Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo

Das übergeordnete Ziel dieser Assays ist die Quantifizierung der Monozyten-Chemotaxis in vitro in Echtzeit und die Verfolgung der Lymphozytenmigration in vivo. Die In-vitro-Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, z. B. welche Auswirkungen Serumfaktoren auf die Chemotaxis von Immunzellen haben. Der Hauptvorteil der In-vitro-Technik besteht darin, dass sie quantitative und Multiplex-Messungen in Echtzeit ermöglicht.

Die in vivo-Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, wie bestimmte Zelltypen innerhalb eines Empfängertieres wandern. Die In-vivo-Technik ist besonders nützlich für die quantitative Beurteilung der Migration mehrerer Zelltypen innerhalb desselben Tieres. Vor Beginn des Experiments werden THP-1-Zellen in einer 35-Millimeter-Zellkulturschale in vollständigem Medium bei 37 Grad Celsius 30 Minuten lang mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert

Während die Zellen inkubieren, geben Sie 750 Mikroliter HBSS, gepuffert mit 25 Millimolar HEPES und 0,1 % BSA, in die Hintergrund- und Positivkontrollvertiefungen einer 24-Well-Platte. Geben Sie die entsprechende Konzentration von MCP-1 in mit BSA versetztem Wasser in die Versuchs- und Positivkontrollbrunnen. Und setzen Sie poröse Einsätze in jede Vertiefung ein und achten Sie darauf, dass die Laschen der Einsätze mit den Kerben der Platte ausgerichtet sind.

Es ist wichtig, nach dem Einsetzen der Einsätze alle Blasen aus den unteren Vertiefungen zu entfernen, da Blasen die Fluoreszenzmessungen beeinträchtigen. Am Ende der Inkubation werden die markierten Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt, um sie durch Zentrifugation zu entnehmen. Und überprüfen Sie das resultierende Pellet visuell, um die Aufnahme des Farbstoffs zu bestätigen.

Anschließend wird der Überstand vorsichtig vakuumiert und die Zellen in serumfreiem RPMI-1640-Medium, das mit 25 millimolaren HEPES versetzt wurde, unter denselben Zentrifugenbedingungen gewaschen. Resuspendieren Sie das Pellet in einem frischen serumfreien Medium mit HEPES zum Zählen. Und stellen Sie das Volumen auf eine Endkonzentration von eins bis 1,5 mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter ein.

Geben Sie 250 Mikroliter Zellen in die obere Kammer jeder Vertiefung und legen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen Plattenleser. Erfassen Sie dann Fluoreszenzmessungen der unteren Kammern in Abständen von ein bis drei Minuten bei den entsprechenden Fluoreszenzanregungs- und Emissionswellenlängen für den Farbstoff. Um Spenderzellen für ihren adoptiven Transfer vorzubereiten, entnehmen Sie zunächst die gesamte Milz eines anästhesierten Mannes von acht bis 12 Wochen alten C57 Black Six Maus in einen 40-Mikrometer-Nylonnetzfilter in einer Zellkulturschale, die das vollständige Medium auf Eis enthält.

Mazerieren Sie die Milz mit dem Ende eines Spritzenkolbens vorsichtig durch das Netz. Wenn eine Einzelzellsuspension erhalten wurde, überführen Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie vier Volumen Ammoniumchlorid-Kalium-Lysepuffer hinzu, um die roten Blutkörperchen zu erschöpfen. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt und das Pellet in Vollmedium in einer zwei- bis fünffachen Konzentration von 10 bis sieben Zellen pro Milliliter resuspendiert.

Sieben Sie die Zellen durch ein neues 40-Mikrometer-Nylonnetz, um die Zelltrümmer zu entfernen. Und markieren Sie die sieben Zellen pro Empfängermaus einmal 10 Mal mit einem lebendzellkompatiblen Fluoreszenzfarbstoff, der bei der anschließenden Fixierung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius erhalten bleibt. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation in vier Volumina HBSS, die mit HEPES ergänzt sind.

