Name: AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Bestimmung mechanischer Eigenschaften wie Steifigkeit und Viskosität in Zebrafisch-Embryonen mittels Rasterkraftmikroskopie und Nanopartikel-Tracking. Diese Techniken ermöglichen mechanobiologische Einblicke mit minimaler Manipulation.

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Wir danken Amayra Hernandez-Vega und Philippe Alexandre Pouille für die Teilnahme an die Grundlage für diese Protokolle einrichten. Wir danken auch der Molecular Imaging Plattform vom IBMB-PCB, Xavier Esteban und Mitglieder des Labors für kontinuierliche Unterstützung. Das konsolidierte Gruppen Programm der Generalitat de Catalunya und DGI und Consolider Zuschüsse aus dem Ministerium für Wirtschaft und die Wettbewerbsfähigkeit von Spanien, EMB und DN unterstützt diese Arbeit.

Alle Protokoll-Schritte, die unten beschriebenen Anweisungen Tierbetreuung unserer Institutionen.
(1) Zebrafisch-Kultur
<ol><li>Züchten Sie und pflegen Sie Erwachsene Zebrafisch unter Standardbedingungen. Hinweis: AB und TL Wildtyp-Embryonen wurden für diese Studie verwendet.</li>
	<li>Sammeln Sie Embryonen zu und wachsen sie in E3 Embryo mittlere24bei 28,5 ° C. Inszenieren sie nach Morphologie als zuvor beschriebenen19.</li>
</ol>(2) Rasterkraftmikroskopie
<ol><li>Manuell Dechorionate inszeniert Zebrafisch-Embryonen (aller Altersgruppen nach individuellen Interessen). Entfernen Sie Chorions mit zwei dünnen und scharfen Pinzetten (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Das Chorion mit einer Pinzette greifen und es mit anderen Zangen eine Träne machen. Dann hält das Chorion in einer Region entgegengesetzt zu der des Risses, den Embryo vorsichtig durch die Öffnung schieben.</li>
		<li>Führen Sie die Dechorionation unter einen sezierenden Stereomikroskop mit einem einstellbaren Bereich der Vergrößerung von 8 X bis 50 X.</li>
	</ol></li>
	<li>Montieren Sie die Embryonen für AFM
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine Lösung von 2 % Agarose im Embryo Medium und füllen Sie einer 35-mm-Petrischale damit. Lassen Sie es zu festigen. Machen Sie kleine Löcher von 1,5 mm Durchmesser (doppelt so groß wie Embryo) und ca. 350 µm Tiefe (Hälfte der Embryo Größe) mit dünnen Pinzette in die Agarose-Bett.</li>
		<li>Legen Sie die Embryonen in die Pokes gemacht in der Agarose-Schicht und versichern Sie, dass sie im Ort durch die Verbreitung rund um eine Lösung von 0,5 % niedrige Agarose im Embryo Medium schmelzen. Gießen Sie diese Lösung, um nur die Embryonen in den Löchern befestigen.</li>
		<li>Bevor die niedrigen Schmelzpunktes Agarose bei Raumtemperatur erstarrt, drehen Sie die Embryonen in einer Weise, dass die Region von Interesse von AFM sondiert werden nach oben (Abbildung 1A) konfrontiert sein wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Untersuchen Sie die Embryonen von AFM
	<ol>
<li>Suchen Sie und Bild die Embryos in der Petrischale mit einem 20 X Objektiv in einem Inverted Atomic Force Microscope (siehe Tabelle der Materialien25) bei Zimmertemperatur (23-24 ° C). Hinweis: Die Embryonen sind lebendig gehalten, inmitten der Embryo Medium und an die Agarose-Bett.</li>
