Name: Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Lernen Sie Laser-Mikrobestrahlung zur Induktion einfacher und komplexer DNA-Schäden in vivo. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Analyse der DNA-Schadenserkennung und Reparaturfaktor-Rekrutierung in lebenden Zellen.

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Wir danken Dr. Akira Yasui in Tohoku University, Japan für das GFP-NTH1-Expressionsplasmid und Dr. Eros Lazzerini Denchi am Scripps Research Institute, La Jolla, Kalifornien für TRF2-YFP und EGFP-53BP11220-1711 Ausdruck Plasmide. Diese Arbeit wurde von der Air Force Office of Scientific Research (FA9550-04-1-0101) und der Beckman Laser Institute Inc. Foundation (M.W.B), der Ford Foundation Fellowship von der nationalen Akademie der Wissenschaften (für B.A.S) und NSF MCB-1615701 und CRCC unterstützt CRR-17-426665 (zu K. J.).

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Vorteile der Verwendung von Laser Microirradiation für die DDR-Forschung sind:
(1) Es ist möglich, verschiedene Arten induzieren Mengen DNA Beschädigung von einfachen Strangbrüche komplexe DNA-Schäden und zur Erkennung verschiedene Reparatur Faktoren bei der DNA-Schäden Websites durch Anpassung der Laser-Bestrahlung-Parameter. Es ist auch möglich, mehrere Male in den gleichen Zellkern schädigen um Trans -Effekte (siehe Abbildung 3) zu bewerten.
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In Vivo DNA-Schäden-Signalisierung ist nicht gut verstanden In Vivo, ist DNA komplexiert mit Histone und andere Faktoren in Form Chromatin Fasern. Regulierung der Chromatinstruktur ist von größter Bedeutung für die DNA-Stoffwechsel. Beispielsweise ist die Histon-Variante H2AX phosphoryliert durch Ataxie-Teleangiektasie mutiert (ATM) und anderen Kinasen folgende Doppel-Strang bricht (DSB) Induktion, und ist wichtig für DSB Schaden Signalverstärkung sowie eine Docking-Website für andere Faktoren. Verbreitung von Schäden Signal- und Reparatur Weg Wahl scheinen kritisch von lokalen Chromatinstruktur bei Schäden Seiten1beeinflusst werden. Eine Reihe von Chromatin umgestalten Faktoren, Histon Chaperone und Histon ändern Enzyme sind in der Tat rekrutiert, um Websites zu beschädigen und sind wichtig für effiziente DNA-Reparatur, die Bedeutung der Chromatin-Verordnung in der DDR und Reparatur2 , 3 , 4. Darüber hinaus Schäden Website clustering oder Neupositionierung wurde beobachtet in Hefe und Drosophila5,6,7,8, erinnert an Relokalisierung der gen-Loci in der subnukleare Fach gen Verordnung9,10zugeordnet. Neuere Studien in Maus und menschlichen Zellen gezeigt auch Mobilisierung der DSB-Seiten, welche Einflüsse Treue und Weg Wahl11,12reparieren. Dies wirft die Möglichkeit, dass die DDR/Reparatur auch eng mit nuklearen Architektur, höherer Ordnung Chromatin Organisation und Chromosom Dynamik im Zellkern verbunden werden kann. Daher ist es wichtig, entwickeln hochauflösende Methoden, die DDR zu studieren und Reparaturprozesse in der endogenen nuklearen Umfeld in einer live Zelle um kurz- und langfristigen Folgen von DNA-Schäden zu verstehen.
