Verschiebung der Zebrafisch letale Skelett mutierte Penetranz um Nachkommen testen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Penetranz der letale Skelett mutierte Phänotypen im Zebrafisch durch selektive Zucht zu ändern. Letale Mutanten können nicht bis ins Erwachsenenalter angebaut werden und selbst gezüchtet, daher dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Verfolgung und Penetranz über mehrere Generationen von Nachkommen Tests auswählen.

Das übergeordnete Ziel dieser Zuchtstrategie ist es, die Penetranz der Mutanten nach oben oder unten zu manipulieren. Diese selektive Züchtungsmethode ermöglicht ein vollständigeres Verständnis der mutierten Phänotypen. Durch die Erzeugung von mutierten Stämmen mit hoher und niedriger Penetranz kann die gesamte phänotypische Serie einer Mutation verstanden werden.

Die meisten Zebrafischschuppen stellen fest, dass Mutanten rezessiv letal sind, so dass homozygote Mutanten sterben, bevor sie direkt gezüchtet werden können. Daher wenden wir die klassische selektive Züchtungsstrategie der Nachkommenprüfung an, die wir hier demonstrieren. Wir hatten das Item für diese Methode zum ersten Mal, als wir versuchten, die Entwicklung ektopischer Knochenzellen im Zeitraffer aufzuzeichnen.

Frustrierenderweise traten darin häufig zusätzliche Knochenzellen auf, so dass wir uns daran machten, mutierte Penetranten durch selektive Züchtung zu verändern. Obwohl wir diese Methode auf einer Zebrafischskala mit einer Mutantenlinie durchführen, kann sie auch auf andere Zebrafisch-Mutanten-Phänotypen und wahrscheinlich auch auf andere Organismen angewendet werden. Nach der Aufbereitung des nicht selektierten Startzebrafischbestands gemäß dem Textprotokoll ist die KASP-Genotypisierung wie folgt durchzuführen.

Legen Sie das Zebrafischschwanzgewebe in 50 Mikroliter Lysepuffer in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Geben Sie 10 Mikroliter 10 Milligramm Proteinase k pro Milliliter pro Vertiefung hinzu und verdauen Sie die Gewebeproben in einem Thermocycler bei 55 Grad Celsius für zwei bis fünf Stunden. Gefolgt von einem 20-minütigen Inaktivierungsschritt bei 94 Grad Celsius.

Kühlen Sie das Lyseprodukt nach der Verdauung. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die genomische DNA zu quantifizieren. Verdünnen Sie dann mit molekularbiologischem Wasser die genomische Vorlage, so dass jede Reaktion etwa 20 bis 30 Nanogramm enthält.

0,14 Mikroliter des KASP-Primer-Mixes und fünf Mikroliter des KASP-Mastermixes pro Probe auf Eis in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben und gut mischen. Zentrifugieren Sie dann kurz, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln. Pipettieren Sie fünf Mikroliter Primer-Mastermix-Lösung in die Vertiefungen einer optischen PCR-Platte mit 96 Vertiefungen, die für das verwendete Echtzeit-PCR-Gerät geeignet ist.

Pipettieren Sie dann fünf Mikroliter verdünnter DNA-Matrizenproben in jede Vertiefung und aspirieren Sie sie mit einer Pipette zum Mischen. Legen Sie eine optisch klare Folienversiegelung über die Platte und stellen Sie sicher, dass die Folie auf jeder Vertiefung vollständig versiegelt ist. Die Platte bei 600 x G kurz zentrifugieren, um den Inhalt am Boden aufzufangen und Blasen aus der Mischung zu entfernen.

Nachdem Sie die KASP-Hauptreaktion durchgeführt haben, sehen Sie sich das resultierende Streudiagramm an, das vom Analysecomputer erstellt wurde. Halten Sie die identifizierten heterozygoten Tiere zusammen am Hauptwassersystem. Nachdem sich das Tier von der Flossenklammer erholt hat, richten Sie paarweise Kreuzungen ein und verwenden Sie Trennwände, um sicherzustellen, dass die Embryonen synchronisiert sind.

Entnehmen Sie die Embryonen und halten Sie die Elternpaare isoliert in Zuchtkäfigen. Überwachen Sie vereinzelte adulte Fische, damit aggressive Fische ausgeschieden oder in Deckung gebracht werden können. Um die Embryonen am fünften oder sechsten Tag aufzuziehen, wenn die Schwimmblase in einem Gelege aufgeblasen wird, verwenden Sie eine Glaspipette, um phänotypische Wildtyp-Tiere zu sammeln.

