Name: Quantifizierung von der Fülle und Ebenen des Transfer-RNAs in Escherichia coli aufladen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Lernen Sie die Quantifizierung von tRNA-Ladungsniveaus in Escherichia coli für RNA-Biologie mittels Spike-in-Zellen. Diese Methode ermöglicht quantitative Vergleiche zwischen verschiedenen Wachstumszuständen.

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Die Autoren danken Marit Warrer für ausgezeichnete technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Danish Council für unabhängige Forschung | Naturwissenschaften [1323-00343B] und der dänischen National Research Foundation [DNRF120].

<ol><li>Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li>
<li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel%28%2B%29+and+Rel%28-%29+strains+during+amino+acid+starvation%3A+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li>
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<li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18(2011).</li>
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<li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li>
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<li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie gleichzeitig messen Sie den Ladezustand des spezifischen E. Coli tRNAs und vergleichen Sie die relativen Pegel der tRNAs in verschiedenen Proben. Die kritischen Punkte des Protokolls sind 1) die Proben so zu behandeln, dass die zelluläre tRNA Ladestation Ebenen beibehalten werden, 2) tRNA Mengen so normalisieren, dass relative tRNA-Ebenen in verschiedenen Proben zuverlässig verglichen werden können, und (3) die sp zu gewährleisten, Ecificity der ausgewählten Sonden für die tR...

