Name: Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Lernen Sie Multi-Photonen-Zeitrafferbildgebung zur Visualisierung der Neuralleisten-Zellmigration in Zebrafisch-Embryonen in Echtzeit. Diese Methode ermöglicht hochauflösende 3D-Aufnahmen mit geringerer Phototoxizität.

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Die Autoren danken Thomas Schilling für freundlicherweise gifting Tg (Sox10:eGFP) Fisch und Mary Halloran für freundlicherweise gifting Tg(Foxd3:GFP) Fisch.

Das hier beschriebene Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die humane Behandlung von Labortieren durchgeführt, die vom University of Michigan Committee on the Use and Care of Animals (UCUCA) erstellt wurden.
1. Embryonenentnahme für Zeitraffer-Bildgebung
<ol>
	<li>Zwischen 15 und 21 Uhr männliche und weibliche adulte Zebrafische Tg(sox10:EGFP) oder Tg(foxd3:GFP) in einem geteilten Aufzuchtbecken zur paarweisen Paarung aufstellen. 
	HINWEIS: Die Fische Tg(sox10:EGFP) und Tg(foxd3:GFP), freundliche Geschenke von Thomas Schilling bzw. Mary Halloran, wurden in den Casper-Hintergrund (roy -/-, perlmutt -/-) gekreuzt, um die Autofluoreszenz und die Interferenz mit der Pigmentierung zu verringern.
	<ol>
		<li>Bauen Sie das Zuchtbecken (geschlitztes Innenbecken + festes Außenbecken) zusammen und füllen Sie es mit Wasser aus der Umkehrosmoseanlage.</li>
		<li>Setzen Sie bis zu 3 Weibchen und 3 Männchen in gegenüberliegende Seiten des Beckens um, die durch eine Trennwand getrennt sind; bis zu 6 Fische können paarweise in einem einzigen Aufzuchtbecken gezüchtet werden.</li>
		<li>Entfernen Sie am nächsten Morgen die Trennwand, kurz nachdem das Licht im Vivarium eingeschaltet ist. 
		HINWEIS: In der vorliegenden Studie sind die Lichter in einem 14-Stunden-Zyklus (an um 9 Uhr) und 10-stündiger Dunkelheit (aus um 23 Uhr) eingeschaltet.</li>
		<li>Lassen Sie die Paarung 20 Minuten lang ungestört oder bis eine ausreichende Anzahl von Embryonen produziert ist; die Embryonen befinden sich am Boden des Zuchtbeckens. Wenn Eier beobachtet werden, heben Sie den geschlitzten Innentank zusammen mit den Fischen heraus und setzen Sie sie (Fisch und Innentank) schnell in einen sauberen, festen Außentank, der mit RO-Wasser gefüllt ist.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bereiten Sie ein Standard-1X-Embryomedium vor, indem Sie Folgendes pro 1 l RO-Wasser hinzufügen: 0,287 g (4,9 mM) NaCl, 0,127 g (0,17 mM) KCl, 0,048 g (0,33 mM) CaCl2,2H 2O, 0,04 g (0,33 mM) MgSO4 (wasserfrei). Rühren Sie die Lösung, bis sich die Salze vollständig aufgelöst haben.
	<ol>
		<li>Fügen Sie 100 μl 0,1 % Methylenblau als Fungizid hinzu. Fügen Sie 0,25 g Natriumbicarbonat hinzu, um den pH-Wert auf 7,75 einzustellen. Medium bei Raumtemperatur lagern.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Entnehmen Sie die Eier aus dem äußeren Tank mit einem Eiauffangsieb und geben Sie die Eier in Petrischalen (~50 Embryonen pro Schale), die 30 ml 1X Embryomedium enthalten. Die gesammelten Eier bei 28,5 °C ausbrüten.</li>
	<li>Vorbereitung des Embryos
	<ol>
		<li>Tg(sox10:EGFP)-Embryonen.
		<ol>
			<li>Bei Tg(sox10:EGFP)-Embryonen wird 12 h nach der Befruchtung (hpf) die toten Eizellen entnommen und das Entwicklungsstadium der Embryonen beurteilt. Screening auf GFP-positive Embryonen mit einem Präparierfluoreszenz-Stereomikroskop mit einem Standard-Bandpass-Anregungsfilter von 460-490 nm. Entfernen Sie mit einer Pinzette die Chorionen von 3-4 Embryonen, die GFP exprimieren, und übertragen Sie diese Embryonen in eine separate Petrischale, die 30 ml frisches 1X-Embryomedium enthält.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tg(foxd3:GFP) Embryonen.
		<ol>
			<li>Bei Tg(foxd3:GFP)-Embryonen bei 22-24 hpf die toten Eizellen entfernen und das Entwicklungsstadium der Embryonen beurteilen. Untersuchen Sie positive Embryonen mit einem Präparierfluoreszenz-Stereomikroskop mit einem Standard-Bandpass-Anregungsfilter von 460-490 nm. Entfernen Sie mit einer Pinzette die Chorionen von 3-4 Embryonen, die GFP exprimieren.</li>
