Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Das übergeordnete Ziel der Multi-Photonen-Zeitraffer-Bildgebung ist es, hochauflösende dreidimensionale Echtzeitbilder von wandernden Zellpopulationen aufzunehmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, wie z.B. die Kartierung von Migrationswegen verschiedener Zellpopulationen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie besteht darin, dass Multiphotonenlaser eine tiefere Gewebepenetration und eine geringere Phototoxizität aufweisen.

Dies erhöht die Einsetzbarkeit in dickeren Geweben und ermöglicht längere Zeiträume der Bildaufnahme. Um sich für die Embryonenentnahme zwischen 15:00 und 21:00 Uhr einzurichten, bauen Sie Zuchttanks zusammen und füllen Sie sie mit Umkehrosmose oder RO-Wasser.

Setze bis zu drei Weibchen und drei Männchen in gegenüberliegende Seiten des geteilten Beckens um. Entfernen Sie am nächsten Morgen die Trennwand, kurz nachdem das Licht im Vivarium eingeschaltet wurde. Lassen Sie die Paarung 20 Minuten lang ungestört oder bis eine ausreichende Anzahl von Embryonen produziert ist.

Die Embryonen befinden sich am Boden des Zuchtbeckens. Wenn Eier beobachtet werden, heben Sie den geschlitzten Innentank zusammen mit den Fischen heraus und legen Sie sie schnell in einen sauberen, festen Außentank, der mit RO-Wasser gefüllt ist. Verwenden Sie ein Eiauffangsieb, um die Eier aus dem äußeren Tank zu sammeln, und geben Sie die Eier in Petrischalen mit 30 Millilitern 1X Embryomedium.

Die gesammelten Eier bei 28,5 Grad Celsius ausbrüten. Bei transgenen Embryonen werden 24 Stunden nach der Befruchtung oder HPF die toten Eizellen entfernt und das Entwicklungsstadium der Embryonen beurteilt. Entnehmen Sie mit einer Pinzette die Chorionen von drei bis vier Embryonen, die GFP exprimieren.

Unter einem Präparierfluoreszenz-Stereomikroskop mit einem Standard-Bandpass-Anregungsfilter von 460 bis 490 Nanometern wird nach GFP-positiven Embryonen gesucht. Übertragen Sie diese Embryonen in eine separate Petrischale, die 30 Milliliter frisches 1X-Embryomedium enthält. Legen Sie die gescreenten und dechorionierten GFP-positiven Embryonen nach 20 HPF in eine 0,003%ige PTU-Lösung, um die Pigmentierung zu hemmen.

Vermeiden Sie einen früheren Beginn der Behandlung, da dies negative Auswirkungen auf die Entwicklung der Neuralleiste und des Neuroepithels haben kann. Geben Sie 0,4 Gramm LowMelt Agarose-Pulver in 20 ml 1x Embryomedium. Erhitzen Sie die Mischung ein bis zwei Minuten lang oder bis die Lösung klar ist und sich alle Partikel aufgelöst haben.

Aliquotieren Sie etwa 1 ml der Agaroselösung zur Lagerung in frische 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Um die offene Badkammer einzurichten, geben Sie eine kleine Menge Hochvakuumfett auf den Boden der offenen Badkammer. Setzen Sie einen kreisförmigen Glasdeckel auf den Sockel und schrauben Sie den Deckel der offenen Badkammer fest auf den Sockel.

Pipettieren Sie ca. 500-700 Mikroliter 2%ige Agaroselösung in die offene Badkammer, bis die Basis ca. 3/4s gefüllt ist. Warten Sie 30 Sekunden, damit die Agarose etwas abkühlen kann, ohne vollständig zu polymerisieren, und übertragen Sie anschließend einen einzelnen Embryo in die Mitte der Base. Verwenden Sie unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop eine 10-Mikroliter-Mikropipettenspitze, um den Embryo auszurichten, und positionieren Sie ihn in der Nähe des Bodens der Agarose, damit er nicht wegschwimmt, wenn das Embryomedium hinzugefügt wird.

Ein kritischer Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass der Embryo korrekt in der Agarose positioniert ist. In diesen Experimenten richten wir den Embryo seitlich aus, aber der Embryo kann auch so positioniert werden, dass er sich auf den dorsalen und ventralen Bereich konzentriert. Überwachen Sie den Embryo und positionieren Sie ihn neu, bis die Agarose ausgehärtet ist.

Verwenden Sie dann eine Transferpipette, um die zusammengesetzte offene Kammer vollständig mit Zeitraffer-Embryomedium zu füllen. Nachdem Sie das gesamte Setup gemäß dem Textprotokoll auf den Tisch des Mikroskops gelegt haben, verwenden Sie das Fünffachobjektiv, um den Embryo zu lokalisieren. Heben Sie dann den Tisch manuell in die höchste Position an und positionieren Sie den Embryo mit dem Feinfokus in der Mitte des Mikroskopbereichs.

