Quantifizierung von der Fülle und Ebenen des Transfer-RNAs in Escherichia coli aufladen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Häufigkeit und Ladung von Transfer-RNAs in Escherichia coli zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Zellbiologie zu beantworten, z. B. wie sich die tRNA-Ladung in verschiedenen Wachstumsstadien ändert. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass die RNA-Spiegel auch zwischen Wachstumszuständen, die die Zusammensetzung der RNA in den Zellen drastisch verändern, quantitativ verglichen werden können.

Beginnen Sie dieses Experiment, indem Sie experimentelle und Spike-in-E.coli-Kulturen gemäß dem Textprotokoll züchten. Züchten Sie die Spike-in-Kultur bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 160 U/min. Wenn die Spike-in-Kultur einen OD436 von etwa 0,1 erreicht hat, induzieren Sie die Expression von tRNA-Zelle C durch Zugabe von IPTG.

Vergrößern Sie die Kultur, bis sie einen OD436 von etwa 0,5 erreicht. Bringen Sie die Kultur dann auf Eis, bis alle Proben geerntet wurden. Danach wird ein 100-Milliliter-Kulturkolben mit Deckel mit vier Millilitern 10 % TCA pro Probe in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad vorgewärmt.

Messen und erfassen Sie das OD436 der Versuchskulturen direkt vor der Zellernte. Dann werden vier Milliliter Kultur in einen vorgewärmten TCA-Kolben gegeben. Mischen Sie die Probe von Hand, indem Sie den Kolben fünf Sekunden lang schwenken, wodurch sofort alle enzymatischen Aktivitäten deaktiviert werden und die Ladungsniveaus der tRNAs erhalten bleiben.

Wenn alle Proben entnommen wurden, fügen Sie jeder Probe 5 %-Spike-in-Zellen hinzu. Bereiten Sie außerdem eine Kontrollprobe vor, die nur aus Spike-in-Zellen besteht, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die RNA-Extraktion zu starten, gießen Sie acht Milliliter jeder Probe, einschließlich der Kontrollen, in ein eisgekühltes Zentrifugenröhrchen.

Zentrifugieren Sie die Proben bei 9.500 x G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Nachdem Sie den Überstand vollständig entfernt haben, suspendieren Sie das Pellet wieder in 0,3 Millilitern kaltem Natriumacetat, das 10 Millimolar EDTA enthält. Übertragen Sie jede Probe in ein kaltes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 0,3 Milliliter Phenol hinzu, das mit dem Puffer äquilibriert ist und zur Resuspendierung des Pellets verwendet wird.

Wirbeln Sie dann jede Probe 10 Mal für jeweils 15 Sekunden vortexen. Mit mindestens einer Minute bei null Grad Celsius zwischen jedem Wirbel, um die Proben kalt zu halten. Anschließend zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x G bei vier Grad Celsius für 15 Minuten.

Übertragen Sie die obere oder Wasserfläche in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 0,3 Milliliter kaltes Phenol auf die Wasseroberfläche und wirbeln Sie die Proben viermal 15 Sekunden lang, wie zuvor beschrieben. Zentrifugieren Sie die Proben dann bei 20.000 x G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.

Übertragen Sie die Wasseroberfläche in ein neues kaltes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 2,5 Volumen kaltes 96%iges Ethanol hinzu. Inkubieren Sie dann die Röhrchen eine Stunde lang bei 20 Grad Celsius, um die RNA auszufällen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 x G bei vier Grad Celsius für 30 Minuten.

Geben Sie nach dem Entfernen des Überstands vorsichtig einen Milliliter kaltes 70%iges Ethanol in das RNA-Pellet und achten Sie darauf, es nicht zu stören. Drehen Sie das Rohr einmal vorsichtig um, um es mit Ethanol zu waschen. Zum Schluss zentrifugieren Sie bei 20.000 x G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.

Entfernen Sie den Überstand vollständig und trocknen Sie das Pellet an der Luft, bis das Ethanol vollständig entfernt ist. Bei 20 Mikrolitern kaltem Natriumacetat mit 1 Millimolar EDTA kräftig wirbeln, um das Pellet wieder zu suspendieren. Um die Elektrophorese zu starten, mischen Sie vier Mikroliter jeder Probe mit sechs Mikrolitern Ladepuffer.

Laden Sie die Proben, einschließlich der Kontrollen, auf ein 0,4 Millimeter dickes 6,5-Polyacrylamid-Gel, das acht molare Ureal und 0,1 molare Natriumacetatpuffer enthält. Trennen Sie dann die RNA, indem Sie die Elektrophorese bei 10 Volt pro Zentimeter Gel bei vier Grad Celsius etwa 20 Stunden lang laufen lassen, bis der Bromphenolblau-Farbstoff den Boden des Gels erreicht. Trennen Sie die beiden Glasplatten vorsichtig, so dass das Gel auf einer von ihnen verbleibt.

Verwenden Sie den Gelbereich vom Xylol-Cyanol-Farbstoff und 20 Zentimeter nach unten in Richtung des Bromphenol-Farbstoffs zum Abtupfen. Schneiden Sie ein dünnes Stück Filterpapier auf die Größe der gewünschten Löschfläche. Lege das Filterpapier auf den Teil des Gels, der zum Abtupfen verwendet werden soll.