Entscheidende Rolle der PAR Polymerase (PARP) bei der Messung das Ausmaß und die Art des Schadens und Regulierung Protein Montage am Standort Schaden PARP1 ist ein DNA-Nick-Sensor schnell aktiviert durch DNA-Schäden, die in DNA Reparatur13eine entscheidende Rolle spielt. PARP1 wurde ursprünglich gedacht, um zusammen mit x-ray reparieren Cross Ergänzung 1 (XRCC1) base Excision Repair (BER) zu erleichtern, aber neuere Studien zeigen seine Rolle in anderen DNA-Reparatur Bahnen, darunter DSB-Reparatur-14. Aktiviert PARP1 Verwendungen Nicotinamid Adenin Dinucleotide (NAD+) als Substrat zu ADP-Ribosylate mehrere Zielproteine, einschließlich sich selbst. Dieses Enzym und andere Familienmitglieder haben viel Aufmerksamkeit in den letzten Jahren angezogen, wie PARP-Inhibitoren als viel versprechende Medikamente gegen Krebs entstanden sind. Obwohl PARP-Inhibitoren zunächst fand bei Brustkrebs-Gen (BRCA) wirksam-Brustkrebs-Zellen, mutiert es gibt jetzt eine Fülle von Beweisen für ihre Wirkungen in Mono- und Kombination Therapien zusammen mit DNA Beschädigung Agenten/Bestrahlung gegen ein breites Spektrum an Krebserkrankungen mit Mutationen nicht beschränkt auf BRCA15,16,17,18,19,20.
Auf der molekularen Ebene zeigte PARP Aktivierung spielen wichtige Rollen bei der Organisation der lokalen Chromatinstruktur Standorten Schaden. PAR-abhängigen Rekrutierung von Chromatin Modifikation Enzyme erleichtert die DSB-Reparatur und Diktat reparieren Weg Möglichkeiten, was die wichtige Gerüst Rolle PAR Modifikation an Schaden Standorten. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 , wir haben vor kurzem gezeigt, den Ausschluss von p53-bindendes Protein 1 (53BP1) vor Schäden durch PAR 32, bietet eine alternative Erklärung für 53BP1-abhängige Überaktivierung des nicht-homologe Endjoining (Seiten NHEJ) durch PARP-Inhibitor und Hervorhebung der Bedeutung von PARP in DSB reparieren Weg Wahl33,34. PARP1 Faktoren direkt PARylates und wirkt sich auf die Aktivität von mehreren DNA Reparatur auch14.
Mit Laser Microirradiation als Werkzeug zur DDR/Reparatur In Vivo Studie Laser Microirradiation, Sub-Mikrometer-Änderungen auf den einzelnen Chromosomen zu produzieren wurde zuerst 196935 beschrieben und detailliert in 198136geprüft. Einige Jahrzehnte später, Laser Microirradiation wurde gezeigt, dass DNA-Schäden an einer definierten Submikrometer-Region im Zellkern zu induzieren, und erwies sich als eine wertvolle Technik, Einstellung oder Modifikationen verschiedener Faktoren zu DNA-Läsionen in Vivo zu studieren 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. diese Methode ermöglicht die Erkennung von jene Faktoren, die keine ausgeprägte Bestrahlung-induzierte Brennpunkte (IRIF) bilden, um Schäden Seiten39,42. Es ist auch möglich, die räumlich-zeitliche Dynamik des Chromatin Strukturveränderungen an Schaden Standorten und in den Rest des Kerns zu untersuchen. Wir sorgfältig verglichen die DDRs induziert durch verschiedene Lasersysteme und Befugnisse, die Beziehung zwischen der Art von DNA-Schäden und die Microirradiation Bedingungen32,43,44, zu bewerten 45. Die aberrante Einstellungsmuster der 53BP1 und telomeric wiederholen Bindungsfaktor 2 (TRF2) beobachtet in den vorherigen Laser Schaden Studien, die die Grundlage für die wiederkehrende Sorge um die "physiologisch" Art der Laser-induzierten Schäden46 ,47,48,49. Wir fanden, dass jetzt diese wesentlichen Unterschiede erklärt werden könnte, durch differenzierte PARP Signalisierung, die Menge und Komplexität der induzierten Schäden32Lehren. Wir bestätigen, dass: 1) Laser-Microirradiated Zellen (auch nach hoher Eingangsleistung Bestrahlung) sind in einer Beschädigung Prüfpunkt Kontrolle-abhängigen Weise in Interphase verhaftet und lebensfähig bleiben (mindestens bis zu 48 h)32,50; und 2) Reparatur Faktor Rekrutierung/Modifikationen treu rekapitulieren die Behandlung mit herkömmlichen DNA-schädigenden Agenzien und DSB Induktion von Endonucleases32,39,42, beobachtet 44,50,51,52. Diese Ergebnisse unterstützen nachdrücklich die physiologische Relevanz Laser Schaden-induzierte zelluläre Reaktionen zu studieren.