Und resuspendieren Sie das Pellet in frischem HBSS plus HEPES auf eine Konzentration von einmal 10 bis 10 Zellen pro Milliliter. Als nächstes wirbeln Sie die Spenderzellen kurz vor und laden sie in eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel von 0,5 Zoll ausgestattet ist. Platzieren Sie die anästhesierten acht bis 12 Wochen alten C57 Black Six-Empfängermäuse in Bauchlage und üben Sie einen leichten kaudalen Druck auf die Haut dorsal zum Auge des ersten Tieres aus, wodurch der Augapfel leicht hervorsteht.

Richten Sie die Nadel medial für die retroorbitale Injektion von 100 Mikrolitern Spenderzellen. Ziehen Sie dann die Nadel nach und nach zurück und legen Sie die Maus in einen individuellen Auffangkäfig mit Überwachung, bis sie vollständig genesen ist. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass die Tiere angemessen anästhesiert werden und dass das Injektionsverfahren gut geübt wurde, um eine konsistente Zellabgabe zwischen den Tieren und über alle Versuche hinweg zu gewährleisten.

Ernten Sie die Milz bis zu 24 Stunden nach dem adoptiven Transfer in einen Milliliter des vollständigen Mediums pro Empfänger. Und erzeugen Sie eine Einzelzellsuspension ohne rote Blutkörperchen, wie gerade gezeigt. Nach der Zählung wird die Zellsuspension auf eine Konzentration von sieben Zellen pro Milliliter im Färbepuffer auf dreimal 10 eingestellt.

Und übertragen Sie 100 Mikroliter Zellen in einzelne Vertiefungen einer runden Bodenplatte mit 96 Vertiefungen. Färben Sie die Zellen für die interessierenden Marker gemäß den standardmäßigen durchflusszytometrischen Analyseprotokollen. Nach 20 Minuten auf lichtgeschütztem Eis waschen Sie die Zellen in 100 Mikrolitern Färbepuffer und resuspendieren Sie die Pellets in 200 Mikrolitern frischem Färbepuffer für eine zweite Zentrifugation.

Anschließend resuspendieren Sie das Pellet in 125 Mikrolitern frischem Färbepuffer und analysieren Sie die Zellproben auf einem Durchflusszytometer gemäß Standardprotokollen. Automatisierte Fluoreszenzmessungen zur Verfolgung der Migration zeigen deutlich eine Induktion der Zellmigration in Richtung MCP-1, die in Gegenwart von Serum verstärkt wird. Abhängig von der Stärke des Migrationsstimulus gibt es eine Verzögerung von mindestens 15 Minuten vor einem Anstieg des Fluoreszenzsignals, der seinen Höhepunkt erreichen und allmählich abnehmen kann, wenn die Zellen von der Unterseite des Einsatzes schneller in die untere Kammer gelangen als die Zellen aus der oberen Kammer migrieren.

Wenn mehr als eine fluoreszenzmarkierte Zellpopulation adoptiv übertragen wird, ist es wichtig, den relativen Anteil der Zellpopulationen innerhalb des Eingangsmaterials zu quantifizieren, um eine etwaige Varianz beim Mischen der Zellpopulationen zu berücksichtigen. In diesem Experiment betrug beispielsweise das Verhältnis von grün und orange fluoreszierenden Zellen 0,97 zu eins. Der Transport wurde quantifiziert, indem die Anzahl der markierten Zellen geteilt durch die Gesamtzahl der zurückgewonnenen Zellen dividiert wurde.

Obwohl es eine beträchtliche Varianz in der Anzahl der wiedergewonnenen Zellen zwischen den Tieren gibt, ist das Verhältnis von grün zu orange fluoreszierenden Zellen für jedes gegebene Tier typischerweise ungefähr gleich. Einmal gemeistert, kann die In-vitro-Technik in vier Stunden abgeschlossen werden, und die In-vivo-Technik kann in sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, dass keine Blasen in den Versuchskammern entstehen und dass die Konsistenz während der retroorbitalen Injektion der adoptiv übertragenen Zellen gewährleistet ist.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um die Chemotaxis in vitro und in vivo zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen In-vitro-Chemotaxis-Assay in Echtzeit durchführen und überwachen und native Lymphozyten für ihren adoptiven Transfer und für die Verfolgung ihrer In-vivo-Migration isolieren. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.