Schneiden Sie die Teile des Gels ab und entsorgen Sie sie, die nicht mit Filterpapier bedeckt sind. Heben Sie dann das Gel mit dem Filterpapier vorsichtig von der Glasplatte ab. Legen Sie eine positiv geladene Nylonmembran auf das Gel und tupfen Sie sie 90 Minuten lang in Transferpuffer bei 20 Volt elektrobuptil.

Zum Schluss vernetzen Sie die RNA mit der Membran unter Verwendung von UV-Licht. Legen Sie anschließend die vernetzte Membran in ein Hybridisierungsröhrchen und fügen Sie sechs Milliliter Hybridisierungslösung hinzu. Drehen Sie das Röhrchen eine Stunde lang bei 42 Grad Celsius, um die Membran vorzu hybridisieren.

Fügen Sie dann 30 molare radioaktive Oligo-DNA-Sonden mit Peak hinzu, fünf primiert und mit P32 markiert. Drehen Sie, um die Membran mit der Sonde über Nacht bei 42 Grad Celsius zu inkubieren. Verwenden Sie nach der Inkubation eine 10-Milliliter-Einwegpipette, um die Sonde zu entfernen.

Waschen Sie die Membran anschließend schnell zweimal im Hybridisierungsröhrchen in 15 Millilitern Waschlösung bei Raumtemperatur. Schieben Sie die Membran in einen flachen Plastikbehälter, bedecken Sie ihn mit der Waschlösung und schließen Sie den Deckel. Inkubieren Sie die Membran auf einem Shaker bei Raumtemperatur 30 Minuten lang.

Wechseln Sie die Lösung und fahren Sie mit dem Waschen fort, bis ein zufriedenstellendes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht ist. Verwenden Sie ein Geigermüllerrohr, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, indem Sie die Strahlung aus dem Bereich, in dem die Sonde zu tRNA hybridisiert hat, mit der Strahlung aus einem leeren Bereich vergleichen. Wickeln Sie die Membran danach fest in Frischhaltefolie ein und verschließen Sie sie luftdicht durch Schweißen.

Legen Sie diese Membran auf ein Phosphorimaging-Sieb. Scannen Sie nach ausreichender Belichtungszeit den Bildschirm mit einem Laserscanner und speichern Sie die Datei im Gelformat. Laden Sie als Nächstes die Geldatei in die Imaging-Software.

Zeichnen Sie eine vertikale Linie entlang jeder der Abtastspuren, so dass sie den größten Teil der Breite der Spur einnimmt, während die Kanten der Bänder, an denen das Signal uneben sein kann, ausgeschlossen werden. Um die Anzahl der einzelnen Lanes zu visualisieren, klicken Sie auf Analyse und dann auf Diagramm erstellen. Definieren Sie manuell die beiden Peaks, die die geladene und die ungeladene tRNA aus jeder Spur darstellen.

Klicken Sie danach auf Analyse und dann auf Flächenbericht, um die Zählungen von jedem Gipfel zu erhalten. Notieren Sie abschließend die Fläche unter jedem der beiden Gipfel. Berechnen Sie die tRNA-Spiegel wie im Textprotokoll beschrieben.

Diese Methode wurde verwendet, um die Häufigkeit verschiedener tRNAs und E.Coli nf915 vor und während unseres Argininhungers zu messen. Auf der nördlichen Parzelle, die mit verschiedenen tRNA-Sonden hybridisiert wurde, gibt es eine klare Trennung zwischen den Banden, die die geladene tRNA repräsentieren, und den Banden, die die ungeladene tRNA repräsentieren. Das Strahlungsprofil entlang jeder Spur wurde von den nördlichen Blots mit Hilfe einer Bildgebungssoftware erstellt.

Das Strahlungssignal von jeder Spur wurde quantifiziert, indem jede Spur vom Blot isoliert wurde. Ein Diagramm, das die Quantifizierung des Signals von einer einzelnen Spur darstellt, zeigt zwei Spitzenwerte. Der linke Peak stammt von der aminoacylierten tRNA und der rechte von der deacylierten tRNA.

Die Fläche unter jedem Peak wird zur weiteren Analyse exportiert. Die Quantifizierung der Banden aus dem Northern Blot zeigt, dass die relative Abundanz aller getesteten tRNA-Spezies während des Aminosäuremangels schnell und signifikant abnahm. Auf der anderen Seite sanken die tRNA-Ladungsniveaus der Arginin-akzeptierenden tRNA nach der Argininentfernung schnell ab und stiegen dann während der Hungerperiode leicht an.

Die Ladungsniveaus der anderen tRNAs stiegen jedoch nach dem Hungertod leicht an und sanken dann fast auf das Niveau vor dem Hungertod. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie RNA so gereinigt werden kann, dass die Ladung und Häufigkeit von tRNA quantifiziert werden kann, und wie Spike-in-Zellen zur Normalisierung verwendet werden. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die RNA kalt und sauer zu halten, um die Hydrolyse der RNA zu verhindern.