<table><tbody><tr><td>Ti:Saphir NIR gepulster Femtosekundenlaser Mira-900</td><td>Coherent Inc.</td><td>Mira 900</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>63X/1.4 NA Objektiv</td><td>Zeiss</td><td>APOCHROMAT Ph3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kompakter Rotationstisch&nbsp;</td><td>Newport Corp</td><td>PR50PP</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler</td><td>Warner</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Heizungssystem</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>10918</td><td></td></tr><tr><td>Gas-Inkubationssystem</td><td>Ibidi&nbsp;</td><td>11920</td><td></td></tr><tr><td>Laserleistungs- und Energiemessgerät (RoHS)</td><td>Coherent</td><td>FieldMaxII-TOP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-R2 Digitale CCD-Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 META Laser-Scanning-Mikroskope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X/1.3 NA Zeiss Plan APO</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm Gitterschalen&nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD-D</td><td></td></tr><tr><td>PtK2 Nierenepithelzellen</td><td>ATCC</td><td>CCL 56&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>CO2-unabhängiges Medium</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>Fortgeschrittene MEM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12492-013</td><td>ergänzt mit L-Glutamin, 4% FBS</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Thymidin&nbsp;</td><td>&nbsp; SIGMA</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Serum ohne Medien&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (Opti-MEM I Reduziertes Serummedium)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cycolbutance Pyrimidin-Dimer (CPD) (Maus)</td><td>Kamiya Biomedical Company</td><td>MC-062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-XRCC1 (Maus)</td><td>Gene Tex Inc</td><td>GTX72311</td><td></td></tr><tr><td>Anti-53BP1 (Kaninchen)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-22760</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CtIP (Kaninchen)</td><td>Abcam</td><td>ab70163</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR-Polymere (Maus)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-SA216-0100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAR (Kaninchen)</td><td>Trevigen</td><td>4336-BPC-100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TRF2 (Maus)</td><td>Novus Biological&nbsp;</td><td>NB100-56506</td><td></td></tr><tr><td>Anti 6-4PP (Maus)</td><td>Kamiya Biomedical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad21 (Kaninchen)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (für die Kohäsin-Detektion)</td><td>erzeugt im Yokomori (KY) Labor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rad51 (Kaninchen)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8349</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ku70 (Maus)&</td><td>nbsp; Novus Biologicals</td><td>NB100-102</td><td></td></tr><tr><td>8-Oxiguanin&nbsp;</td><td>Trevigen, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-PARP1&nbsp; (Kaninchen)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>generiert im KY-Labor</td><td></td><td>ref 43</td></tr><tr><td>&nbsp; Anti-hCAPG (Kaninchen)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (für die Kondensatdetektion)</td><td>generiert in KY lab</td><td></td><td>ref 42</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>&nbsp; Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus Alexa Fluor 488 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>HiPerFect siRNA Transfektionsreagenz</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>GFP-SMC1 stabile Zelllinie &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>generiert in KY lab</td><td></td><td>ref 49&nbsp;</td></tr><tr><td>GFP-NEIL2 stabile Zelllinie</td>, <td>die im KY-Labor</td><td></td><td>ref 54</td></tr><tr><td>GFP-NTH1 erzeugt wurde, GFP-NTH1 stabile Zelllinie</td>, die <td>im KY-Labor</td><td></td><td>ref 32</td></tr><tr><td>GFP-SMC1 Plasmid</td><td>erzeugt im KY-Labor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-Ku Plasmid</td><td>erzeugt im KY-Labor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-MDC1 (Kaninchen)</td><td>&nbsp; Novus Biologicals</td><td>NB100&ndash; 395</td><td></td></tr><tr><td>Anti-gH2AX (Kaninchen)</td><td>&nbsp; Millipore</td><td>07&ndash; 164</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2-stabile Zelllinie</td>, <td>erzeugt im Berner Labor</td><td></td><td>ref 32</td></tr><tr><td>TRF2-YFP PtK2 stabile Zelllinie</td>, <td>erzeugt in Berns lab</td><td></td><td>ref 32</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PANG-Inhibitor</td><td>Trevigen</td><td>4680-096-03</td><td></td></tr><tr><td>DNA&ndash; PKcs-Hemmer&nbsp; NU7026&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N1537</td><td></td></tr><tr><td>ATM-Inhibitor KU55933</td><td>&nbsp; Calbiochem</td><td>118500</td><td></td></tr><tr><td>Olaparib&nbsp;</td><td>Apexbio Technology</td><td>A4154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>ELEKTRONENMIKROSKOPIE SCIENC MS</td><td>100503-916 (EA)</td><td></td></tr><tr><td>Menge Eins 1D-Analysesoftware Version 4.6.9</td><td>Bio-Rad</td><td>SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC&nbsp;</td><td>Bildanalyse-Programm</td></tr><tr><td>Excel</td>, <td>Microsoft</td><td></td>, <td>Tabellenkalkulationsprogramm</td></tr>, <tr><td>Triton X100</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td>, <td>Waschmittel</td></tr>, <tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) 10X ohne Calcium und Magnesium</td>, <td>Fisher</td><td>Scientific 14200166</td><td>auf 1X verdünnen;</td></tr></tbody></table>

