Name: Bewertung von Verletzungen-Induzierte Seneszenz und In Vivo eine Anpassung in der Skelettmuskulatur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung von Verletzungs-induzierter Seneszenz und In-vivo-Reprogrammierung in der Skelettmuskulatur. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Detektion und Quantifizierung seneszenter Zellen für die Regenerationsmedizin.

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Wir sind verpflichtet, Clemire Cimper für ihre ausgezeichneten technischen Support. Arbeit im Labor von H.L wurde finanziert vom Institut Pasteur, Centre National Pour la Recherche Scientific, und die Agence Nationale De La Recherche (Laboratoire d ' Excellence Revive, Investissement Avenir; ANR-10-LABX-73), die Agence Nationale De La Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) und Fondation ARC (PJA 20161205028). C.c. und A.C. finanziert die Promotion und Postdoc-Stipendien aus dem Konsortium wieder zu beleben.

Tiere wurden gemäß den Leitlinien der Europäischen Gemeinschaft und der Ethik-Kommission des Institut Pasteur (CETEA) genehmigt Protokolle behandelt.
 1. Vorbereitungen für die Lager-Lösungen <ol><li>bereiten die Materialien für Muskel Probe Fixierung. Lösen Sie 0,5 g Tragant Kaugummi mit 20 mL Wasser bei RT das Einfrieren Einbettung Medium für Muskel-Fixierung machen.</li>
	<li>SA-β-Gal-Färbung der Lösungen vorbereiten.
	<ol><li>Bereiten die Stammlösungen von K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), MgCl 2 (1 M) durch die jeweiligen Pulver in destilliertem Wasser auflösen.</li>
		<li>Bereiten Vorratslösung 0,2 % C 20 H 6 Br 4 Na 2 O 5 (Eosin) von in Wasser verdünnen.</li>
		<li>Vorbereitung der Stammlösung C 14 H 15 BrClNO 6 (X-gal) (50 mg/mL) durch Auflösen der X-gal-Pulver in C 3 H 7 keine (Dimethylformamid, DMF).</li>
		<li>Store K 3 Fe(CN) 6 und K 4 Fe(CN) 6 Lösungen bei 4 ° C und MgCl 2 bei RT 
		Hinweis: X-gal kann in aliquoten bei-20 ° C bis zu 6 Monate gespeichert werden. Eosin-Lösung kann bei RT aufbewahrt und nach dem Filtern bei Bedarf wiederverwendet werden. K 3 Fe(CN) 6 und K 4 Fe(CN) 6 Lösungen sind Protectedfromthe Licht. X-gal-Lösung ist nicht stabil im Wasser und muss vor Licht geschützt werden.</li>
	</ol></li> <li>Vorbereitung der Lösungen für Nanog Färbung: die Permeabilisierung Lösung enthält 0,1 % Na 3 C 6 H 5 O 7 (Trinatrium Citrat), 0,1 % C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton x-100) in destilliertem Wasser, sollten die gespeichert werden, bei 4 ° c bereiten Sie die blockierende Lösung mit 5 % fetalen bovine Serum (FBS) in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die bei RT gespeichert werden sollen</li>
</ol> 2. SA-β-Gal-Färbung auf gefrorene TA Muscle Section <ol><li>bereiten das Befestigungsmaterial für den TA-Muskel indem man eine kleine Menge der Tragant Kaugummi auf ein Stück Kork.</li>
	<li>Verletzte Mäusen beiderlei Geschlechts (2 Monate alt, C57/B6) wurden 10 Tage vor mit Cardiotoxin (CDX) verletzt, wie zuvor beschrieben 13. Verwenden Sie nicht verletzt (PBS-Injektion) TA von der gleichen Maus, als die negativ-Kontrolle. Nach Wunsch in Vivo Umprogrammierung behandeln jede Maus mit Dox (1 mg/mL) im Trinkwasser am selben Tag (lichtgeschützt), direkt nach einer Verletzung CTX. 
	Hinweis: Die Dox-Lösung alle 3 Tage für eine vollständige Behandlung dauert 7 Tage geändert werden soll.
	<ol><li>Beide TA Muskeln (verletzt und Steuern) von Mäusen wie zuvor beschrieben ( Abbildung 1A) 13 isolieren. Zu gewährleisten die Querschnitte, legen die distale Sehne des Muskels TA in der Gum Tragant und verlassen etwa ¾ Teil des Muskels vor ( Abbildung 1 b) und Einfrieren in flüssigem Stickstoff gekühlt Isopentane für &#60; 1 min. 
		Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der TA-Muskel in eine senkrechte Position und in der Mitte des Korkens. Proben können bei-80 ° C oder direkt Cryosectioned in 10 µm Abschnitten gelagert werden.</li>
	</ol></li> <li>TA Muskeln zu verarbeiten, wie in der Abbildung 1 b.
