Bewertung von Verletzungen-Induzierte Seneszenz und In Vivo eine Anpassung in der Skelettmuskulatur
26. Oktober 2017
Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll, beide seneszenten erkennen und pluripotenten Stammzellen in der Skelettmuskulatur bei Verletzungen während der Induktion in Vivo Umprogrammierung. Diese Methode eignet sich für die Bewertung der Rolle der zellulären Seneszenz während der Geweberegeneration und Umprogrammierung in Vivo.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, sowohl die zelluläre Seneszenz als auch die Umprogrammierung im Skelettmuskel nach Gewebeschädigung in vivo zu bewerten. Diese Methode kann helfen, entscheidende Fragen im Bereich der regenerativen Medizin zu beantworten, beispielsweise wie die zelluläre Plastizität verbessert werden kann, um die Muskelregeneration zu fördern. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, eine zuverlässige Methode bereitzustellen, um Seneszenz-zellen im lokalen Gewebeumfeld nachzuweisen und zu quantifizieren.
Die Zellalterung (Seneszenz) wurde kürzlich in Zusammenhang mit der Gewebereparatur und Regeneration gebracht. Das Verständnis der Mechanismen, durch die die Seneszenz zur Gewebereparatur und Regeneration beiträgt, wird zweifellos Auswirkungen auf die regenerative Medizin haben. Wir hatten die Idee zu dieser Methode erstmals, als wir den möglichen Einfluss von Gewebeschäden auf die In-vivo-Umprogrammierung im Skelettmuskel untersuchten.
Um dieses Verfahren zu beginnen, fixieren Sie die Objektträger mit Muskelproben vier Minuten lang in 1 % Paraformaldehyd und 0,2 % Glutaraldehyd in PBS. Anschließend waschen Sie die Objektträger zweimal mit PBS, jeweils zehn Minuten lang. Danach waschen Sie die Objektträger 30 Minuten lang mit PBS, pH 5,5.
Als Nächstes inkubieren Sie die Schnitte mit der X-gal-Lösung im Dunkeln bei 37 Grad Celsius für mindestens 24 Stunden. Anschließend waschen Sie die Objektträger dreimal mit PBS, jedes Mal für 10 Minuten. Danach fixieren Sie die Objektträger erneut mit PBS, der 1 % Paraformaldehyd enthält, für 30 Minuten.
Spülen Sie die Objektträger abschließend dreimal mit PBS. Färben Sie anschließend mit 0,2 % Eosin, indem Sie die Objektträger eine Minute lang in die Eosin-Lösung eintauchen. Danach spülen Sie sie kurz mit destilliertem Wasser ab.
Die Objektträger mit einer wässrigen, nicht fluoreszierenden Eindecklösung eindecken. Die Objektträger mit PBS, der 4 % Paraformaldehyd enthält, 10 Minuten lang fixieren. Anschließend zweimal je 10 Minuten mit PBS waschen.
Im Anschluss die Permeabilisierungslösung hinzufügen und fünf Minuten lang inkubieren. Danach die Objektträger zweimal mit PBS waschen, jeweils fünf Minuten lang. Beim letzten Waschschritt 200 Mikroliter PBS mit 0,25 % BSA direkt auf die Objektträger geben und fünf Minuten lang einwirken lassen.
Die Objektträger über Nacht bei 4 Grad Celsius in PBS mit 5 % FBS mit dem primären Anti-Nanog-Antikörper bei 1,25 Mikrogramm pro Milliliter inkubieren. Die Objektträger zweimal mit PBS waschen, jedes Mal 10 Minuten lang. In der letzten Waschung 200 Mikroliter PBS mit 0,25 % BSA fünf Minuten lang verwenden.
Anschließend die Objektträger mit 100 Mikrolitern RAB-HRP Sekundärantikörper aus einem Fertigkit für 45 Minuten inkubieren. Danach die Objektträger dreimal mit PBS waschen, jedes Mal fünf Minuten lang, um den Sekundärantikörper zu entfernen. Danach DAB im Substratpuffer, der im Fertigkit enthalten ist, verdünnen.
Sorgfältig vortexen. 100 µL DAB-Lösung direkt auf jeden Objektträger geben und maximal 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die DAB-Lösung entfernen, indem die Objektträger mit Wasser gespült werden.
Färben Sie die Objektträger zwei Minuten lang mit der schnellen Rot-Lösung als Gegengefärbung. Anschließend spülen Sie die Objektträger erneut kurz mit Wasser. Danach dehydrieren Sie sie fünf Minuten lang mit 95 % Ethanol, gefolgt von zweimaligem Behandeln mit 100 % Ethanol, jeweils fünf Minuten lang.