			<li>Bereiten Sie 1000X Phenylthioharnstoff (PTU) Stammlösung vor, indem Sie 0,75 g (3%) PTU in 25 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) lösen. Aliquotieren Sie die Stammlösung und lagern Sie sie bei 4 °C. Geben Sie 30 μl 1000-fache PTU-Stammlösung (3 %) zu 30 ml 1-fachem Embryomedium, um eine 0,003 %ige PTU-Lösung zu erhalten.</li>
			<li>Legen Sie die gescreenten und dechorionierten GFP-positiven Embryonen in eine 0,003%ige PTU-Lösung, um die Pigmentierung zu hemmen. Beginnen Sie die Behandlung der Embryonen mit PTU nicht vor 20 hpf, da eine frühe Behandlung (bei <20 hpf) nachteilige Auswirkungen auf die Neuralleiste und die neuroepitheliale Entwicklung haben kann. 28</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Überwachen Sie die Embryonen vor der Durchführung des Zeitraffer-Experiments durch Live-Bildgebung mit einem Standard-Stereomikroskop in Abständen von 12 bis 24 Stunden in altersangepassten Vergleichen, um die Temperaturdrift zu kontrollieren.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Einbettung des Embryos für die Zeitraffer-Bildgebung
<ol>
	<li>Aufbereitung von Zeitraffer-Embryomedien
	<ol>
		<li>Bereiten Sie eine 0,4%ige Standard-Tricain-Stammlösung vor, indem Sie 0,004 g Tricain zu 100 ml RO-Wasser hinzufügen. Aliquot (~1 mL) der Stammlösung in frische 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen geben und bei -20 °C lagern.</li>
		<li>Bereiten Sie das Zeitraffer-Embryomedium (50 ml 1X Embryomedium, 0,016 % Tricain) vor, indem Sie 2 ml 0,4 % Tricainlösung zu 48 ml 1x Embryomedium hinzufügen. Wenn Sie Embryonen >22 hpf verwenden, geben Sie zusätzlich 50 μl 3%ige PTU-Stammlösung (Endkonzentration,003 % PTU) in das Embryomedium.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aufbereitung von 2 % Low-Melt-Agarose
	<ol>
		<li>Geben Sie 0,4 g niedrigschmelzendes Agarosepulver in 20 ml 1X Embryomedium. 1-2 min erhitzen oder bis die Lösung klar ist und alle Partikel aufgelöst sind. 
		HINWEIS: Eine Erhöhung des Anteils des Agarosegels verringert die Porosität der Matrix, was das Wachstum und die Entwicklung des Embryos physisch behindern kann. Daher kann die Agaroselösung auf 1,5 % gesenkt werden, um diese Effekte zu minimieren. Wenn der Anregungsstrahl jedoch während der Laserscanning-Mikroskopie stationär gehalten wird, kann es zu einer stärkeren Erwärmung kommen, die in einem logarithmischen Verhältnis mit der Zeit schnell zunimmt. In diesem Protokoll ist die Erwärmung aufgrund der Fluorophorabsorption stark auf die Fokusregion beschränkt. Somit könnte die Temperatur in dem interessierenden Bereich auf einen Wert ansteigen, der hoch genug ist (≥ 30 °C), um Agaroselösungen zu schmelzen, die in Prozentsätzen von weniger als 1,5 hergestellt wurden, wodurch der Embryo direkt dem Laser ausgesetzt wird oder Bedingungen ermöglicht werden, unter denen der Embryo aus der Fokusebene schwebt. Aus diesem Grund wird die Verwendung von Agaroselösungen unter 1,5 % nicht empfohlen.</li>
		<li>Aliquot (~1 ml) der Agaroselösung in frische 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen zur Lagerung. Überschüssige Agaroselösung in flüssiger Form auf einem Heizblock (60-70 °C) 2-3 Wochen lagern.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montage des Embryos
	<ol>
		<li>Um die offene Badkammer einzurichten, geben Sie eine kleine Menge Hochvakuumfett auf den Boden der offenen Badkammer. Legen Sie ein kreisförmiges Glasdeckglas auf den Boden und schrauben Sie die Oberseite der offenen Badkammer fest auf den Boden ( Abbildung 1A, B).</li>
		<li>Pipettieren (~500-700 μL) von 2%iger Agaroselösung (60-70 °C) in die offene Badkammer, bis die Basis zu ~3/4 gefüllt ist ( Abbildung 1C). Beachten Sie, dass die Temperatur der Lösung, sobald sich die Agaroselösung in der offenen Badkammer auf dem Labortisch befindet, um etwa 1 °C/s abnimmt.</li>
		<li>Warten Sie 30 s, bis die Agarose leicht abgekühlt ist (~30-40 °C), ohne vollständig zu polymerisieren, und übertragen Sie anschließend einen einzelnen Embryo in die Mitte der Base ( Abbildung 1D, E).</li>