	<ol><li>Verteilen die 1 St-10 th Abschnitte in der richtigen Reihenfolge auf zehn verschiedene Folien an der oberen linken Position der einzelnen Folien. Platzieren Sie Abschnitt 11 th neben Abschnitt 1 St auf der ersten Folie; Abschnitt 12 th folgen die gleiche Reihenfolge rechts neben den 2 Nd-Abschnitt auf der zweiten Folie platziert werden. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis 10 Sektionen/Folie ergeben sich für zehn Folien (100 Abschnitten insgesamt) um mindestens 1 mm Abstand zwischen dem ersten und den letzten Abschnitt zu gewährleisten.</li>
	</ol></li> <li>In den Abschnitten 4 min in PBS mit 1 % Paraformaldehyd und 0,2 % Glutaraldehyd zu beheben. Waschen Sie mit PBS, 2 x 10 min. Als nächstes inkubieren Sie die Abschnitte mit PBS-Puffer (pH = 5,5) für 30 min. alle Schritte bei RT 
	Hinweis: Die Fixierung ist mild, enzymatische Aktivität beizubehalten. Führen Sie diesen Schritt unter der Haube. Der pH-Wert des öffentlich-rechtlichen Rundfunks ist entscheidend und die X-gal-Lösung muss vor Licht geschützt werden.</li>
	<li>Inkubieren Abschnitte in der X-gal-Lösung enthält: 4 mM K3Fe(CN) 6, 4 mM K4Fe(CN) 6, 2 mM MgCl2 und 400 µg/mL X-Gal mit PBS-Puffer, pH = 5,5. Im Dunkeln bei 37 ° C für mindestens 24 Std. Waschen die Folien mit PBS, 3 x 10 min bei RT inkubieren 
	Hinweis: Die Inkubation erfordert ein Minimum von 24 Stunden und dauert 48 Stunden um das SA-β-Gal-Signal zu maximieren. Die Lösung muss nach 24 Stunden Inkubation geändert werden. Die Folien sollten vor Licht geschützt werden. Wenn nur SA-β-Gal-Färbung gewünscht wird, fahren Sie mit Schritt 2.5. Wenn Co Färbung mit Nanog gewünscht wird, bitte vorwärts überspringen Sie Schritt 3.1.</li>
	<li>Fix Folien in 1 % Paraformaldehyd in PBS für 30 min. Waschen gleitet mit PBS, 3 x 10 min. Gegenfärbung mit 0,2 % Eosin. Tauchen Sie die Folien in der Eosin-Lösung für 1 min und kurz mit destilliertem Wasser abspülen. Zu guter Letzt montieren die Folien mit wässrigen nicht fluoreszieren Eindeckmedium (siehe Tabelle der Werkstoffe). 
	Hinweis: Es ist wichtig, die Post-Fixierung durchführen. Führen Sie diesen Schritt unter der Haube. Alle Schritte werden ausgeführt, bei RT</li>
</ol> 3. Immunohistochemistry mittels Anti-Nanog Antikörper <ol><li>befestigen Sie die Folien mit PBS mit 4 % Paraformaldehyd für 10 min. Waschen mit PBS, 2 x 10 min. Fügen Sie 200 µL der Permeabilisierung Lösung direkt auf die Folien und 5 min inkubieren. <ol><li>Wash Folien mit PBS, 2 x 5 min. und in der letzten Wäsche, Nutzung 200 µL PBS mit 0,25 % BSA direkt auf den Folien. Führen Sie diese Schritte bei RT 
		Achtung: Führen Sie die Fixierung Schritt unter der Haube.</li>
	</ol></li> <li>Inkubieren Folien mit dem primären Anti-Nanog Antikörper (Endkonzentration: 1,25 Ug/mL) über Nacht bei 4 ° C in PBS mit 5 % FBS. Objektträger mit PBS, 2 x 10 min waschen und in der letzten Wäsche Gebrauch 200 µL PBS mit 0,25 % BSA für 5 min. Perform Schritte das Waschen bei RT 
	Hinweis: Inkubieren Sie Folien in einer Box mit feuchten Papiertuch um Verdunstung zu verhindern.</li>
	<li>Inkubieren Folien mit 100 µL der rAb-HRP Sekundärantikörper aus eine gebrauchsfertige kit (siehe Tabelle der Materialien), für 45 min. Waschen mit PBS, 3 x 5 min, zu Folien Sekundärantikörper zu entfernen. Alle Schritte bei RT mit Schutz vor Licht.</li>
	<li>Visualisierung <ol><li>zuerst, verdünnen die 3,3 &#39;-Diaminobenzidine (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 N 4 (4 HCl), DAB) im Substratpuffer durch die gebrauchsfertige Kit (20 µL DAB für 1 mL Substrat Pufferlösung) bereitgestellt. 100 µL der DAB-Lösung direkt in jede Folie hinzufügen und maximal 10 min bei RT inkubieren 
		Hinweis: Die verdünnte Lösung DAB sollte frisch zubereitet werden und kann bis zu einer Woche bei 4 ° c gelagert werden Die Inkubationszeit kann angepasst werden, um das Hintergrundsignal zu minimieren aber das gleiche für alle Folien gehalten werden müssen.</li>
		<li>Die DAB-Lösung durch das Ausspülen mit Wasser entfernen. Counterstain den Folien mit schnell rote Lösung (bereit zu verwenden, siehe die Tabelle der Materialien) für 20 min. Waschen die Folien mit Wasser noch einmal kurz.</li>
		<li>Entwässern sie mit 95 % igem Ethanol für 5 min 100 % Ethanol, 2 x 5 min. gefolgt. Zu guter Letzt montieren Sie die Folien mit schnell aushärtende Eindeckmedium (siehe Tabelle der Werkstoffe).</li>
		<li>Beobachten die Folien unter dem Mikroskop im Hellfeld bei 20 X Hintergrund zu vermeiden. 
