Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Anwendung der Laser-Mikrobestrahlung zur Induktion verschiedener Arten von DNA-Schäden, einschließlich einfacher Strangbrüche und komplexer Schäden, zu beschreiben, um die Signalübertragung bei DNA-Schäden und die In-vivo-Assemblierung von Reparaturfaktoren zu untersuchen. In den 1960er und 1970er Jahren fokussierten wir einen Laserstrahl durch ein Mikroskop, das Sie hinter mir sehen können, und konnten dadurch eine kleine Region eines Chromosoms schädigen. Die Zelle teilte sich, überlebte, und wir konnten nicht verstehen, warum.

Nun, 40 Jahre später nutzen wir diese Methode, um die DNA-Reparatur gezielt zu untersuchen, und das werden Sie heute sehen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der DNA-Reparatur zu beantworten, beispielsweise wie DNA-Schäden erkannt und verarbeitet werden und wie sich Schadenssignale in der Zelle ausbreiten. Die Laser-Mikrobestrahlung ermöglicht eine Echtzeit-Analyse mit hoher Auflösung an einzelnen Zellen hinsichtlich der Dynamik makromolekularer Prozesse als Reaktion auf DNA-Schäden, die auf einen Bereich von mehreren Mikrometern innerhalb des Zellkerns begrenzt sind.

Es wurden jedoch verschiedene Laserbedingungen verwendet, ohne die Unterschiede in den Arten der induzierten Schäden zu berücksichtigen, was zu Inkonsistenzen bei zellulären Reaktionen, der Rekrutierung von Faktoren und deren Modifikationen geführt hat. Um fluoreszenzmarkierte Proteine in Hela-Zellen zu exprimieren, säen Sie am ersten Tag sechs bis acht mal 10 hoch vier Zellen in 0,5 Milliliter Kulturmedium in einer Vertiefung einer 24-Loch-Platte aus. Anschließend stellen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator.

Am zweiten Tag führen Sie eine liposomvermittelte DNA-Transfektion durch, indem Sie 0,3 Mikrogramm einer Säuger-Expressions-Plasmid-DNA, die einen fluoreszenzmarkierten DNA-Reparaturfaktor kodiert, in 25 Mikroliter kulturbedingtem Medium ohne Serum verdünnen. Hier verwenden wir die an Schadensstellen bindende Domäne von 53BP1, fusioniert mit GFP, für Doppelstrangbruchschäden oder die DNA-Glykosylase NTH1, fusioniert mit GFP, für Basenschäden. In einem anderen 1,5-Milliliter-Röhrchen verdünnen Sie ein Mikroliter eines liposombasierten DNA-Transfektionsreagenz in 25 Mikroliter kulturbedingtem Medium ohne Serum und mischen anschließend den Inhalt der beiden Röhrchen – die verdünnte DNA und das Transfektionsreagenz – miteinander. Inkubieren Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten, um DNA-Lipid-Komplexe zu bilden.

Spülen Sie die Zellen einmal mit 0,5 Milliliter Kulturmedium, entfernen Sie danach das Medium und geben Sie 0,5 Milliliter frisches Kulturmedium zu den Zellen hinzu. Geben Sie die DNA-Lipid-Komplexe zu den Zellen und mischen Sie vorsichtig durch mehrmaliges Schaukeln der Platte. Danach bringen Sie die Zellen zurück in den Inkubator.

Nach vier bis sechs Stunden das Kulturmedium von den Zellen entfernen und 300 Mikroliter 0,5 %iges Trypsin-EDTA hinzufügen. Die Lösung entfernen, anschließend 200 Mikroliter Trypsin-EDTA hinzufügen und die Zellen für drei bis vier Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach Bestätigung der Zellablösung 800 Mikroliter Kulturmedium hinzufügen und die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren resuspendieren, um Zellklumpen aufzubrechen.

Überführen Sie die Zellsuspension in eine 35-Millimeter-Kulturschale mit einem skalierten Deckglas und geben Sie Kulturmedium bis zu einem Endvolumen von zwei Millilitern hinzu. Nach 48 Stunden erreichen die Zellen eine Konfluenz von 30 bis 60 % mit exprimiertem fluoreszierendem Protein und sind bereit für die Induktion von Laserbeschädigung. Schalten Sie den NIR-Laser ein und lassen Sie das Lasersystem vor der Verwendung eine Stunde lang aufwärmen.

Platzieren Sie eine Zellkultur auf einer beheizten Stufe mit 37 Grad Celsius in einer Kammer, die die Kontrolle von Kohlendioxid und Luftfeuchtigkeit ermöglicht. Verwenden Sie für die Live-Zell-Analyse fluoreszenzmarkierter Proteine ein Objektiv mit hoher Vergrößerung und Ölimmersion sowie eine geeignete Kombination von Fluoreszenzfiltern, abhängig von der Markierung. Suchen Sie nach Zellen mit vergleichbarer Expression des fluoreszierenden Proteins.

Vermeiden Sie Zellen mit zu schwacher oder zu starker Expression, um die Zelle-zu-Zelle-Variabilität bei Fluoreszenzmessungen zu verringern. Verwenden Sie für die konfokale Mikroskopie ein 100x 1,3 numerische Apertur Öl-Objektiv und die Bleach-Funktion der Software, um lineare Spuren im Zellkern gezielt anzusteuern. Stellen Sie den Laser-Transmissionsprozentsatz auf 5 % ein, ohne andere Einstellungen zu verändern.

Danach eine Zelle in die Mitte des Feldes platzieren. Den Bereich von Interesse anklicken und mit der Maus eine Linie oder ein Rechteck im Kern mit einer Größe von etwa 50 mal vier Pixeln zeichnen. Dabei vermeiden, die Kernmembran oder Nukleoli zu berühren.