		<li>Positionieren Sie den Embryo unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop mit einer 1-10-μl-Mikropipettenspitze und achten Sie darauf, dass der Embryo in der Nähe des Bodens der Agarose platziert wird, da der Embryo wegschwimmen kann, wenn er mit Embryomedium bedeckt ist, wenn er zu nahe an der Oberfläche der Agarose platziert wird. 
		HINWEIS: In den vorgestellten Videos (Videos 1-3) sind die Embryonen seitlich ausgerichtet, aber je nach Interessengebiet können die Embryonen ventral oder dorsal ausgerichtet sein.</li>
		<li>Überwachen Sie den Embryo und positionieren Sie ihn neu, bis die Agarose fest geworden ist. Sobald die Agarose ausgehärtet ist, verwenden Sie eine Transferpipette, um die zusammengesetzte offene Kammer vollständig mit Zeitraffer-Embryomedien zu füllen ( Abbildung 1F).</li>
		<li>Platzieren Sie die offene Badkammer in der Schnellwechselplattform, die auf den Tischadapter passt ( Abbildung 1G). Platzieren Sie den gesamten Aufbau (Embryo, offene Badkammer, Schnellwechselplattform und Tischadapter) auf dem Tisch des Mikroskops direkt über dem Kondensor ( Abbildung 1H).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mikroskop-Setup für Zeitraffer-Bildgebung
<ol>
	<li>Bestimmen der Lasereinstellungen
	<ol>
		<li>Bestimmung der zu verwendenden Laserwellenlänge. Verwenden Sie eine Wellenlänge, die doppelt so groß ist wie die Anregungswellenlänge des interessierenden Fluorophors (z. B. Wellenlänge zwischen 880 und 940 nm für GFP). 
		HINWEIS: In der vorliegenden Studie lag die Wellenlängeneinstellung für GFP zwischen 880 und 940 nm. Je höher die Wellenlänge, desto geringer ist die Ausgangsleistung des Lasers.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Lasertransmission. Ein hoher Prozentsatz der Laserübertragung tötet den Embryo, verwenden Sie die niedrigste Transmissionsstufe (empfohlen). Für 24 bis 48 Stunden Zeitrafferstudien, wie hier vorgestellt, halten Zeitrafferstudien, wie sie hier vorgestellt werden, die Übertragung unter 5%.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Mikroskop-Detektionssysteme und stellen Sie sicher, dass die richtigen Filter für das Fluorophor vorhanden sind. 
		HINWEIS: Für Multiphotonenmikroskope gibt es mehrere Detektionssysteme mit unterschiedlichen Empfindlichkeiten für die emittierte Fluoreszenz. Im Allgemeinen hat ein internes Detektionssystem eine geringere Empfindlichkeit als ein externes Detektionssystem. Für transgene Linien mit hoher GFP-Expression ist das interne Nachweissystem ausreichend. Für transgene Linien mit geringer GFP-Expression oder mit anderen Fluorophoren (z. B. rot fluoreszierendes Protein) kann ein externes Detektionssystem erforderlich sein, um den Prozentsatz der Lasertransmission auf einem vernünftigen Niveau zu halten. Unabhängig vom verwendeten Nachweissystem müssen die richtigen Filter für das Fluorophor vorhanden sein.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Anpassen der Softwareeinstellungen am Multiphotonenmikroskop
	<ol>
		<li>Lokalisieren Sie den Embryo mit dem 5X-Objektiv. Heben Sie den Tisch manuell in die höchste Position und positionieren Sie den Embryo mit dem Feinfokus in der Mitte des Mikroskopbereichs.</li>
		<li>Senken Sie den Tisch manuell ab und tauschen Sie das 5X-Objektiv gegen das 25X-Wasserimmersionsobjektiv (numerische Apertur NA, 0,95) aus. Heben Sie die Bühne vorsichtig an, um den Embryo wieder in den Fokus zu bringen.</li>
		<li>Klicken Sie in der Software auf den Modus "xyzt", um mehrere Bilder in Zeitintervallen (t) in der x-y-Ebene über eine Tiefe von "z" zu erhalten. Verwenden Sie die Epifluoreszenz- oder Hellfeldansicht, um die Tiefenschärfe im interessierenden Bereich zu ermitteln, der den Z-Stapel abgrenzt.
		<ol>
			<li>Klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche "Start"; für diese Experimente war der seitliche Rand des Auges der Anfang des Z-Stapels. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Ende"; Die Mittellinie des Embryos war das Ende des Z-Stapels. 