		Hinweis: Schnell rote Lösung kann bei RT gehalten und nach dem Filtern wiederverwendet.</li>
	</ol></li></ol> 4. Analyse und Quantifizierung <ol><li>SA-β-Gal Quantifizierung <ol><li>Dias scannen und wählen die besten Abschnitte auf jeder Folie anhand der aufgenommenen Bilder. Verwenden Sie mindestens 2 Abschnitte/TA für die Quantifizierung. Beurteilen im Abschnitt &#39; s-Qualität basiert auf Gewebe Integrität, Qualität der Färbung und der Gegenfärbung. Wählen Sie für die Quantifizierung der höchsten Qualität zweiteilig mit die maximale Distanz zwischen Proben, ermöglicht bessere Darstellung des SA-β-Gal Quantifizierung in der ganzen TA Muskel.</li>
		<li>Quantifizierung der SA-β-Gal-positiven Zellen ( Abbildung 2).
		<ol><li>Bestimmen den Rang eines die Pixelgröße von manuell auswählen, die kleinste und die größte positive SA-β-Gal-Zellen.
			<ol><li>Öffnen Sie das digitale Bild des gescannten Dias mit ImageJ-Software.</li>
				<li>In der Benutzeroberfläche, klicken Sie &#39; Analyze &#39; &#62; &#39; Tools &#39; &#62; &#39; ROI Manager &#39; &#62; &#39; Analyze &#39; &#62; &#39; Messung eingestellt &#39; &#62; &#39; wählen Sie Bereich &#39;. Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug und surround-die kleinste und größte positive SA-β-Gal Zell und fügen sie Sie des ROI-Managers durch Klicken auf &#39; Add &#39;. Messen der Größen, die mit der &#39; Maßnahme &#39; button und speichern Sie die Werte für den späteren Gebrauch.</li>
			</ol></li> <li>Einstellen des Parameters "Schwelle" gewährleisten die sichtbaren positiven Zellen ausgewählt sind.
			<ol><li>Convert Graustufen durch Klicken auf das Bild &#39; Bild &#39; &#62; &#39; Typ &#39; &#62; &#39; 8-Bit &#39; ( Abbildung 2A). Als nächstes gehen Sie zu &#39; Bild &#39; &#62; &#39; einstellen &#39; &#62; &#39; Schwelle &#39;, den zweiten Cursor bis rot ( Abb. 2 b) die positive SA-β-Gal-Zellen bedeckt sind, und klicken Sie dann &#39; anwenden &#39;.</li>
				<li>Analysieren Partikel durch Klicken auf &#39; Analyze &#39; &#62; &#39; analysieren Partikel &#39; &#62; &#39; Größe (Pixel ^ 2) &#39;, und den Wert im Schritt 4.1.2.1 definiert anzuwenden, geben Sie &#39; Zirkularität &#39;: &#39; 0,00-1,00 &#39;, klicken Sie &#39; ok &#39;; eine Zusammenfassung aller die gezählten Partikel zeigt sich in der ROI-Manager ( Abb. 2D).</li>
			</ol></li> <li>Die ausgewählten Partikel auf das ursprüngliche Bild übertragen. Passen Sie die Einstellungen manuell, um genaue Quantifizierung zu gewährleisten. Fügen Sie positive Zellen (grüner Pfeil, Abb. 2E hinzu) bzw. Entfernen Sie falsche positive Zellen (roter Pfeil, Abb. 2E). Messen Sie schließlich den Bereich umreißen den Abschnitt ( Abb. 2D) mit der &#39; Auswahl-Werkzeug &#39;. Klicken Sie &#39; ROI-Manager &#39; &#62; &#39; Add &#39; &#62; &#39; Maßnahme &#39;.</li>
			<li>Wichtiger ist, die Anzahl der positiven Zellen durch die Fläche des Abschnitts zu normalisieren.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Nanog Quantifizierung <ol><li>zählen die Nanog positive Zellen unter dem Mikroskop im hellen Bereich manuell mit 20 X Vergrößerung. 
		Hinweis: Schnell rot Gegenfärbung ermöglicht gute Beurteilung der Morphologie des TA-Muskels. Aber die Färbung ist sehr leicht und fehlt eine klare Gliederung des Abschnitts. Der Scanner oft nicht die Grenze der Abschnitte identifizieren und kann nicht richtig konzentrieren. Es ist möglich, verwenden Sie Marker, um Kreis die Kanten der Teile vor dem Scannen oder einen empfindlicheren Scanner verwenden, um den Abschnitt zu erkennen. Für das aktuelle Protokoll ist es am effizientesten, die Nanog positive Zellen manuell zählen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Hier stellen wir eine Methode, um beide seneszenten erkennen und pluripotenten Stammzellen in der Skelettmuskulatur programmierbar Mäuse. Diese Methode kann verwendet werden, bewerten beide Seneszenz zu quantifizieren und induzieren zelluläre Plastizität in Vivound untersuchen die Rolle der Seneszenz in Gewebe-Reparatur und Regeneration.
In dem aktuellen Protokoll dient der Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase (SA-β-Gal) Assay in Vivo seneszenten Zellen in der Skelettmuskul...