Klicken Sie dann auf die Bleach-Taste, um eine DNA-Schädigung zu induzieren. Hier sind die Unterschiede zwischen der maximalen Rekrutierung von GFP-53BP1 und GFP-NTH1 deutlich erkennbar. Für eine quantitative Fluoreszenzanalyse lebender Zellen mit dem konfokalen Mikroskop verwenden Sie eine 1x-Vergößerung und einen Argonlaser für GFP FITC.

Stellen Sie eine Auflösung von 512 x 512 Pixeln, eine Scan-Geschwindigkeit von fünf und die Nummer eins für einen Schnellscan oder zwei plus für eine Mittelung über mehrere Scans zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses ein. Nehmen Sie dann die Bilder auf. Zeichnen Sie die Bleach-ROI zur Schädigungsinduktion und wählen Sie anschließend das erfasste Untermenü „Zeitreihe“, stellen Sie die Anzahl auf 20 und die Zykusverzögerung auf 30 Sekunden ein.

Wählen Sie nach dem ersten Scan einmalig „Bleach“ aus und klicken Sie dann auf „Start B“. In diesem Fall wird das erste Bild unmittelbar vor der Schädigungsinduktion aufgenommen, gefolgt von der Aufnahme von 19 weiteren Bildern im Abstand von 30 Sekunden. Hier sehen Sie, dass GFP-NTH1 schnell und vorübergehend an Schadensstellen rekrutiert wird, während sich GFP-53BP1 langsamer ansammelt und an den Schadensstellen verbleibt. Einige Reparaturfaktoren können auf zyklusspezifische Weise an Schadensstellen rekrutiert werden.

Um Zellen in der G1-Phase für die Schädigungsinduktion zu identifizieren, werden unter einem inversen Mikroskop mit einem 10x-Objektiv und 10x-Augenlinsen Metaphase-Zellen identifiziert, die leicht abgehoben und rundlich geformt sind. Es werden Bilder aufgenommen, um die Position der Metaphase-Zellen auf der skalierten Deckglasunterlage zu dokumentieren. Nach drei bis vier Stunden wird bestätigt, dass die Zellteilung zu zwei Tochterzellen geführt hat, die an der dokumentierten Position für die Schädigungsinduktion bereitstehen.

Um Zellen in der SG2-Phase vorzubereiten, verwenden Sie ein Doppel-Thymidin-Block-Protokoll. Bestätigen Sie die Synchronisierungseffizienz durch DNA-Profilierung und/oder Nachweis von Rad51 an Schadensstellen. Bei Laserbeschädigung mit hoher Eingangsleistung wurden die Aggregation von CPD-UV-Schäden und der GFP-NTH1-DNA-Glykosylase, die spezifisch Basenschäden erkennt, deutlicher beobachtet als bei niedriger Eingangsleistung.

Außerdem wurden höhere Konzentrationen von XRCC1 und CtIP beobachtet, was auf eine erhöhte Anzahl an Einzel- und Doppelstrangbrüchen hinweist und somit darauf schließen lässt, dass komplexe DNS-Schäden induziert wurden. Wie hier gezeigt, führt die Variation der Laserleistung zu Veränderungen in der Schadenssignalisierung. PARP1 vermittelt die Poly-ADP-Ribosylierung oder PAR von Zielproteinen an Schadensstellen, die durch hohe Laserleistung deutlich, durch niedrige Laserleistung hingegen nur schwach induziert wird.

53BP1 wird zu Schadensstellen mit geringer, aber nicht zu solchen mit hoher Eingangsleistung rekrutiert. Interessanterweise wurde die Rekrutierung zu Schäden mit geringer Eingangsleistung durch das Vorhandensein einer zweiten Schadensstelle mit hoher Eingangsleistung im gleichen Zellkern unterdrückt. Diese Hemmung wurde durch den PARP-Inhibitor aufgehoben.

Umgekehrt verstärkte der Inhibitor von PARP, der PAR abbaut, das PAR-Signal und unterdrückte effektiv die Rekrutierung von 53BP1 selbst an Schadensstellen mit geringer Leistungszufuhr. Dies zeigt, dass die PARP-Signalübertragung – und nicht die Art des Schadens an sich – die Rekrutierung von 53BP1 bestimmt. Dies ist ein Beispiel dafür, wie eine Laser-Titration eine differenzielle Aktivierung von PARP1 aufzeigt, die die Menge und Komplexität der DNA-Schäden misst und die Zugänglichkeit der Schadensstelle steuert.

Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in etwa fünf Tagen durchgeführt werden, einschließlich Zellvorbereitung, Einrichten des Lasersystems, Induktion von DNA-Schäden, Bildgebung lebender oder immunsilenten Zellen sowie der Datenanalyse. Es kann länger dauern, wenn eine Zellsynchronisierung oder eine zeitaufwändige Analyse erforderlich ist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die Titration der Laserleistung im Laufe der Zeit abweichen kann, selbst bei demselben Lasersystem, insbesondere nach einer Neuausrichtung des Systems. Daher ist es wichtig, das Rekrutierungsmuster der Reparaturfaktoren regelmäßig zu überprüfen.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können Ergebnisse aus anderen Methoden zur DNA-Schädigung, wie beispielsweise die Analyse von Bestrahlung, chemischen Substanzen oder der Expression von Endonukleasen, durchgeführt und verglichen werden, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse nicht auf laserbedingte Artefakte zurückzuführen sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der DNA-Reparatur den Weg, um die Antwort auf DNA-Schäden im Hinblick auf nukleare Chromatinstrukturen zu untersuchen und neue Faktoren sowie Signalwege der DNA-Schadenserkennung, -verarbeitung und -signalgebung zu identifizieren.