Im folgenden präsentieren wir eine Methode zur Quantifizierung der spezifische tRNAs und Messung ihrer Aufladung von Nordbeflecken Ebenen. Die Methode basiert auf einer Technik, die zuerst von Varshney Et Al. entwickelt 1. durch Ernten von Zellen in Säure Trichloressigsäure (TCA) und halten die Proben bei 0 ° C während die RNA-Reinigung, die Esterbindung zwischen der tRNA und der Aminosäure ist konservierte2,3,4. Aminoacylated tRNAs unterschieden werden von ihren Nonacylated Pendants durch Gelelektrophorese und Nordbeflecken, zurückzuführen auf eine verminderte Beweglichkeit der Aminoacylated tRNA im Gel, verursacht durch die kovalent gebundene Aminosäure-5. Darüber hinaus präsentieren wir ein Protokoll für die Normalisierung der tRNA Mengen durch Zugabe von Spike-in Zellen überexprimiert selten verwendete tRNASelC 4.
tRNAs sind einige der am häufigsten vorkommende Moleküle in der Bakterienzelle und ein entscheidender Teil der Übersetzungsmaschinerie. tRNAs binden Aminosäuren und übertragen Sie sie auf die Übersetzungen Ribosomen. Die Bindung der Aminosäuren an tRNAs (Aminoacylation oder beim Laden) wird durch Aminoacyl-tRNA-Synthetasen erleichtert. Die relative Häufigkeit der verschiedenen geladenen tRNAs ist wichtig für die Treue der Proteinsynthese, zu gewährleisten, weil Unterrepräsentierung der Cognate aufgeladen tRNA für ein bestimmtes Boten-RNA (mRNA) Codon erhöht die Wahrscheinlichkeit, die ein nahe verwandtes tRNA wird liefern Sie irrtümlich die Aminosäure an die wachsende Polypeptidkette am Ribosom6. Die Bedeutung der geladenen tRNA spiegelt sich in der umfangreichen Antwort der E. Coli Zelle zu einem starken Einbruch in der Ladestation ein tRNA; die strenge Antwort. Während die strenge Antwort ist die Synthese von tRNAs, ribosomalen RNAs und die meisten mRNAs zu Gunsten der Transkription von spezifischen mRNAs zugeordnete Aminosäure Biosynthese und Stress überleben gesenkt, und die Wachstumsrate der Zellen sinkt dramatisch7 . Darüber hinaus hat neuere Arbeiten von uns und anderen gezeigt, dass E. Coli aktiv verschlechtert sich den Großteil seiner tRNA als Reaktion auf die betont, die dass die Übersetzung4,8, begrenzen darauf hindeutet, dass die Anpassung der tRNA-Ebenen wichtig für den Umgang mit diesen Belastungen. So werden zuverlässige Messungen der tRNA Häufigkeiten und Ebenen laden ein wichtiges Instrument für bakterielle Stressreaktionen vollständig zu verstehen.
E. coli ist allgemein verwendet, um auszudrücken rekombinantes Protein und wegen der Unterschiede in Codon Usage zwischen den Arten, suboptimale Ausdruck ist ein Problem, oft vor9. Dies kann durch Expression von zusätzlichen tRNAs benötigt, um die rekombinante mRNA10übersetzen umgangen werden. Messungen der tRNA laden Ebenen in dieser Stämme könnte führen Problembehandlung und Optimierung der Proteinexpression.
Diese Methode ermöglicht auch die Erkennung von "mischarging"; ein tRNA-Molekül-Aminoacylated mit einer Aminosäure nicht verwandtes. Aminoacylation von verschiedenen Aminosäuren verursachen eine tRNA mit leicht unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch Polyacrylamid-Gele1,11migrieren. In einigen Fällen kann die Methode auch verwendet werden, verschiedene Änderung Muster auf ansonsten identischen tRNAs3unterscheiden.
Ein etablierter biochemische Verfahren für die Untersuchung der tRNA Ebenen laden ist Oxidation periodate. Die Methode beruht auf der Beobachtung, dass Aminoacylated, die tRNA geschützt periodate Oxidation und ungeladenen tRNA nicht. Nach periodate Oxidationsbehandlung das Nachladen von der tRNA verwendet, um den Ladevorgang Ebenen der geernteten RNA zu schätzen. Jedoch hat das Nachladen von mehreren tRNAs gezeigt, wodurch einige Ungenauigkeiten12Behandlung betroffen zu sein. Die Methode hier vorgestellten Maßnahmen laden direkt vom gereinigten RNA, also ohne irgendwelche Vorurteile von chemischen oder enzymatischen Reaktionen. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass nur ein tRNA-Arten in einer Zeit, so dass zwar die gleichen Northern blot abgestreift und reprobed für mehrere tRNAs erkannt wird, ist zeitaufwendig und etwas mühsam, die Daten auf viele tRNAs zu sammeln.
Ein verlässlicher Weg der Normalisierung Proben miteinander ist vital in Studien, wo das Ziel ist, die relativen Pegel eines Moleküls über verschiedene Proben zu vergleichen. Hier stellen wir eine Normalisierung Verfahren für RNA, wo eine kleine aliquoten von E. Coli Zellen überexprimiert seltene tRNASelC als Spike-in der experimentellen Proben vor RNA Reinigung hinzugefügt wird. Diese Methode eignet sich nicht nur bei der tRNAs Prüfung aber für relative Quantifizierung aller Arten von RNA als der experimentelle Aufbau ist, die keine endogene RNA zu trauen kann auf die gleiche zelluläre Konzentration in den Proben präsentieren. Zum Beispiel ist das Niveau eines "Housekeeping" RNA-wie ribosomaler RNA oft verwendet, wie ein endogener Verweis auf die relativen Mengen von einem anderen RNS zwischen verschiedenen vergleichen13Proben. Aber dies ist von geringem Nutzen, wenn die zelluläre Konzentration der Referenz RNA zwischen Proben variiert, wie bei ribosomaler RNA der Fall sein kann, tritt Probenahme während einer Belastung Antwort15,16,17 oder Eintritt in die stationäre Phase17. Die Zugabe von Spike-in Zellen, die experimentellen Proben vor RNA-Reinigung bietet eine solide und genaue Möglichkeit der Normalisierung unabhängig von der Probenahme-Einrichtung. Eine weitere Möglichkeit der Standardisierung ist der Zusatz von einem oder mehreren Spike-in RNAs, die experimentellen Proben nach RNA-Reinigung. Diese Methode berücksichtigt jedoch nicht für irgendwelche Unterschiede in RNA Erholung zwischen Proben.
Mit E. Coli Zellen die Overexpress Referenz RNA als Spike-in Zellen (siehe Abbildung 1) in einem Experiment auf E. Coli hat den Nachteil, das es ergibt sich darüber hinaus einer kleinen Menge von exogenen E. Coli total RNA, die Proben. Wir korrigieren für diese Ergänzung durch die Analyse einer Probe nur Spike-in Zellen parallel zu den experimentellen Proben (siehe die Northern blot in Abbildung 2, Gasse mit der Bezeichnung "SelC"). Das Protokoll dargestellt ist entwickelt für E. Coli k-12 aber dürfte für die meisten Bakterienarten anwendbar sein.

<table><tbody><tr><td>Harnstoff</td><td>Merck</td><td>57-13-6</td><td>Reinheit >99%</td></tr><tr><td>Polyacrylamid</td><td>Serva</td><td>79-06-7</td><td></td></tr><tr><td>Bis (N,N'-Methylen-bis-acrylamid)</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0201</td><td></td></tr><tr><td>Trichloressigsäure (TCA)</td><td>Sigma</td><td>76-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Merck</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Natriumacetat,</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Tris</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Salzsäure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Natriumchlorid</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>NaH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hering Sperma DNA</td><td>Sigma</td><td>100403-24-5</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polivinylpyrrolidon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P32 & gamma; ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA-Oligos (Sonden)</td><td>TAG Copenhagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybond N+ Membran</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroblotter</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydridisationsofen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geiger-M&uuml; Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphor-Imager-Sieb</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungsröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kulturflaschen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml Zentrifugenröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant</td><td>GE Gesundheitswesen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantifizierung von der fülle und ebenen des transfer-rnas in escherichia coli aufladen