			HINWEIS: Die Schrittweite betrug 0,3-0,6 μm und es gab insgesamt ~200 Schritte für eine Z-Stapelgröße von 60 bis 120 μm).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Klicken Sie auf das Menü, um die Aufnahmezeit und die Bildfrequenz anzupassen. Für das derzeitige System sind für ~200 Schritte ca. 5 Minuten für jede Z-Stack-Erfassung erforderlich. Für eine angemessene Wiederherstellung des Fluorophors und das Überleben des Embryos ist ein Verhältnis von mindestens 1:3 zwischen der Z-Stapel-Erfassung (Lasereinschaltung) und der Erholungszeit (Laserausschaltung) zu berücksichtigen. 
		HINWEIS: Z-Stacks werden beispielsweise alle 20 Minuten erfasst, wobei 5 Minuten die Z-Stack-Erfassung und 15 Minuten die Wiederherstellung erfolgen. Für dieses Protokoll können größere Z-Stacks erhalten werden, aber die Zeit zwischen den Z-Stack-Aufnahmen würde angemessen verlängert, was zu weniger Bildern über den Zeitrafferverlauf führt.
		<ol>
			<li>Wenn die Zeit für die Embryogenesung angemessen ist, stellen Sie die Zeit zwischen den Z-Stapeln im dafür vorgesehenen Fenster ein. Legen Sie die Gesamtdauer des Experiments im entsprechenden Fenster fest.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Abschließende Software-, Laser- und Embryo-Anpassungen.
		<ol>
			<li>Aktivieren Sie die Livebild-Einstellung, um letzte Anpassungen an den Lasereinstellungen vorzunehmen. Passen Sie die Schieberegler für die Lasertransmission (siehe 3.1.2), die Verstärkung und den Versatz in der Software an, um das Fluoreszenzbild zu optimieren. Passen Sie auch die Ausrichtung des Embryos nach Bedarf an, abhängig von der Länge des Experiments, dem erwarteten Wachstum des Embryos usw. Stellen Sie sicher, dass der Interessenbereich während der gesamten Dauer des Experiments innerhalb des Rahmens bleibt.</li>
			<li>Schalten Sie die Epifluoreszenzlichtquelle aus, da sie während der Zeitrafferaufnahme nicht mehr benötigt wird. Decken Sie die Bühne mit der Laser-Sicherheitsbox ab ( Abbildung 1I). Bei Verwendung des internen Detektionssystems ist die Laserschutzbox ausreichend zum Schutz vor Hintergrundlicht. Drücken Sie auf "Start". 
			HINWEIS: Bei empfindlicheren externen Erkennungssystemen blockiert die Laserschutzbox jedoch nicht genügend Hintergrundlicht, und es sind zusätzliche Abdeckungen erforderlich, um eine Unterbrechung der Bildaufnahme zu verhindern.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Während der Zeitrafferaufnahme
<ol>
	<li>Füllen Sie die offene Badkammer alle 8-12 Stunden (mindestens 2 Mal pro Tag) während der Zeitrafferaufnahme durch die Schiebetüren an der Lasersicherheitsbox mit Zeitraffer-Embryomedien auf ( Abbildung 1I).</li>
	<li>Vergewissern Sie sich vor dem Öffnen der Türen der Laserschutzbox, dass das Mikroskop nicht aktiv ein Bild aufnimmt. 
	HINWEIS: Die Verwendung von Heizungen und Umlaufmediensystemen ist für Zeitraffer-Bildgebungsexperimente mit einer Dauer von 24 bis 48 Stunden nicht erforderlich. In der Tat sind die Temperaturen sowohl der Tisch- als auch der Inline-Heizgeräte schwer zu kontrollieren, und während der Bildaufnahme zeigt der Embryo eine angemessene Entwicklungsrate in einem Temperaturbereich von 25-28 °C. Darüber hinaus neigen zirkulierende Mediensysteme dazu, überzulaufen und die Anlage möglicherweise zu beschädigen. Daher werden alle Embryonen nach der Entnahme routinemäßig inszeniert.</li>
</ol>
5. Verarbeitung nach der Erfassung
<ol>
	<li>Klicken Sie in der Software auf das Menü "Datei" und wählen Sie "Speichern".</li>
	<li>Öffnen Sie die Datei in einer Bildbearbeitungssoftware (siehe Materialtabelle). Markieren Sie die richtige Bildserie. Wählen Sie in der Software das Menü "Prozess". Klicken Sie auf 3D-Entfaltung und "Anwenden", um jeden Z-Stack zu entfalten. 
	HINWEIS: Die Datei ist groß; Daher kann dieser Schritt viele Stunden dauern.</li>
	<li>Klicken Sie in der Software im Menü "Prozess" auf "Maximale Projektion". Klicken Sie auf "Übernehmen", um die maximale Projektion zu starten und 1 Bild pro Z-Stack zu erzeugen. Exportieren Sie jede maximal projizierte Datei (1 Bild pro Z-Stapel) als TIFF-Datei.</li>
	<li>Importieren Sie einzelne TIFF-Dateien in eine Videoverarbeitungssoftware. Wählen Sie alle TIFF-Dateien aus und ziehen Sie sie in den Videoeditor. Passen Sie die Länge jedes Bildes innerhalb des Videos auf 0,1 s an. Exportieren Sie Videos als MOV- oder MP4-Datei.</li>
</ol>