laser microirradiation in vivo zellulären reaktionen auf einfache und komplexe dna-schäden zu studieren

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA-Schädigung induziert spezifische Signal- und Reparatur Reaktionen in der Zelle, die entscheidend für den Schutz der Integrität des Genoms ist. Laser Microirradiation wurde eine wertvolle experimentelles Werkzeug, das DNA-Schäden Antwort (DDR) in Vivozu untersuchen. Es ermöglicht hochauflösende einzellige Echtzeitanalyse von makromolekularen Dynamik in Reaktion auf Laser-induzierten Schäden beschränkt sich auf eine Submikrometer-Region im Zellkern. Jedoch wurden verschiedene Laser Bedingungen ohne Anerkennung der Unterschiede in der Art der Schäden induzierte verwendet. Infolgedessen ist die Art des Schadens oft nicht gut gekennzeichnet oder kontrolliert werden, verursacht die scheinbaren Widersprüche in der Einstellung oder Änderung Profile. Wir zeigten, dass verschiedene Bestrahlungsbedingungen (d.h., verschiedene Wellenlängen sowie verschiedene Eingabe Kräfte (Bestrahlungsstärke) eines Femtosekunden (fs) Nah-Infrarot (NIR) Lasers) verschiedene DDR und Reparatur Protein Baugruppen induziert. Dies spiegelt die Art von DNA-Schäden produziert. Dieses Protokoll beschreibt wie Titration der Eingangsleistung Laser ermöglicht Induktion unterschiedliche Mengen und Komplexität von DNA-Schäden, die durch den Nachweis von Base und Vernetzung Schäden, differenzielle Poly (ADP-Ribose) (PAR) Signalisierung, leicht überwacht werden kann und Bahn-spezifische Reparatur Faktor Baugruppen an Schaden Standorten. Nachdem die Schäden Bedingungen ermittelt wurden, ist es möglich, die Auswirkungen der verschiedenen Schäden Komplexität und Differenzial Schaden Signalisierung sowie Erschöpfung der vorgelagerten wird auf jeder Faktor von Interesse zu untersuchen.

Mit PtK2 Zellen EGFP-53BP11220-1711 oder TRF2-YFP stabil zum Ausdruck zu bringen, wurde Laser Eingangsleistung Titration durchgeführt, um die optimale Voraussetzung für ihre Rekrutierung (Abbildung 1)32bestimmen.
Bei hohen Input-Power-Laser Schaden die erhebliche Bündelung von CPD (Vernetzung Schäden durch ultraviolette (UV) Schäden in der Regel generiert) sowie GLP-NTH1 DNA-Glycosylase, die speziell der Grundschaden erkennt wurd...

Das Ziel dieses Protokolls ist zu beschreiben, wie Laser Microirradiation verwenden, um verschiedene Arten von DNA-Schäden, einschließlich der relativ einfachen Strangbrüche und komplexen Schäden an DNA-Schäden Signal- und Reparatur Faktor Montage an Schaden Standorten in-vivo Studie zu induzieren .

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Anwendung der Laser-Mikrobestrahlung zur Induktion verschiedener Arten von DNA-Schäden, einschließlich einfacher Strangbrüche und komplexer Schäden, zu beschreiben, um die Signalübertragung bei DNA-Schäden und die In-vivo-Assemblierung von Reparaturfaktoren zu untersuchen. In den 1960er und 1970er Jahren fokussierten wir einen Laserstrahl durch ein Mikroskop, das Sie hinter mir sehen können, und konnten dadurch eine kleine Region eines Chromosoms schädigen. Die Zelle teilte sich, überlebte, und wir konnten nicht verstehen, warum.Nun, 40 Jahre später nutzen wir diese Methode, um die DNA-Reparatur gezielt zu untersuchen, und das werden Sie heute sehen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der DNA-Reparatur zu beantworten, beispielsweise wie DNA-Schäden erkannt und verarbeitet werden und wie sich Schadenssignale in der Zelle ausbreiten. Die Laser-Mikrobestrahlung ermöglicht eine Echtzeit-Analyse mit hoher Auflösung an einzelnen Zellen hinsichtlich der Dynamik makromolekularer Prozesse als Reaktion auf DNA-Schäden, die auf einen Bereich von mehreren Mikrometern innerhalb des Zellkerns begrenzt sind.Es wurden j