		<li>Sondieren Sie die Eigelb Zellenoberfläche gegossen Embryonen mit sphärischen Polystyrol-Kügelchen von 4,5 µm im Durchmesser befestigt, ein Freischwinger mit einem nominalen Federkonstante von 0,01 N/m. Peak to Peak Amplitude der Freischwinger Schwingung auf 5 µm und seine Frequenz von 1 Hz eingestellt.</li>
		<li>Sammeln Sie Daten für jede Region in verschiedenen Positionen und in mehrere Embryonen als eine Routine für die Mittelung der Daten getestet werden. Hinweis: Ein guter Ausgangspunkt ist fünf Positionen befindet sich in der Mitte und an den Ecken eines Quadrats µm 10 µm X 10 Steuerung Freischwinger mit XY Piezo-Aktuatoren der AFM Mikroskop zu untersuchen. Bildgebung und Datenerhebung dauerte rund 20 Minuten pro Embryo. Datenaufzeichnung in verschiedenen Regionen der Embryo Eigelb Zellenoberfläche, z.B.die Vegetal Pfosten oder verschiedene Regionen in der Nähe der EVL Zellen Rand (Abbildung 1 b und 1 C), geht nur durch den Einsatz von unterschiedlicher Proben unterschiedlich orientierte.</li>
	</ol></li>
	<li>Kräfte zu berechnen
	<ol>
<li>Messen Sie die vertikale Verschiebung der AFM Cantilever (Z) mit DMS-Sensoren mit Piezo-Aktuatoren und ihre Ablenkung (d) mit einem Quadranten Photodiode durch die optische Hebel-Methode mit dem Mikroskop-Steuerungs-Software gekoppelt (siehe Tabelle der Materialien ( 25).</li>
		<li>Verwenden Sie die Neigung einer gewonnenen Daten aus einer bloßen Region von einem Glas Deckgläschen d-Z-Kurve, um die Korrelation zwischen der Photodiode Signal und die Cantilever-Auslenkung (d) zu kalibrieren. Hinweis: Die gemessene vertikale Verschiebung entspricht die Cantilever-Durchbiegung und die Steigung stellt die Ablenkung Empfindlichkeit der optischen Hebel26.</li>
		<li>Folgern Sie, dass die Freischwinger Federkonstante (k) von den thermischen Fluktuationen27wie oben beschrieben.</li>
		<li>Berechnen Sie die Einrückung der Probe (h) als: h = (Z - Z-c) -(d - daus)          (1) Hinweis: Hier Zc ist die Position der Kontaktstelle und daus ist der Offset der Fotodiode.</li>
		<li>Berechnen Sie die Kraft (F) auf der Cantilever als: F = k · d (2)</li>
	</ol></li>
	<li>Berechnen Sie die Spannung des Kortex in Bezug auf eine Flüssigkeit-Ballon-Modell, bestehend aus einer Elastikschicht kortikalen Spannung Tc umschließt eine zähe Flüssigkeit. In diesem Modell für kleine Vertiefungen (im Vergleich zur Größe des Embryos), steigt Kraft proportional4,28 als: F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3) Hinweis: Hier Rb ist der Radius des Wulstes und e R ist der Radius des Embryos. Für Zebrafish Embryos wie der Radius des Embryos (400 µm) zwei Größenordnungen größer ist als die des Wulstes (2,25 µm), ist kann diese Gleichung als angenähert werden: F = 4π Tc h (4)<ol>
<li>Berechnen Sie die Spannung Kraft-Einrückung (F-h) Kurven in jeder Embryo Eigelb Zelle Region für fünf verschiedene Punktmessungen.</li>
		<li>Tc für jede F-h -Kurve durch nichtlineare kleinste-Quadrate passend zu berechnen. Für statistische Analysen, die kortikale Spannung Tc berechnet aus den verschiedenen F-h Kurven gemittelt werden muss.</li>
	</ol></li>
	<li>Die viskoelastischen Eigenschaften (Rheologie) des Kortex mittels niedrigen Amplitude messen (100 nm) Multifrequenz Schwingungen bei AFM bestehend aus sinusförmigen Wellen mit unterschiedlichen Frequenzen25.