Zelluläre Seneszenz ist eine Form von Stress-Reaktion zeichnet sich durch eine stabile Zellzyklus Festnahme. In den letzten zehn Jahren hat Forschung etabliert, dass Seneszenz mit verschiedenen biologischen und pathologische Prozesse einschließlich der Embryonalentwicklung, Fibrose und Organismus Altern1,2verbunden ist. Zelluläre Seneszenz wurde zuerst in menschlichen Fibroblasten am Ende ihrer replikativen Lebensdauer ausgelöst durch Telomerverkürzung3gekennzeichnet. Neben replikativen Stress gibt es viele andere Reize, die Seneszenz, einschließlich DNA-Schäden, oxidativer Stress, onkogenen Signale und genomische/epigenomischen Veränderungen, die schließlich die p53/p21 und/oder pRB Wege zum aktivieren kann auslösen können Aufbau und die Konsolidierung der permanenten Wachstums Verhaftung1. Eines der wichtigen Merkmale der alternde Zellen ist, dass sie metabolisch aktiv bleiben und kräftig einen Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP ausdrücken): Sekretion von inflammatorischen Zytokinen, Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Matrix Faktoren-4. SASP Faktoren sind vorgeschlagen worden, um eine wichtige Rolle bei der Vermittlung und Verstärkung des Seneszenz Effekts aufgrund ihrer potenten Wirkung auf Immunzellen zieht und lokale und systemische Gewebe Milieus1zu verändern. Interessanterweise hat Seneszenz vor kurzem vorgeschlagen worden, für Gewebe Reparatur und Regeneration5,6wichtig sein. Darüber hinaus hat die Daten aus mehreren Labors, einschließlich der unsrigen, vorgeschlagen, dass Gewebe Schaden-Induzierte Seneszenz zellulärer Plastizität, über SASPs, Förderung der Regeneration7–9verbessern könnte. Daher, die entstehenden Daten unterstreichen die Bedeutung des Studiums Seneszenz in Vivo.
In der Post-induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) Ära ist zelluläre Plastizität die Fähigkeit einer Zelle, eine neue Identität zu erwerben und eine alternative Schicksal wenn verschiedene Reize in Kultur und in Vivo10ausgesetzt zu verabschieden. Es ist bekannt, dass vollständige Neuprogrammierung kann erreicht in Vivo11,12, wo der Ausdruck der der Kassette mit vier Yamanaka Faktoren: Oct4, Sox2, Klf4und c-Myc (OSKM) kann induzierte in Vivo , darum Bildung in mehreren Organen zu fördern werden. Daher ein programmierbar Mausmodell (i4F) als ein leistungsfähiges System lässt sich identifizieren wichtige Regulatoren und Signalwege, die für die zelluläre Plastizität11wichtig sind.
Eine geeignete und sensibel in Vivo -System ist wichtig zu verstehen, wie zelluläre Seneszenz reguliert zelluläre Plastizität im Zusammenhang mit der Geweberegeneration. Hier präsentieren wir Ihnen ein robustes System und ein detailliertes Protokoll, das Bindeglied zwischen Seneszenz und zelluläre Plastizität im Zusammenhang mit der Geweberegeneration zu bewerten. Die Kombination von Cardiotoxin (CTX) induzierte Schädigung der Muskulatur in den m. Tibialis Anterior (TA) Muskel-Gruppe, ein etabliertes System, Geweberegeneration und i4F Mausmodell zu studieren ermöglicht die Erkennung von zellulären Seneszenz und in vivo Umprogrammierung während der Muskelregeneration.
Um die Verbindung zwischen zelluläre Plastizität und Seneszenz zu bewerten, i4F Mäuse mit CTX induzieren akute Muskelschäden verletzt und behandelt mit Doxycyclin (0,2 mg/mL) innerhalb von 7 Tagen, in Vivo Umprogrammierung zu induzieren. Während eine CTX akuten Muskelschäden induzierten und Regeneration Protokoll kürzlich veröffentlichten13, aus ethischen Gründen wurde, wird dieses Verfahren in das aktuelle Protokoll weggelassen werden. TA-Muskel-Proben werden bei 10 Tagen Post Verletzungen13, erhoben, wenn der Höhepunkt der alternde Zellen wurden bisher14beobachtet. Dieses ausführliche Protokoll beschreibt hier, alle erforderlichen Schritte, um die Ebene der Seneszenz (über SA-β-Gal) und Neuprogrammierung (über IHC beflecken von Nanog) zu bewerten.