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Laser werden häufig in Untersuchungen der zellulären Antwort auf DNA-Schädigung verwendet. Jedoch erzeugen sie Läsionen, deren Abstand, Frequenz und Kollisionen mit Replikationsgabeln werden selten charakterisiert. Hier beschreiben wir einen Ansatz, der die Bestimmung dieser Parameter mit Laser lokalisiert Interstrang- Vernetzungen ermöglicht.

Einzelmolekülanalyse von Laser Lokalisierte Psoralen Addukten

Laser Microirradiation ist ein nützliches Werkzeug für Studien zur DNA-Reparatur in lebenden Zellen. Ein methodischer Ansatz für die Nutzung der UVA Laser induzieren verschiedene DNA-Läsionen wird angezeigt. Wir haben eine Methode zur lokalen Microirradiation optimiert, die den normalen Zellzyklus unterhält; so fahren Sie bestrahlte Zellen durch Mitose.

Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

Konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie und Laser Mikro-Bestrahlung Angebot Werkzeuge für die Induktion von DNA-Schäden und die Reaktion der DNA-Reparatur-Proteine in ausgewählten Bereichen der Sub-atomaren Überwachung. Diese Technik hat deutlich erweiterte unsere Kenntnisse der Schaden-Erkennung, Signalisierung und Rekrutierung. Diese Handschrift zeigt diese Technologien, um Einzel- und Doppelzimmer Strang Pause Reparatur zu prüfen.

Anwendung von Mikro-Laserbestrahlung zur Prüfung von einzelnen und doppelt Strand Break Repair in Säugerzellen

DNA-Schäden reparieren Kinetik Studium erfordert ein System zur Läsionen an definierte Sub-atomaren Regionen zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zum Erstellen von lokalisierter Doppelstrang-Pausen mit einem konfokale Laserscanning-Mikroskop ausgestattet mit einem 405 nm-Laser und bieten automatisierte Verfahren zur Quantifizierung der Dynamik der Reparatur Faktoren bei dieser Läsionen.

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Methode zur effizienten Identifizierung von S-Phasen-Zellen für nachgelagerte Mikroskopiestudien, wie z. B. die Messung der Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen durch Lasermikrobestrahlung.

Laser-Mikrobestrahlung zur Untersuchung der DNA-Rekrutierung während der S-Phase

Wir beschreiben eine robuste Strategie Gen - Ersatz zu genetisch den Pilz Sauereien manipulieren Ustilago maydis. Dieses Protokoll wird erklärt, wie Deletionsmutanten zu erzeugen Infektion Phänotypen zu untersuchen. Es kann erweitert werden , um Gene in jeder gewünschten Weise zu modifizieren, beispielsweise durch eine Sequenz Hinzufügen eines fluoreszierenden Protein - Tag kodiert.

Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie

Gezielter DNA-Schaden kann durch Bindung eines DNA-schädigenden Wirkstoffs an ein Triplex-bildendes Oligonukleotid (TFO) erreicht werden. Unter Verwendung modifizierter TFOs können DNA-Schadens-spezifische Proteinassoziationen und DNA-Topologiemodifikationen in menschlichen Zellen durch die Verwendung von modifizierten Chromatin-Immunpräzipitationsassays und DNA-Supercoiling-Assays, die hierin beschrieben werden, untersucht werden.

Tools, um die Rolle der Architektur-Protein HMGB1 zur Untersuchung bei der Verarbeitung von Helix verzerrenden, ortsspezifische DNA-Quervernetzungen zwischen

Bestehende Methoden zur Modifikation von Pflanzen sind nur begrenzt anwendbar. Die hier vorgeschlagene neuartige Peptid-abgeleitete Technologie verspricht sowohl Einfachheit als auch Effizienz bei der Einführung von exogenen Proteinen oder Genen in die gewünschten intrazellulären Kompartimente intakter Pflanzen.

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