Platzieren Sie phänotypische Wildtypen in der Kinderstube und notieren Sie, welche Eltern sie abgegeben haben. Nach der Betäubung von Larven, die ihre Schwimmblase nicht gemäß dem Textprotokoll aufblasen, verwenden Sie eine Glaspasteurpipette mit breitem Durchgang, um die Tiere in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu sammeln. Entfernen Sie das Embryowasser aus jedem Röhrchen und ersetzen Sie es durch einen Milliliter 2%Paraformaldehyd in 1x PBS.

Schaukeln Sie die Röhren eine Stunde lang, um die Tiere zu fixieren. Verfolgen Sie die Röhren während dieser und aller folgenden Schaukelschritte regelmäßig, um sicherzustellen, dass keine Larven an der Seite hängen geblieben sind oder am Boden der Röhre verklumpt sind. Verwenden Sie eine Glaspipette, um das Fixiermittel aus den Röhrchen zu entfernen.

Fügen Sie dann einen Milliliter 50%Ethanol hinzu. Schütteln Sie die Proben weitere 10 Minuten lang. Bereiten Sie eine frische Färbelösung vor, indem Sie 20 Mikroliter 0,5 % Alizarinrot pro Milliliter Alcian-Vormischung hinzufügen.

Entfernen Sie das 50%ige Ethanol und geben Sie einen Milliliter Färbelösung in jedes Röhrchen. Rocken Sie dann die Röhren über Nacht. Innerhalb weniger Tage nach dem Bleichen der Embryonen gemäß dem Textprotokoll werden die gefärbten mutierten Nachkommen auf Eindringmittel untersucht.

In diesem Beispiel bewerten wir jedes Vorkommen eines Themen-Bones. Wählen Sie für die nächste Generation zwei Familien mit hohen und zwei niedrigen Eindringmitteln. Geben Sie jedem Elternpaar eine Unterbestandskennung, z. B. Familie 4.01, 02 usw.

Es ist auch hilfreich, die Generationsnummer oder Inzucht auf allen Etiketten anzugeben. Elternpaare auf dem Hauptsystem mit mehreren gemischtgeschlechtlichen Begleitfischen. Als Begleitfisch kann jede Zebrafischlinie mit dauerhaften offensichtlichen Unterscheidungsmerkmalen, wie z.B. veränderter Pigmentierung oder Flossenstruktur, gelten.

Beschriften Sie die Becken, in denen sich die Wildtyp-Geschwisterlarven aus ausgewählten Familien befinden, mit den Eindringmitteln der mutierten Geschwister und ziehen Sie die Fische wie gewohnt bis zum Erwachsenenalter auf. Selektive Züchtung durch Nachkommentests sollte in einigen Generationen zu einer Verschiebung der Gesamtpenetranten sowohl nach unten als auch nach oben führen. In diesen Beispielen, die auf die mef2ca b1086-Mutante angewendet werden, wurde eine hohe oder niedrige Penetranz eines Topenknochens zwischen dem operkalen und dem Branchiostegalstrahl in letalen homozygoten Mutanten selektiert.

In einem erfolgreichen Casting-Verfahren sollten Typgruppierungen von Proben, die dem Gentyp entsprechen, vom Computerprogramm erkannt werden und die NTCs sollten sich in der Nähe des Ursprungs der Parzelle befinden, nachdem genügend Zyklen durchgeführt wurden. Wie hier gezeigt, weist die erfolgreiche Färbung Alcianblau, Alizarinrot lebendig gefärbte Knochen- und Knorpelelemente auf, die nicht transparent oder blass sind. Die Grenzen der Knorpelelemente sollten scharf erscheinen und einzelne Kontrazyten sind erkennbar

Alcianblau, das zu konzentriert ist, war von anderen Geweben nicht zu unterscheiden, was eine Analyse unmöglich machte. Die Implementierung dieser Technik bei der Pflege von Zebrafischlinien wird wahrscheinlich die Penetranten in einigen Generationen verändern. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie NC2-Hybridisierung und Zeitraffer-Bildgebungsstudien konsistentere Ergebnisse liefern.

Wir verwenden diese Technik, um die Heritabilität der Phänotypvariation zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre mutierten Stämme selektiv züchten können, um die Penetranz zu verändern, selbst wenn die Mutation tödlich ist.