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</ol>

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Eye Institute der National Institutes of Health (K08EY022912-01) und Vision Forschung Core (P30 EY007003) finanziell unterstützt.

Multi-Photonen-Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die in Vivo Verfolgung von Transienten und wandernden Zellpopulationen. Diese leistungsstarke Technik kann verwendet werden, um embryonale Prozesse in Echtzeit zu studieren, und in der vorliegenden Studie, die Ergebnisse dieser Methode erweitert das aktuelle Wissen der Neuralleiste Zelle Migration und Entwicklung. Time-Lapse bildgebende Studien nutzen in der Regel konfokale Laser-scanning-Mikroskopie. 29 , 30</su...

Angeborene Augenkrankheiten können dazu führen, dass Blindheit im Kindesalter und sind häufig durch Anomalien der kranialen Neuralleiste. Zellen der Neuralleiste sind vorübergehende Stammzellen, die aus dem Neuralrohr entstehen und bilden zahlreiche Gewebe im gesamten Körper. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 Zellen der Neuralleiste, Prosencephalon und Mittelhirnes, abgeleitet ergeben sich die Knochen und Knorpel des Mittelgesichts und frontalen Regionen, und die Iris, Hornhaut, trabekuläre Geflecht und Sklera im vorderen Bereich des Auges. 4 , 6 , 7 , 8 Neuralleiste Zellen aus Rhombencephalon Form, die den Rachen Bögen, Kiefer und kardiale Ausflusstrakt. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 Studien haben die Beiträge von der Neuralleiste, okuläre und Periorbitalregion Entwicklung hervorgehoben, betonend, wie wichtig dieser Zellen im vertebrate Augenentwicklung. In der Tat, Störung der Neuralleiste Zellwanderung und Differenzierung führen zu okuläre und kraniofaziale Anomalien wie in Axenfeld-Rieger-Syndrom und Peters-Plus-Syndrom festgestellt. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 so, wird ein umfassendes Verständnis von Migration, Proliferation und Differenzierung dieser Zellen der Neuralleiste Einblick in die Komplexität der zugrunde liegenden angeborene Augenkrankheiten, zu schaffen.
Der Zebrabärbling ist ein leistungsfähiges Modellorganismus für okuläre Entwicklung zu studieren, wie die Strukturen des Auges Zebrafisch Pendants Säugetier-ähneln und viele Gene evolutionär zwischen Zebrafisch und Säugetiere konserviert sind. 18 , 19 , Darüber hinaus sind 20 Zebrafisch-Embryonen transparent und ovipar, erleichtert die Visualisierung der Augenentwicklung in Echtzeit.
Erweiterung auf zuvor veröffentlichte Arbeit,6,7,20 das wandernde Muster der Zellen der Neuralleiste wurde beschrieben mit Multi-Photonen Fluoreszenz Zeitraffer imaging in transgenen Zebrafisch Zeilen beschriftet mit grün fluoreszierendes Protein (GFP) von SRY (Geschlecht-Bestimmung der Region Y) transcriptional kontrolliert-Box 10 (sox10) oder Forkhead-Box-D3 (foxd3) gen regulatorischen Regionen. 21 , 22 , 23 , 24. Zeitraffer Multi-Photonen-Fluoreszenz-Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik, die die fortschrittliche optische Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langen Wellenlänge Multi-Photonen Fluoreszenzanregung hochauflösende, dreidimensionale Aufnahmen der Proben mit dem Stichwort Fluorophore kombiniert. 25 , 26 , 27 die Verwendung von Multi-Photonen-Laser hat deutliche Vorteile gegenüber standard konfokalen Mikroskopie, einschließlich erhöhte Gewebe eindringen und verminderte Fluorophore bleichen.
Mit dieser Methode wurden zwei verschiedene Populationen von Zellen der Neuralleiste unterschiedlicher Zeitpunkt der Migration und wandernde Wege Neuralleiste diskriminierte, nämlich foxd3-positiven Zellen in der Periorbitalregion Mesenchym und entwickelnde Auge und Neuralleiste sox10-positiven Zellen in der kraniofazialen Mesenchym. Mit dieser Methode wird ein Konzept für die Migration von okulären und kraniofaziale Neuralleiste Migration im Zebrafisch visualisieren eingeführt, macht es einfach, regulierten Neuralleiste Migration in Echtzeit während der Entwicklung zu beobachten.