Seneszenz-assoziierten Beta-Galaktosidase (SA-β-Gal) Assay ist die am häufigsten verwendeten Assay, beide seneszenten Zellen in Kultur und in Vivo15zu erkennen. Im Vergleich zu anderen Tests, ermöglicht der SA-β-Gal-Test die Identifikation der alternde Zellen in ihrer natürlichen Umgebung mit intaktem Gewebearchitektur, die besonders wichtig für in-Vivo -Studie ist. Darüber hinaus ist es möglich, die SA-β-Gal-Assay mit anderen Markern mit IHC zu koppeln. Allerdings erfordert der SA-β-Gal-Assay frische oder gefrorene Proben, bleibt eine große Einschränkung. Wenn frisches oder gefrorenes Gewebe wie gefrorene TA Muskel Proben routinemäßig verfügbar sind, ist SA-β-Gal offensichtlich die am besten geeigneten Assay seneszenten Zellen zu erkennen. NANOG ist der Marker verwendet, um neuprogrammiert Zellen aus zwei Gründen: 1) Es ist eine wesentliche Marker für Pluripotenz; (2) Darüber hinaus seinen Ausdruck wird nicht durch Doxycyclin (Dox) angetrieben, deshalb erkennt es induzierten Pluripotenz anstatt der erzwungenen Ausdruck der Yamanaka-Kassette.
Es ist wichtig zu beachten, die Färbung Protokolle präsentiert in dieser Studie können separat durchgeführt werden, um die Quantifizierung Verfahren zu vereinfachen, sondern können auch in eine Co Färbeverfahren, beide seneszenten zu visualisieren und pluripotente Stammzellen im selben Abschnitt durchgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>13746-66-2</td><td>Für SA-&beta; Gal-Färbelösung</td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td>Für SA-&beta; Gal-Färbelösung</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>7786-30-3</td><td>für SA-&beta; Gal-Färbelösung</td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma</td><td>B4252</td><td>Für SA-&beta; Gal-Färbelösung</td></tr><tr><td>Doxycyclin</td><td>Sigma</td><td>D3447</td><td>Zur Induktion der In-vivo-Reprogrammierung</td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Lotaxan Valence, Frankreich</td><td>L8102</td><td>Zur Muskelverletzung</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Sigma</td><td>111-30-8</td><td>Zur Fixierungslösung</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>50-980-487</td><td>Zur Fixierlösung</td></tr><tr><td>NaCitrate : Natriumcitrat monobasisches Bioxtra, Anhydr</td><td>Sigma</td><td>18996-35-5</td><td>Zur Permeabilisierungslösung</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td>Zur Permeabilisierungslösung</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A3608</td><td>Waschlösung</td></tr><tr><td>Antikörper anti-Nanog</td><td>Zellsignalisierung</td><td>8822S</td><td>Kaninchen monoklonaler Antikörper</td></tr><tr><td>EnVision+ Kits (HRP. Kaninchen. DAB+)</td><td>Dako</td><td>K4010</td><td>Für Nanog-Offenbarung</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Leica</td><td>380159EOF</td><td>Gegenfärbung</td></tr><tr><td>Fast red</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-3403</td><td>Gegenfärbung</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Immu-Mount</td><td>Fisher scientific</td><td>9990402</td><td>Eindecklösung</td></tr><tr><td>Schnellhärtendes Einbettmedium für die Mikroskopie : Eukitt&reg;</td><td>Sigma</td><td>25608-33-7</td><td>Eindecklösung</td></tr><tr><td>Mikroskop Phasenkontrast Hellfeld CKX41: 10X-20X-40X Objektive</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Mikroskop für Nanog-Quantifizierung</td></tr><tr><td>Maus: i4F-A</td><td>Abad et al., 2013</td><td>N/A</td><td>Reprogrammierbares Mausmodell</td></tr><tr><td>Skelettmuskel, Tibialis Anterior</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide Scanner</td><td>Zeiss</td><td>Axio Scan Z1</td><td>Scannen von Dias</td></tr></tbody></table>

