meine gebogenen Pinzette, um mir dabei zu helfen. Was ich tun möchte, ist im Grunde, einen Tropfen der überschüssigen Flüssigkeit abzutropfen, die ich von der Dissektionslösung habe, und dann werde ich das Gehirn an meiner Bohrerstütze befestigen.Jetzt sind wir bereit, das Gehirn in das Pufferbad zu überführen. Ich gebe also Dissektionslösung in dieses kleine Gefäß und werde die Halterung hinzufügen, die das Gehirn trägt. Es wird so montiert, dass das Gehirn zur Klinge hin ausgerichtet ist.In Ordnung, das Gehirn ist nun befestigt und ich werde den Fibro-Schneider verwenden, um den Anfang des Gehirns zu finden, indem ich das Gehirn in Richtung der Klinge bewege. Ich habe gerade ein kleines Stück des Riechkolbens abgeschnitten. Nun bewege ich meine Klinge etwa 600 Mikrometer nach unten und führe einen weiteren Schnitt durch, der genau durch die Großhirnrinde verlaufen sollte.Da geht die Hirnrinde mit hoch und rutscht auf die Klinge. Und ich bewege meine Klinge weitere 600 Mikrometer nach unten und schneide den zweiten Abschnitt. Es ist wichtig, dass dies kontinuierlich, ohne Unterbrechung und gleichmäßig durchgeführt wird.Und wenn Sie die Klinge zurückziehen, stoppen Sie den Faserschneider. Nun werde ich eine Glaspipette verwenden, die ich falsch herum benutze. Tatsächlich benutze ich das hintere Ende und werde diesen kortikalen Schnitt hier hineinbewegen und in eine saubere Petrischale überführen.Ich arbeite mich durch das Gehirn, jeweils 600 Mikrometer, bis ich etwa fünf bis sechs Schnitte von einer P-null- oder P-eins-Maus gesammelt habe. Und bis ich ganz am Ende der Großhirnrinde angekommen bin. Nun sind wir bereit, die Großhirnrinde vom restlichen Gehirn zu isolieren.Also, ich verwende diese Glaspipetten, die gezogene Glaspipetten sind und so scharf wie dissezierende Werkzeuge. Normalerweise beginne ich mit dem ersten Abschnitt, den ich erhalten habe, dem kleinsten, und dem Riechnerv, den wir entfernen müssen. Außerdem versuche ich, die Hirnhäute von diesem Präparat zu entfernen.Auch hier entfernen Sie den Riechlappen dieses Stückes, schälen Sie ihn vorsichtig von den Hirnhäuten ab. Manchmal haben Sie Teile, die sich nicht so leicht trennen lassen; in diesem Fall fahren Sie einfach fort und lassen diese schwierigen Stücke zurück, während Sie die gut zu trennenden Bereiche beiseitelegen. Ich arbeite mich stets in Richtung eines Endes vor und bearbeite dann Abschnitt für Abschnitt nacheinander.Es ist wichtig, dass Sie die Hirnhäute entfernen, und wenn Sie sich diese Schnitte ansehen, sollten Sie sie manchmal umdrehen, um besser erkennen zu können, wo sich der Fasertrakt befindet, der die meisten nicht-neuronalen Zellen enthält, die Sie bei dieser Präparation möglichst vermeiden möchten. Okay, bei diesem Schnitt können Sie deutlich diesen Fasertrakt unterhalb der kortikalen Schicht erkennen. Ich stiche also direkt zwischen dem Ende der kortikalen Schicht hindurch und weise auf den Fasertrakt hin, der die meisten nicht-neuronalen Zellen enthält, die wir bei dieser Präparation vermeiden wollen.Ich schneide also entlang dieser Linie und versuche, die Faserbahnen zurückzulassen. In diesem Schritt wird das Gewebe in kleine Würfel zerkleinert. Gut, ich sterilisiere jetzt meine Enzymlösung durch einen 0,2-Mikron-Filter, der an einer Spritze befestigt ist.Und ich gebe das direkt auf meine kortikalen Gewebestücke, genau so. Achten Sie darauf, dass ausreichend Flüssigkeit vorhanden ist, um alle kortikalen Stücke zu umgeben, und geben Sie diese anschließend für 30 Minuten in einen 37-Grad-Inkubator, wodurch das Gewebe erheblich gelockert werden sollte. Die kortikalen Stücke befinden sich also nun bereits 30 Minuten im Inkubator.Unterdessen habe ich etwas neurobasales Medium mit B-27-Zusatz erwärmt, in das diese Zellen letztendlich überführt werden. Ich habe hier außerdem einige Lösungen vorbereitet. Die erste ist die Dissektionslösung.Es handelt sich also um eine einfache Dissektionslösung. Anschließend werden sie in eine Lösung mit hohem Trypsininhibitor umgesetzt, die BSA als Scavenger und ein PV enthält, um die NMDA-Rezeptorkomponente zu blockieren. Danach durchlaufen sie drei Waschschritte mit niedrigem Trypsininhibitor, BSA und einem PV. Ich werde diese Stücke nun aus der Propanlösung entfernen und in ein kegelförmiges Reagenzglas überführen, das die DS-Dissektionslösung enthält.Diese Klumpen wandern einfach durch die Schwerkraft nach unten, und es kann eine oder zwei Minuten dauern, bis sie alle im kegelförmigen Teil des Röhrchens