Dieses Protokoll enthält Informationen zur Erzeugung von Zeitraffer-Videos während der frühen Augenentwicklung in Tg (Sox10:EGFP) und transgenen Zebrafisch Tg (Foxd3:GFP), als Beispiel. Dieses Protokoll kann weiter für die hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Visualisierung der frühen Entwicklung der okulären und kraniofaziale Struktur abgeleitet aus Zellen der Neuralleiste im Zebrafisch angewendet werden. Darüber hinaus kann diese Methode für die Darstellung der Entwicklung der anderen Gewebe und Organe im Zebrafisch und anderen Tiermodellen weiter angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Zuchtbecken mit Trennwänden</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>Kreuzungsbecken Set (1,0 Liter) Polycarbonat klar mit Deckel und Einsatz</td></tr><tr><td>M205 FA Kombi-Scope</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td>Stereofluoreszenzmikroskop - FusionOptics und TripleBeam</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Millipore (EMD)</td><td>7760-5KG</td><td>Doppelter PE-Sack. CAS-Nr. 7647-14-5, EG-Nummer 231-598-3</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid-Millipore</td><td>(EMD)</td><td>1049380500</td><td>Kaliumchlorid 99.999 suprapur. CAS-Nr. 7447-40-7, EG-Nummer 231-211-8.</td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Poly-Flasche; 500 g. CAS-Nr. 10035-04-8</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat (wasserfrei)</td><td>Millipore (EMD)</td><td>MX0075-1</td><td>Poly-Flasche; 500 g. CAS-Nr. 7487-88-9, EG-Nummer 231-298-2</td></tr><tr><td>Methylenblau-Millipore</td><td>(EMD)</td><td>284-12</td><td>Glasflasche; 25 g. Pulver, zertifizierter biologischer Fleck</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat-Millipore</td><td>(EMD)</td><td>SX0320-1</td><td>Polyflasche; 500 g. Pulver, GR ACS. CAS-Nr. 144-55-8, EG-Nummer 205-633-8</td></tr><tr><td>N-Phenylthioharnstoff</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>>98%. CAS-Nummer 103-85-5, EG-Nummer 203-151-2</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma</td><td>D8418-500ML</td><td>Molekularbiologische Qualität. CAS-Nummer 67-68-5, EG-Nummer 200-664-3</td></tr><tr><td>Tricain-Methansulfonat</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS222</td><td>Tricaine-S</td></tr><tr><td>Low-Melt Agarose</td><td>ISC Bioexpress</td><td>E-3112-25</td><td>GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose, 25 g</td></tr><tr><td>Offene Badkammer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40HP</td><td>High Profile</td></tr><tr><td>Glasdeckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102</td><td>Circle Deckglas.</td></tr><tr><td>Hochvakuumfett</td> mit 25 mm Durchmesser <td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5C</td><td>2,0-Pfund-Rohr. DOW CORNING CORPORATION 1658832</td></tr><tr><td>Schnellwechselplattform</td><td>Warner Instruments</td><td>QE-1</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>Tischadapter</td><td>Warner</td><td>Instruments SA-20LZ-AL</td><td>16,5 x 10 cm</td></tr><tr><td>TC SP5 MP Multiphotonenmikroskop</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee Ti-Saphir Laser</td><td>SpectraPhysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser Safety Box</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)&nbsp; Software</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS 6 Version 13.0 x64 Software</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMovie Version 10.1.4 Software</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multi-photonen-time lapse imaging entwicklung in echtzeit zu visualisieren: visualisierung der migration neuralleisten-zellen in den zebrafish embryos