	<ol>
<li>Eine effektive komplexen Modulus g*(ƒ) im Frequenzbereich von Kraft Einzug Kurven als zu berechnen: g * (f) = [F(f) / h(f)]- Ifb (5) hier i ist die imaginäre Einheit und F(f) und h(f) sind die Frequenzspektren (f) der Kraft und der Einzug. b ist die Korrektur für das zähflüssige ziehen auf der Cantilever entzogen die Schwingungen auf die Oberfläche aufgetragen.</li>
		<li>Separate g*(ƒ) in realen und imaginären Teile wie: g * (Ƒ) = g' (f) + Ig'' (f)          (6) Em > g'(f) ist der Elastizitätsmodul und ist ein Maß für die elastischen Energie gespeichert und wiederhergestellt pro Zyklus der Schwingung. g'' (f) ist der viskosen Modulus, die Konten für die Verlustleistung.</li>
		<li>Berechnen Sie die Tangente Verlust, sorgt für einen Index von fest-wie (< 1) oder Flüssigkeit-wie (> 1) Verhalten des Materials, wie: g'' (f) / g"(f)          (7) Hinweis: Mit dieser Art der Messung ist es möglich, Parameter zu extrahieren angibt wie Viskose und wie elastisch der sondierten Material ist. Obwohl b leicht von der Entfernung des Endes des Nadelträgers an die Oberfläche hängt, angesichts der sehr niedrige Werte von g´´ ausgestellt durch das Eigelb (siehe unten Abbildung 2D ), kleine Abweichungen in b haben einen vernachlässigbaren Einfluss in die Messungen29.</li>
	</ol></li>
</ol>(3) Particle Tracking Microrheology
<ol><li>
Führen Sie Partikel Mikroinjektion in die Eigelb-Zelle
	<ol>
<li>Fertigen Sie maßgeschneiderte Mikronadeln mit einem horizontalen Mikropipette Puller und Kapillare Borosilikatglas (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Bereiten Sie Mikronadeln, die einen Außendurchmesser von 1,00 mm, einen Innendurchmesser von 0,58 mm und einer Länge von 10 cm mit Puller-Einstellungen haben: Druck: 500; Hitze: 510; Ziehen: 65; Geschwindigkeit: 25; Zeit: 50.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vorbereiten einer Injektion Petrischale Platte durch die Schaffung von geraden Einzug Bahnen in einem 1 % Agarose im Embryo mittlere Bett mit benutzerdefinierten gemacht Formen (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Drehen Sie die Formen um und legen Sie sie auf das flüssige Agarosegel und entfernen Sie den Schimmel zu, sobald das Gel verfestigt hat. Pipette die Embryonen in die Nuten von der Form in der Agarose unter einen sezierenden Stereomikroskop bei 1,2 X Vergrößerung gemacht. Hinweis: Die Breite und das Design der Werkzeuge ermöglichen die Embryonen selbst ausrichten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vor der Injektion fast vollständig entfernen Sie das Medium, um die Injektion zu erleichtern (die Oberflächenspannung verhindert, dass der Embryo/Chorion festhalten an der Nadel, wenn es nach der Injektion zu entfernen).</li>
		<li>Microinject fluoreszierende Nanopartikel (Radius einer = 100 nm, siehe Tabelle der Materialien) verdünnt in Wasser (1:1 000) im pflanzlichen Teil der Embryo Eigelb Zelle (Abb. 3A).</li>
		<li>Passen Sie die Mikropipette mit Präzision Mikromanipulatoren und injizieren Sie die Perlen mit einer automatischen Microinjector mit Zeit und Druck-Regler (siehe Tabelle der Materialien). Stellen Sie den Druck zwischen 10 und 20 Psi.</li>
		<li>Vor der Injektion der Wulst Lösung, kalibrieren Sie das Volumen zu injizieren (0,5 nL) durch Messung der Tröpfchengröße geliefert durch die Microinjector mit einem 1 x 0,01 mm Bühne Mikrometer (siehe die Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Beschäftigen Sie eine Vergrößerung von 1,6 X in den sezierenden Stereomikroskop, die Embryonen während der Injektionen zu visualisieren, die bei Raumtemperatur durchgeführt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Das viskoelastische Verhalten das Eigelb durch thermische Fluktuationen Aufzeichnung zu bewerten
	<ol>
<li>Dechorionate die microinjected Embryonen wie in Schritt 2.1 und eingebettet in eine 0,5 % niedrige Schmelz-Punkt Agarose im Embryo mittlere Lösung bei 30 ° C. Anschließend übertragen Sie sie auf Glasplatten unten (siehe Tabelle der Materialien) und orientieren Sie und schieben Sie sie auf das Deckglas, wenn die Agarose noch flüssig ist. Hinweis: Wenn die Agarose bei Raumtemperatur erstarrt, können die Embryonen abgebildet werden.</li>