abgesunken sind. Dann hebe ich sie erneut auf und übertrage sie in die Lösung, die den hohen Trypsin-Inhibitor enthält. Auch hier warten wir erneut, bis diese Klumpen am Boden des Röhrchens abgesetzt haben.Es folgt noch eine weitere Waschung mit einer Lösung mit hohem Trypsininhibitorgehalt, anschließend werden diese Zellklumpen in einer Lösung mit niedrigem Trypsininhibitorgehalt gewaschen. Nach meiner letzten Waschung und der Inkubation mit dem niedrigen Enzyminhibitor werde ich die Zellen in mein vorgewärmtes Neurobasal-Medium überführen und beginne, die Zellen mechanisch zu dissoziieren, indem ich sie mehrmals durch eine Glas-Kapillare mit abnehmendem Durchmesser pipettieren. Ich werde nun die Zellen und die Gewebeklumpen trituriert.Doch bevor ich dies tue, werde ich zunächst alles sichtbare Material entfernen, das sich hier befindet. Es gibt beispielsweise Proteine und DNA, die aus den Zellen austritt und dieses fadenziehende, baumwollartige Material bildet, das an den Gewebeklumpen haftet. Dies sollten Sie zuerst entfernen, da es Ihre Pipettenspitze verstopft und Sie das Gewebe durch eine Öffnung mit geringerem Durchmesser zwingen müssen.Dann werde ich einige dieser Glas-Kapillaren brechen, um eine Öffnung der richtigen Größe zu erhalten, um meine Zellen ein- und auszubringen. Dies ist eine gute Pipette. Bei dieser hier sehen Sie, dass sie schön rund ist und keine scharfen Kanten aufweist.Ich werde dies in mein Mäuserohr-Einbringergerät stecken. Dazwischen befindet sich ein 0,2-Mikrometer-Filter, und nun werde ich das Gewebe mehrmals in und aus meinem Glas-Kapillarrohr bewegen. Der erste Vorgang sollte daher ziemlich reibungslos verlaufen, da die Gewebeklumpen nicht wesentlich größer sind als die Pipettöffnung.Alles, was Sie tun möchten, ist, das Gewebe aufzulockern. Dann gehe ich mit einer etwas kleineren Pipettenspitze hinein. Ich möchte eine schön saubere, runde Pipettenspitze haben.Das sieht gut aus. Und erneut werden alle Klumpen gleichzeitig in und aus dem Rohr bewegt. Das Gewebe ist nun also sehr weich und gelockert, sodass die Zellen im Grunde herausfallen, wenn Sie diese Klumpen erneut in Medium resuspendieren.Ich werde nun alle meine dissoziierten Zellen in ein frisches kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen überführen und sie möglicherweise noch zwei- oder dreimal vorsichtig gekühlt auf und ab pipettieren, um Zellen aufzulösen, die sich noch in größeren Zellhaufen befinden. Danach sollten wir ein bis zwei Minuten warten, damit die größeren Bestandteile, die noch vorhanden sind, sich absetzen können. Außerdem könnten Sie Glasstücke von den Glaskapillaren haben, die Sie abgebrochen haben und die sich ebenfalls auf den Boden absetzen sollten.Und dann können wir Aliquote davon verwenden, um sie auf vollständig mit Polylysin beschichtete Deckgläser oder Schalen aufzupipettieren. Ich pipettiere 80 Mikroliter auf dieses Glasdeckgläschen, das zuvor mit Polylysin beschichtet wurde, wodurch sich eine schöne Blase bildet. Die Zellen werden sich schließlich absetzen und am Glasdeckgläschen anhaften.Nach etwa einer Stunde haben sich die Zellen abgesetzt, und ich werde vorsichtig etwas zusätzliches Medium über die gesamte Platte hinzugeben. Man kann eine sanfte Drehbewegung wie folgt ausführen. Anschließend kommen diese Zellen in den Inkubator bei 37 Grad, und morgen werde ich sie mit konditioniertem Medium versorgen.In Ordnung, das sind die kortikalen Zellen. Sie sind etwas weniger als einen Tag alt. Sie wurden gestern ausgesät, und Sie können sehen, dass sich zahlreiche Neuronen befinden, alle weisen viele lange Neuriten auf, und es ist außerdem etwas Zelltrümmermaterial vorhanden.Das sind die Zellen, die es nicht geschafft haben. Diese werden bei den nächsten paar Fütterungen ausgespült. Die toten Zellen sind die sehr kleinen, runden Zellen mit den gewellten Membranen.Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man diese dissoziierten kortikalen Kulturen herstellt. Es ist wichtig, daran zu denken, dass Sie beim Entfernen der kortikalen Rinde von den Gehirnschnitten diese von den Thalamus-kortikalen Fasern abtrennen müssen, da diese viele nicht-neuronale Zellen enthalten. Außerdem sollten Sie beim Zerkleinern der Zellen nicht übertreiben, da dies im Grunde die Mehrheit der bisher isolierten Zellen abtötet.Seien Sie also schonend mit den Gewebeschnitten, dann erhalten Sie eine schöne Kultur. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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