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Angeborene Auge und kraniofaziale Anomalien reflektieren Störungen in der Neuralleiste, eine vorübergehende Bevölkerung von wandernden Stammzellen, die Anlass zu zahlreichen Zelltypen im ganzen Körper. Verständnis der Biologie der Neuralleiste beschränkt wurde, spiegelt einen Mangel an genetisch gefügig Modelle, die studierte in Vivo und in Echtzeit. Zebrafisch ist ein besonders wichtig Entwicklungs Modell für das Studium wandernde Zellenbevölkerungen, wie der Neuralleiste. Um Neuralleisten-Migration in der dritten Auge zu untersuchen, wurde eine Kombination der erweiterten optischen Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langwelligen Multi-Photonen Fluoreszenzanregung implementiert, um hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Videos des dritten Auges in den transgenen Zebrafish Embryos, nämlich Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP), zu erfassen wie sox10 und foxd3 , in zahlreichen Tiermodellen gezeigt haben zu frühen Neuralleiste Differenzierung regulieren und wahrscheinlich Marker für Zellen der Neuralleiste darstellen. Multi-Photonen Zeitraffer Bildgebung wurde verwendet, um das Verhalten und die Migrationsmuster zwei Neuralleiste Zellpopulationen zur frühen Augenentwicklung zu erkennen. Dieses Protokoll enthält Informationen zur Erzeugung von Zeitraffer-Videos während der Zebrafisch Neuralleiste Migration als Beispiel und kann weiter angewendet werden, um die frühe Entwicklung von vielen Strukturen in dem Zebrafisch und sonstige Modellorganismen zu visualisieren.

Time-Lapse Multi-Photonen-Fluoreszenz-Bildgebung erzeugt eine Reihe von Videos, die die Migrationsmuster der kranialen Neuralleiste Zellen aufgedeckt, die zu der kraniofazialen Strukturen und vorderen Segments des Auges in der Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP) Zebrafisch Linien führen. Als Beispiel Wandern sox10 -positive Neuralleiste Zellen zwischen 12 und 30 hpf vom Rand des Neuralrohrs in der kraniofazialen Region (Video 1, <strong class="x...

Eine Kombination der erweiterten optischen Techniken der Laser-scanning-Mikroskopie mit langen Wellenlänge Multi-Photonen Fluoreszenzanregung wurde implementiert, um hochauflösende, dreidimensionale, Echtzeit-Bildgebung der Neuralleiste Migration mit Tg (Sox10:EGFP) und Tg (Foxd3:GFP) Zebrafish Embryos zu erfassen.

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Das übergeordnete Ziel der Mehrphotonen-Zeitraffer-Bildgebung besteht darin, hochauflösende dreidimensionale Echtzeitbilder von wandernden Zellpopulationen aufzuzeichnen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise die Kartierung der Migrationswege unterschiedlicher Zellpopulationen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie liegt darin, dass Mehrphotonenlaser eine tiefere Gewebedurchdringung und eine verringerte Phototoxizität aufweisen.Dies erhöht die Anwendbarkeit bei dickeren Geweben und ermöglicht längere Bildakquisitionszeiträume. Um die Sammlung von Embryonen zwischen 15:00 und 21:00 Uhr vorzubereiten, stellen Sie Zuchtbehälter bereit und füllen Sie diese mit umgekehrt osmotischem Wasser (RO-Wasser).Überführen Sie bis zu drei Weibchen und drei Männchen auf gegenüberliegende Seiten des geteilten Beckens. Am nächsten Morgen entfernen Sie den Trennsteg kurz nach dem Einschalten des Lichts im Vivarium. Lassen Sie eine ungestörte Paarung für 20 Minuten oder bis eine ausreichende Anzahl von Embryonen erzeugt wurde, stattfinden.Die Embryonen befinden sich am Boden des Zuchtbehälters. Sob

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Protokoll beschreibt Abbildung von einzelnen Neuronen oder Neuralleistenzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode wird verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen und Aktin-Lokalisierung mittels Fluoreszenz konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie zu untersuchen.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

In diesem Video werden Techniken für multicolor konfokalen Zeitraffer-Imaging-und Zielzelle Ablation zur Verfügung gestellt. Zeitraffer-Imaging wird verwendet, um das Verhalten der verschiedenen Zelltypen des Interesses zu...