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer-RNA (tRNA) ist ein wesentlicher Bestandteil der translationalen Maschinen in jedem Organismus. tRNAs binden und Aminosäuren auf das übersetzen Ribosom übertragen. Die relativen Pegel der verschiedenen tRNAs und das Verhältnis der Aminoacylated tRNA, total tRNA, bekannt als den Ladezustand sind wichtige Faktoren bei der Bestimmung der Genauigkeit und Geschwindigkeit der Übersetzung. Daher sind die Fülle und Ladestation tRNAs wichtige Variablen zu messen, wenn Protein-Synthese, zum Beispiel unter verschiedenen Stressbedingungen zu studieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Ernte tRNA und direkte Messung der relativen Fülle und den absoluten Ladezustand des spezifischen tRNA-Arten in Escherichia coli. Die tRNA geerntet wird dergestalt, dass die labile Bindung zwischen der tRNA und der Aminosäure gewahrt bleibt. Die RNA wird dann Gelelektrophorese und Northern Blot, welche Ergebnisse bei Trennung von der geladenen und ungeladenen tRNAs unterzogen. Die Ebenen der spezifische tRNAs in verschiedenen Proben können durch die Zugabe von Spike-in Zellen für die Normalisierung verglichen werden. Vor der Reinigung von RNA fügen wir 5 % der E. Coli -Zellen, die die seltene tRNASelC zu jeder Probe zu stossen. Die Menge der tRNA-Arten von Interesse in einer Probe wird dann auf die Höhe der tRNASelC in der gleichen Probe normalisiert. Zugabe von Spike-in Zellen vor RNA-Reinigung hat den Vorteil gegenüber Zusatz von gereinigtem Spike-in RNAs, die es auch Unterschiede in der Zelle Lyse Effizienz zwischen Proben ausmacht.

Mithilfe des Verfahrens beschrieben hier, die Fülle und Aufladen der drei tRNAs in E. Coli k-12 vor und während der Aminosäure Hunger gemessen wurden.
Die Arginin-Auxotroph Stamm NF9154 (Thr Leu seinen ArgH Thi Mtl supE44) wurde zum mindestens zehn Generationen im MOPS minimaler Medium ergänzt mit 0,4 % Glycerin, 50 µg/mL Threonin, Leucin, Arginin und Histidin 5 µg/mL bei 37 ° C Schüttel...

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Messung direkt Transfer-RNA laden Ebenen aus gereinigtem Escherichia coli RNA sowie eine Möglichkeit zum relativen Pegel der Transfer-RNA oder jede andere kurze RNA über verschiedene Proben, die basierend auf den Zusatz von Spike-im Vergleich Zellen mit dem Ausdruck eines Referenz-Gens.

Quantifizierung von der Fülle und Ebenen des Transfer-RNAs in Escherichia coli aufladen

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Häufigkeit und Ladung von Transfer-RNAs in Escherichia coli zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Zellbiologie zu beantworten, z. B. wie sich die tRNA-Ladung in verschiedenen Wachstumsstadien ändert. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass die RNA-Spiegel auch zwischen Wachstumszuständen, die die Zusammensetzung der RNA in den Zellen drastisch verändern, quantitativ verglichen werden können.Beginnen Sie dieses Experiment, indem Sie experimentelle und Spike-in-E.coli-Kulturen gemäß dem Textprotokoll züchten. Züchten Sie die Spike-in-Kultur bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 160 U/min. Wenn die Spike-in-Kultur einen OD436 von etwa 0,1 erreicht hat, induzieren Sie die Expression von tRNA-Zelle C durch Zugabe von IPTG.Vergrößern Sie die Kultur, bis sie einen OD436 von etwa 0,5 erreicht. Bringen Sie die Kultur dann auf Eis, bis alle Proben geerntet wurden. Danach wird ein 100-Milliliter-Kulturkolben mit Deckel mit vier Millilitern 10 % TCA pro Probe in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad vorgewärmt.Messen und erfassen Sie das OD436 der Versuchskulturen direkt vor der Zellernte.

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Biochemie

Wir beschreiben eine Methode für die Microarray-Analyse der relativen Aminoacylierung Pegel aller tRNAs aus...

Genomweite Analyse der Aminoacylierung (Charging) Ebenen der tRNA mittels Microarrays

Quelle: Stenum, T. S. et al. Quantifizierung der Häufigkeit und Ladungsniveaus von Transfer-RNAs in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video demonstriert den Einsatz von Gelelektrophorese und Northern Blotting, um die Ladeniveaus von Transfer-RNAs in E. coli zu erkennen und zu vergleichen, indem aminoacylierte und deacylierte Formen getrennt werden.

Gelelektrophorese und Northern Blotting zur Erkennung von tRNA-Ladewerten in E. coli

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Lernen Sie die Quantifizierung von tRNA-Ladungsniveaus in Escherichia coli für RNA-Biologie mittels Spike-in-Zellen. Diese Methode ermöglicht quantitative Vergleiche zwischen verschiedenen Wachstumszuständen.

Quantifizierung von der Fülle und Ebenen des Transfer-RNAs in Escherichia coli aufladen

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