bewertung von verletzungen-induzierte seneszenz und in vivo eine anpassung in der skelettmuskulatur

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Zelluläre Seneszenz ist eine Stress-Reaktion zeichnet sich durch ein stabiles Zellwachstum Verhaftung, die für viele physiologische und pathologische Prozesse, wie Krebs und Altern wichtig ist. Vor kurzem hat Seneszenz auch in Gewebe-Reparatur und Regeneration verwickelt. Daher ist es immer entscheidend, alternde Zellen in Vivozu identifizieren geworden. Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase (SA-β-Gal) Assay ist die am häufigsten verwendeten Assay, alternde Zellen in Kultur und in Vivozu erkennen. Dieser Assay basiert auf den erhöhten lysosomale Inhalt in den seneszenten Zellen, wodurch die histochemische Erkennung von lysosomalen β-Galaktosidase Aktivität bei bedenklich pH (6 oder 5,5). Im Vergleich zu anderen Tests, z. B. Durchflusszytometrie, dies erlaubt die Identifikation der alternde Zellen in ihrem Wohnsitz Umfeld, bietet wertvolle Informationen wie die Lage in Bezug auf die Gewebearchitektur, der Morphologie und der Möglichkeit der Kopplung mit anderen Markern über immunhistochemische (IHC). Die größte Beschränkung des SA-β-Gal-Assays ist die Anforderung von frischen oder gefrorenen Proben.
Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll um zu verstehen, wie zelluläre Seneszenz fördert zelluläre Plastizität und Tissue Regeneration in Vivo. Wir verwenden SA-β-Gal um zu erkennen seneszenten Zellen in der Skelettmuskulatur bei Verletzungen, die ein etabliertes System, Geweberegeneration zu studieren ist. Darüber hinaus verwenden wir IHC Nanog, eine Markierung von pluripotenten Stammzellen in einem transgenen Mausmodell zu erkennen. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, prüfen und zelluläre Seneszenz im Rahmen des induzierten zelluläre Plastizität und in Vivo Umprogrammierung zu quantifizieren.