Multicolor Zeitraffer-Imaging transgener Zebrafische: Visualisierung von Retinal Stammzellen durch gezielte Nervenzellen Ablation Activated

Die vorliegende Video zeigt eine Methode, die nutzt die Kombination von Elektroporation und konfokale Mikroskopie, um Live-Aufnahmen zu den einzelnen neuronalen Vorläuferzellen im sich entwickelnden Zebrafisch Vorderhirn führen.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Quelle: Williams, A. L., et al. Multi-Photonen-Zeitraffer-Bildgebung zur Visualisierung der Entwicklung in Echtzeit: Visualisierung von wandernden Neuralleistenzellen in Zebrafischembryonen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt ein Multi-Photonen-Zeitraffer-Bildgebungsprotokoll, um die Migration von Neuralleistenzellen in einem Zebrafischembryo in Echtzeit mit hoher Auflösung zu visualisieren.

Visualisierung der Migration von Neuralleistenzellen in einem Zebrafischembryo mit Hilfe von Multiphotonen-Zeitraffer-Bildgebung

Visualisierung von experimentellen Daten ist zu einem wichtigen Element in Präsentation der Ergebnisse für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Generation von Live-Zeitraffer-Aufnahme von wachsenden Embryos trägt zu einer besseren Präsentation und Verständnis für komplexe Entwicklungsprozesse. Dieses Protokoll ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Zellmarkierung über der Photo kaede Protein im Zebrafisch.

Visualisierung von Craniofacial Entwicklung in den sox10: kaede transgener Zebrafische Zeile mit Zeitraffer-konfokale Mikroskopie

Zeitraffer-konfokale Bildgebung ist eine leistungsstarke Technik zur Charakterisierung der embryonalen Entwicklung. Hier beschreiben wir die Methodik und zu charakterisieren kraniofazialen Morphogenese in Wildtyp-als auch PDGFRA, Smad5 und SMO mutierten Embryonen.

Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

Hier präsentieren wir eine vielseitige Einbettungsmethode, die die Langzeit-Zeitraffer-Bildgebung der hinteren Körperentwicklung von lebenden Zebrafischembryonen ermöglicht, ohne die normale Entwicklung zu stören.

Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung

In vivo Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die zellulären Mechanismen zugrunde liegenden Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Technik zur Verwendung von Zeitraffer-Konfokalmikroskopie, um eine große Anzahl von mehrfarbigen Brainbow-markierten Zellen in Echtzeit innerhalb des sich entwickelnden Zebrafischnervensystems zu visualisieren.

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur In-toto-Markierung und mehrdimensionalen Bildgebung der frühen Augenentwicklung von Zebrafischen. Wir beschreiben die Markierung, Einbettung und vierdimensionale (4D) Bildgebung mit hilfe der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und Überlegungen zur Optimierung der Erfassung von Datensätzen zur Sezierung von Mechanismen der optischen Cup-Morphogenese.

4-dimensionale Bildgebung der Zebrafisch-Optikbecher-Morphogenese

Hier wird ein Protokoll für die Zeitrafferbildgebung der Augenmorphogenese mit einem handelsüblichen Lightsheet-Mikroskop und einer Bildverarbeitungs-Workstation zur Analyse der resultierenden Daten bereitgestellt. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für die Anästhesie des Embryos, die Einbettung in Agarose mit niedriger Schmelztemperatur, die Suspension in der Bildgebungskammer, die Einrichtung der Bildgebungsparameter und schließlich die Analyse der Bilddaten mithilfe von...

Visualisierung der Augenmorphogenese mittels Lightsheet-Mikroskopie mittels rx3:GFP Transgener Zebrafische

Wir demonstrieren eine Methode, die die Vorteile der schnellen konfokalen Rastermikroskopie nutzt, um Live-Bildgebung von Mikrogliazellen im sich entwickelnden optischen Tectum des Zebrafisches durchzuführen und so die Dynamik dieser Zellen in vivo zu analysieren.

Live-Bildgebung und Charakterisierung der Mikroglia-Dynamik im Zebrafischembryo

Lernen Sie Multi-Photonen-Zeitrafferbildgebung zur Visualisierung der Neuralleisten-Zellmigration in Zebrafisch-Embryonen in Echtzeit. Diese Methode ermöglicht hochauflösende 3D-Aufnahmen mit geringerer Phototoxizität.

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos (Video) | JoVE Journal

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

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