Anschließend die Objektträger mit einem schnell aushärtenden Eindeckmedium aufnehmen. Die Objektträger im Hellfeldmikroskop bei 20x betrachten, um Hintergrund zu vermeiden. Bei diesem Verfahren die Objektträger scannen und auf jedem Objektträger die beiden qualitativ besten Schnitte auswählen, die basierend auf der Gewebestruktur, der Färbungsqualität und der Gegengefärbung den größtmöglichen Abstand zueinander aufweisen.
Zählen Sie die SA-Beta-Gal-positiven Zellen in diesen beiden Abschnitten und berechnen Sie den Mittelwert. Bestimmen Sie anschließend die Größe der Pixel, indem Sie manuell die kleinsten und größten positiven SA-Beta-Gal-Zellen auswählen. Klicken Sie in der ImageJ-Oberfläche auf Analysieren, Werkzeuge, ROI-Manager, Analysieren, Messung festlegen.
Danach „Fläche“ auswählen. Mit dem Auswahlwerkzeug die kleinste und die größte positive SA-Beta-Gal-Zelle umranden und durch Klicken auf „Hinzufügen“ dem ROI-Manager hinzufügen. Anschließend die Größen mithilfe der Schaltfläche „Messen“ bestimmen und die Werte für die spätere Verwendung speichern.
Danach den Schwellenwert-Parameter anpassen, um sicherzustellen, dass alle sichtbaren positiven Zellen ausgewählt sind. Das Bild konvertieren, indem man auf Bild, Typ und dann 8-Bit klickt. Anschließend zu Bild, Anpassen und Schwellenwert wechseln.
Bewegen Sie den zweiten Cursor, bis alle positiven SA-Beta-Gal-Zellen in Rot hervorgehoben sind, und klicken Sie dann auf „Übernehmen“. Analysieren Sie die Partikel, indem Sie auf „Analysieren“ und dann auf „Partikel analysieren“ klicken, gefolgt von „Größe“ und geben Sie den zuvor definierten Wert an. Geben Sie den Rundheitswert 0,00–1,00 ein und klicken Sie auf „OK“. Eine Zusammenfassung aller gezählten Partikel wird im ROI-Manager angezeigt.
Übertragen Sie nun alle ausgewählten Partikel auf das ursprüngliche Bild. Passen Sie die Auswahl manuell an, um eine genaue Quantifizierung sicherzustellen. Fügen Sie positive Zellen hinzu oder entfernen Sie falsch positive Zellen.
Schließlich die Fläche messen, indem der Bereich mit dem Auswahlwerkzeug umrissen wird. Auf ROI-Manager klicken, Hinzufügen, dann Messen. Unter dem Mikroskop die Nanog-positiven Zellen im Hellfeld bei 20facher Vergrößerung manuell zählen.
Hier ist eine schematische Darstellung zur Beurteilung der in-vivo-Umprogrammierung und des Seneszenzniveaus nach einer Muskelverletzung gezeigt. Hier sind repräsentative Bilder der SA-Beta-Gal- und Nanog-Färbung an Gefrierschnitten des geschädigten Skelettmuskels. Diese Bilder zeigen die SA-Beta-Gal-Färbung, kontragefärbt mit Eosin, sowie die Nanog-Färbung, kontragefärbt mit Fast Red.
Die nicht verletzten Muskeln sind oben dargestellt, während die verletzten Muskeln unten gezeigt werden. Dieses Diagramm zeigt die Quantifizierung und Korrelation von SA-Beta-Gal-positiven und Nanog-positiven Zellen in aufeinanderfolgenden Schnitten 10 Tage nach der Verletzung. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets eine negative Kontrolle einzuschließen, um die Spezifität der Färbung sicherzustellen.
Nach dieser Vorgehensweise können alle Methoden, wie die Immunfluoreszenz oder die Wahl unterschiedlicher Seneszenzmarker, an allen Zelltypen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise die zelluläre Identität der seneszenten Zellen. Mit jeder Weiterentwicklung ebnete diese Technik Forschenden auf dem Gebiet der Seneszenz oder der Gewebereparatur und -regeneration den Weg, um zu untersuchen, wie zelluläre Seneszenz zelluläre Plastizität fördern kann, um die Gewebereparatur und -regeneration bei Säugetieren zu unterstützen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man sowohl seneszente als auch reprogrammierte Zellen in vivo identifizieren kann.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Nachweis seneszenter und pluripotenter Stammzellen im Skelettmuskel nach einer Verletzung, die die in-vivo-Umprogrammierung ermöglicht. Es wurde entwickelt, um die Rolle der zellulären Seneszenz bei der Geweberegeneration zu untersuchen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Regenerativen Medizin
- Zellbiologie
- Gewebereparatur
Hintergrund
- Die Zellalterung ist mit der Gewebereparatur und -regeneration verknüpft.