Erkennung von Muskel-Verletzungen-induzierte zellulären Seneszenz
Es wurde kürzlich nachgewiesen, dass Muskelverletzung transiente zellulären Seneszenz14induziert. 10 Tage nach der Verletzung (DPI) der Großteil der beschädigten Myofibers sind in der Regeneration mit zentral gelegenen Kerne, ein Markenzeichen Myofibers, zu regenerieren und die Architektur des Muskels ist wieder hergestellt. Die eindringende E...

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll, beide seneszenten erkennen und pluripotenten Stammzellen in der Skelettmuskulatur bei Verletzungen während der Induktion in Vivo Umprogrammierung. Diese Methode eignet sich für die Bewertung der Rolle der zellulären Seneszenz während der Geweberegeneration und Umprogrammierung in Vivo.

Bewertung von Verletzungen-Induzierte Seneszenz und In Vivo eine Anpassung in der Skelettmuskulatur

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, sowohl die zelluläre Seneszenz als auch die Umprogrammierung im Skelettmuskel nach Gewebeschädigung in vivo zu bewerten. Diese Methode kann helfen, entscheidende Fragen im Bereich der regenerativen Medizin zu beantworten, beispielsweise wie die zelluläre Plastizität verbessert werden kann, um die Muskelregeneration zu fördern. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, eine zuverlässige Methode bereitzustellen, um Seneszenz-zellen im lokalen Gewebeumfeld nachzuweisen und zu quantifizieren.Die Zellalterung (Seneszenz) wurde kürzlich in Zusammenhang mit der Gewebereparatur und Regeneration gebracht. Das Verständnis der Mechanismen, durch die die Seneszenz zur Gewebereparatur und Regeneration beiträgt, wird zweifellos Auswirkungen auf die regenerative Medizin haben. Wir hatten die Idee zu dieser Methode erstmals, als wir den möglichen Einfluss von Gewebeschäden auf die In-vivo-Umprogrammierung im Skelettmuskel untersuchten.Um dieses Verfahren zu beginnen, fixieren Sie die Objektträger mit Muskelproben vier Minuten lang in 1 % Paraformaldehyd und 0,2 % Glutaraldehyd in PBS. Anschließend waschen Sie die Objektträger zweimal mit P

evaluation-injury-induced-senescence-vivo-reprogramming-skeletal

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die Mikro-seziert Explantate Technik ist eine robuste und zuverlässige Methode zur Isolierung proliferative Skelettmuskelzellen von Jugendkriminalität, adulte oder embryonale Muskeln als eine Quelle der Skelettmuskulatur Stammzellen. Einzigartig sind diese Zellen klonal abgeleitet, um Skelettmuskulatur Stammzelllinien für in vivo-Transplantation verwendet produzieren.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Induzierte pluripotente Stammzell (iPSC)-abgeleitete myogene Vorläufer sind vielversprechende Kandidaten für Zelltherapiestrategien zur Behandlung von Muskeldystrophien. Dieses Protokoll beschreibt Transplantations- und Funktionsmessungen, die erforderlich sind, um die Engraftmentierung und Differenzierung von iPSC-abgeleiteten Mesoangioblasten (eine Art von Muskelvorläufern) in Mausmodellen der akuten und chronischen Muskelregeneration zu bewerten.