Senken Sie den Tisch manuell ab und ändern Sie das Fünf-Zeit-Ziel in das 25-fache Wasserimmersionsziel. Heben Sie die Bühne vorsichtig an, um den Embryo wieder in den Fokus zu bringen. Klicken Sie in der Software auf den XYTZ-Modus, um mehrere Bilder gleichzeitig oder T-Intervalle in der XY-Ebene über eine Tiefe von Z zu erhalten.Verwenden Sie die Epifluoreszenz- oder Hellfeldansicht, um die Schärfentiefe im interessierenden Bereich zu ermitteln, der den Z-Stapel abgrenzt.

Bei diesen Experimenten ist der laterale Rand des Auges der Anfang des Z-Stapels. Wenn Sie hier fokussiert sind, klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche Start. Nachdem Sie sich auf die Mittellinie des Embryos fokussiert haben, d. h. auf das Ende des Z-Stapels, klicken Sie auf die Schaltfläche Ende.

Ein wichtiger Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass der Z-Schritt den Interessenbereich umfasst. In unserem Fall wollen wir die Breite des Auges von den lateralen bis zu den medialen Rändern erfassen. Klicken Sie auf das Menü, um die Aufnahmezeit und die Bildfrequenz anzupassen.

Für eine angemessene Rückgewinnung des Fluor4 und das Überleben des Embryos ist ein Verhältnis von mindestens eins bis drei zwischen der Z-Stapel-Erfassung bei eingeschalteter Laserleistung und der Erholungszeit bei ausgeschalteter Laserleistung zu berücksichtigen. Wenn die Zeit für die Embryogenesung angemessen ist, stellen Sie die Zeit zwischen den Z-Stapeln im dafür vorgesehenen Fenster ein. Legen Sie dann die Gesamtdauer des Experiments im entsprechenden Fenster fest.

Schalten Sie nun die Livebild-Einstellung ein, um letzte Anpassungen an den Lasereinstellungen vorzunehmen. Passen Sie die Schieberegler für Lasertransmission, Verstärkung und Offset in der Software an, um das Fluoreszenzbild zu optimieren. Passen Sie auch die Ausrichtung des Embryos nach Bedarf an, abhängig von der Länge des Experiments, dem erwarteten Wachstum des Embryos usw.

Stellen Sie sicher, dass der Interessenbereich während der gesamten Dauer des Experiments innerhalb des Rahmens bleibt. Schalten Sie während der Zeitrafferaufnahme die Epifluoreszenzlichtquelle aus, decken Sie den Tisch mit der Laserschutzbox ab, die zum Schutz vor Hintergrundlicht ausreicht, und drücken Sie dann auf Start. Betreten Sie die offene Badekammer durch die Schiebetüren an der Lasersicherheitsbox, um sie alle 8-12 Stunden mit Zeitraffer-Embryomedium zu befüllen.

Öffnen Sie nach der Bildaufnahme die Dateien in der Bildbearbeitungssoftware und markieren Sie die richtige Bildreihe. Wählen Sie in der Software das Prozessmenü, klicken Sie auf 3D-Dekonvolution und wenden Sie es an, um jeden Z-Stack zu dekonvolven. Importieren Sie einzelne tif-Dateien in eine Videoverarbeitungssoftware, wählen Sie dann alle tif-Dateien aus und ziehen Sie sie in den Videoeditor.

Passen Sie die Länge jedes Bildes innerhalb des Videos auf 0,1 Sekunden an. Exportieren Sie abschließend das Video als MOV- oder MP4-Datei. Mittels Multiphotonen-Fluoreszenzbildgebung sind hier die Migrationsmuster von kranialen Neuralleistenzellen zu sehen, aus denen die kranialen Gesichtsstrukturen und der vordere Augenabschnitt in transgenen sox10:EGFP- und foxd3:GFP-Zebrafischlinien hervorgehen.

Sox 10 positive Neuralleistenzellen zwischen 12 und 30 hpf wandern vom Rand des Neuralrohrs in die kraniale Gesichtsregion. Die Zellen aus dem Prosencephalon und dem Mesencephalon wandern dorsal und ventral zum sich entwickelnden Auge, um das periokulare Mesencin zu besiedeln. Wie hier angedeutet, bilden die sox10-positiven Zellen den frontalen Nasenfortsatz.

Neuralleistenzellen aus dem Rhombencephalon wandern nach ventral und bilden die Rachenbögen. Zeitrafferaufnahmen von foxd3-positiven Neuralleistenzellen zwischen 30 und 60 hpf zeigen, dass diese Zellen zwischen dem Sehbecher und dem Oberflächenektoderm und durch die durch den Pfeil markierte Augenfissur wanderten und um die Linse herum verschmolzen, die durch das Sternchen markiert ist und das Irisstroma bildet. Einmal gemeistert, kann diese Technik von Anfang bis Ende in vier Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Embryonen mit einem hohen Fluoreszenzanteil zu wählen. Die Einrichtung der Software kann anfangs eine Herausforderung sein, aber sobald die Parameter festgelegt sind, sind zusätzliche Änderungen in der Regel minimal. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Multiphotonen-Zeitraffermikroskopie verwenden können, um wandernde Zellen im Embryo abzubilden.