- Das Verständnis der Mechanismen der Zellalterung kann die Muskelregeneration verbessern.
- Diese Methode beantwortet zentrale Fragen der regenerativen Medizin.
- Sie bietet eine zuverlässige Möglichkeit, seneszente Zellen nachzuweisen und zu quantifizieren.
Zweck der Studie
- Um die zelluläre Seneszenz im Skelettmuskel in vivo zu bewerten.
- Um die Auswirkung von Gewebeschädigungen auf die zelluläre Reprogrammierung zu beurteilen.
- Um die zelluläre Plastizität zur Muskelregeneration zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Nachweis seneszenter Zellen im Skelettmuskel.
- Beurteilung der in-vivo-Umprogrammierung.
- Quantifizierung der zellulären Seneszenz.
- Beurteilung der Geweberegenerationsprozesse.
Hauptergebnisse
- Zuverlässige Detektion seneszenter und pluripotenter Stammzellen.
- Einblicke in die Rolle der Seneszenz bei der Muskelregeneration.
- Verbessertes Verständnis der Mechanismen der zellulären Plastizität.
- Mögliche Implikationen für Strategien der regenerativen Medizin.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode eignet sich zur Untersuchung der Seneszenz im Muskelgewebe.
- Das Verständnis der Seneszenz kann regenerative Therapien maßgeblich beeinflussen.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um die Muskelreparatur zu verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Detektion seneszenter und reprogrammierter Zellen im verletzten Skelettmuskel ermöglicht eine mechanistische Entwicklungsrisikominderung für Programme der regenerativen Medizin. Dieser Arbeitsablauf unterstützt die Vorhersagegenauigkeit von Gewebeheilungsmodellen und liefert Hinweise für die frühe Zielvalidierung bei Interventionen, die darauf abzielen, die zelluläre Plastizität zu modulieren. Die Integration der Analyse von Seneszenz und Reprogrammierung in vivo stärkt die translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Forschung in Portfolios von muskuloskelettalen Erkrankungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der seneszenzgetriebenen Mechanismen, die der Geweberegeneration zugrunde liegen.
- Unterstützt die funktionelle Target-Validierung durch Quantifizierung seneszenter und pluripotenter Zellpopulationen nach Verletzung.
- Erleichtert die biologische Entschärfung von Strategien zur Modulation regenerativer Signalwege.
- Liefert Daten zur Priorisierung von Targets basierend auf deren Relevanz in vivo und den Ergebnissen hinsichtlich Zellplastizität.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert validierte histochemische und immunhistochemische Assays für Seneszenz- und Pluripotenzmarker.
- Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse für die nachgeschaltete Identifizierung von Modulatoren.
- Ermöglicht die Standardisierung gewebebasierter Assays zur Vergleichbarkeit über verschiedene Studien hinweg.
- Bereitet robuste biologische Systeme für die Wirkstoffprüfung in regenerativen Kontexten vor.
Translationale und präklinische Forschung
- Entspricht krankheitsrelevanten Modellen von Muskelverletzungen und -reparatur.
- Ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der mechanistischen Entdeckung zur präklinischen Validierung regenerativer Interventionen.
- Liefert quantitative Endpunkte für risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung in der Gewebereparatur-Pipeline.
- Ermöglicht die biomarkerbasierte Beurteilung zellulärer Plastizität in vivo.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem sie die in-vivo-Quantifizierung von Zellalterung und Umprogrammierung nach Gewebeschädigung ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur seneszenzvermittelten Geweberegeneration und zellulären Plastizität.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte für die Assay-Entwicklung und Wirkstoff-Screening.
- Analytik: Bietet bildbasierte Quantifizierung und statistische Auswertungen zum Vergleich experimenteller Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse mit präklinischen Modellen der Muskelreparatur und -regeneration.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare Plattform zur Bewertung von Seneszenz und Umprogrammierung über verschiedene Gewebetypen und Interventionen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vorhersagevertrauen hinsichtlich regenerativer Mechanismen und Zielvalidierung.
- Operativer Wert: Standardisiert gewebebasierte Assays hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Unterstützt Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch und verringert biologische Risiken in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien regenerativer Portfoliovorhaben.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Assets in der regenerativen Medizin.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Histochemie, Immunhistochemie und Bildanalyse.
- Benötigt Zugang zu Mikroskopie, Software zur Bildquantifizierung und validierten Antikörpern.
- Erfordert strikte, übergreifende Standardisierung zwischen Teams zur Reproduzierbarkeit des Assays.
- Einsatzbar bei anderen Gewebeschädigungsmodellen bei geeigneter Markerauswahl.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit von frischen oder gefrorenen Gewebeproben für den SA-β-Gal-Assay.