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Skelettmuskulatur ist wichtig für die Fortbewegung und ist der betreffenden Einrichtungen Hauptproteinspeicher. Muscle Gesundheitsmessungen innerhalb C. elegans beschrieben. Potenzielle Änderungen an Muskel Struktur und Funktion werden mit lokalisierten GFP und kationische Farbstoffe bewertet.

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen C. elegans

Dieses Protokoll beschreibt eine robuste, reproduzierbare und einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung von Myoblasten Vorläuferzellen aus dem Skelettmuskel von Erwachsenen und alten Menschen. Die Muskeln hier sind Fuß- und Beinmuskeln. Dieser Ansatz ermöglicht die Isolierung einer angereicherten Population von primären Myoblasten für funktionelle Studien.

Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen

Wir beschreiben eine neuartige experimentelle Technik, die nennen wir Minimal Invasive Muskel einbetten (MIME), basiert auf dem Beweis Skelettmuskelgewebe lebensfähige myogen Zellen enthält, die Spender-Zell-vermittelten Myogenesis bei implantiert erleichtern können Ein Host-Muskel.

Minimal-Invasive Muskel einbetten (MIME) - eine neuartige experimentelle Technik, Spender-Zell-vermittelten Myogenesis zu erleichtern

Messung von Nagetier Skelettmuskulatur kontraktile Funktion ist ein nützliches Tool, das Fortschreiten der Krankheit sowie die Wirksamkeit der therapeutischen Intervention zu verfolgen verwendet werden kann. Wir beschreiben hier die nicht-invasive, in Vivo Beurteilung der releveurs Muskeln, die im Laufe der Zeit in der gleichen Maus wiederholt werden kann.

Nicht-invasive Beurteilung des releveurs Muskelfunktion bei Mäusen

Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, die bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie beeinträchtigt sind, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

In diesem Protokoll wird eine In-vitro-Kultivierungs- und Funktionsanalysemethode für Muskelstammzellen beschrieben, die die meisten ihrer Wechselwirkungen mit ihrer endogenen Nische bewahrt.

Single Myofiber Culture Assay zur Beurteilung der Funktionalität adulter Muskelstammzellen ex vivo

Die Skelettmuskulatur besteht aus mehreren Zelltypen, einschließlich residenter Stammzellen, von denen jede einen besonderen Beitrag zur Muskelhomöostase und -regeneration leistet. Hier werden die 2D-Kultur von Muskelstammzellen und die Muskelzellnische in einer ex vivo Umgebung beschrieben, die viele der physiologischen, in vivo und Umwelteigenschaften bewahrt.

Unfraktionierte Massenkultur des Mausskelettmuskels zur Rekapitulation der Nischen- und Stammzellruhe

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein orofaziales Muskelfibrosemodell zu etablieren. Der Vergleich der Histologie zwischen Mäusen, Kaumuskel und Tibialis-Vordermuskel nach Erfrierverletzung bestätigte eine Kaumuskelfibrose. Dieses Modell wird die weitere Untersuchung des Mechanismus erleichtern, der der orofazialen Muskelfibrose zugrunde liegt.

Einfrierverletzung im Kaumuskel der Maus zur Etablierung eines orofazialen Muskelfibrosemodells

Erfahren Sie die Bewertung von Verletzungs-induzierter Seneszenz und In-vivo-Reprogrammierung in der Skelettmuskulatur. Diese Methode ermöglicht die zuverlässige Detektion und Quantifizierung seneszenter Zellen für die Regenerationsmedizin.

Bewertung von Verletzungen-Induzierte Seneszenz und In Vivo eine Anpassung in der Skelettmuskulatur

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