		<li>Legen Sie die Embryonen in die unteren Glasplatten auf der Bühne von einem konfokalen umgekehrtes Mikroskop 2 h nach Mikroinjektion montiert. Die Aufnahmen der Nanopartikel für 26 s bei einer Sampling-Rate von 25 Hz mit einer 63 X Objektiv bei Raumtemperatur in einer invertierten confocal Mikroskop beschäftigt die standard kommerzielle Mikroskop-Software (Pixelgröße = 166 nm, Bilder, die alle 40 ms).</li>
		<li>Berechnen Sie die Position der Partikel Zentroiden zu und definieren Sie ihre Flugbahnen im Laufe der Zeit mit dem TrackMate-Plugin von open Source Software ImageJ (Abb. 3 b).</li>
		<li>Berechnen Sie die zweidimensionale mittlere quadratische Verschiebung (MSD) jedes Partikels mit maßgeschneiderten Software6,30 als: < ΔR2 (τ) > = < [X(t + τ) - X(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2>           (8) Hinweis: Hier ist t die verstrichene Zeit und die zeitliche Verzögerung. In einer reinen viskose Flüssigkeit steigt die MSD umgekehrt mit Viskosität (ν) nach der Stokes-Einstein-Beziehung: < ΔR2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa,          (9) wobei T die Absolute Temperatur ist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine finanziellen Interessenkonflikte oder andere Interessenkonflikte.

Hier zeigen wir, dass die Materialeigenschaften und einige biomechanischen Parameter der Zebrafisch Eigelb Zelle während der Epiboly von AFM und Nanopartikel Microrheology leicht geschätzt werden können.
Während AFM, zum Abrufen von rheologischer Eigenschaften von Zellen und Geweben in physiologischen Bedingungen4,5,25,28 beschäftigt war, haben hier wir ein Protokoll...

Die physikalischen Grundsätze der biomechanischen Kontrolle der morphogenetischen Prozesse sind weitgehend undefiniert. Während biomechanische Untersuchungen auf molekularer und zellulärer Ebene erhebliche an Schwung, ist die Erforschung der biomechanischen Parameter der Ebene der Gewebe/Organismus in seiner Kindheit. Hydrodynamische Regression1 oder Video-Kraft-Mikroskopie2 Forscher, aktive und passive Kräfte, während der Laser Mikrochirurgie3oder weniger aufdringlich Rasterkraftmikroskopie (AFM) dissoziierten Zellen4 unterscheiden können oder in vivo 5 oder Nanopartikel Microrheology6 erlauben die Vorfreude der mechanischen Eigenschaften und Reaktionen des Gewebes.
AFM ist eine dreidimensionale topographische Technik mit hoher atomarer Auflösung Oberflächenrauhigkeit und Compliance aus der Durchbiegung der Freischwinger Tipps beim Kontakt mit einem sondierten Oberfläche7zu lösen. Verschiedene Methoden mit AFM wurden entwickelt, um Oberflächeneigenschaften, einschließlich der Messung von Reibung, Adhäsionskräfte und viskoelastischen Eigenschaften verschiedener Materialien zu untersuchen. AFM hat vor kurzem ein mächtiges Werkzeug zum Abrufen von Informationen auf die mechanischen Eigenschaften von biologischen Proben entwickelt. AFM kann insbesondere nicht-invasiv der komplexe Schubmodul aus einzelnen Zellen extrahieren, durch die Anwendung von oszillierender Vertiefungen mit einem Mikro Spitze an einem Freischwinger von bekannten Biegung konstant8befestigt. Dadurch können wir die daraus resultierenden Kräfte abzuleiten. Doch AFM ist nicht eindeutig und verschiedene Methoden erlauben extrahieren Daten rheologischen und mechanischen Eigenschaften von einzelnen Zellen (z. B. Mikropipette streben9, magnetische Zytometrie (MTC)10verdrehen oder einachsigen Zug- 11Tests).
Die Anwendung dieser neuartigen Methoden komplexe morphogenetischen Prozesse ist jedoch nicht einfach. Die größten Herausforderungen bei der Bestimmung der mechanischen Eigenschaften des embryonalen Gewebe sind die kleinen (µm bis mm), weich (in den 102 - 104 -Pa-Bereich) und Visco-elastische (entstehen auf zeitabhängige Phänomene) Natur der materiellen12. Es ist daher wichtig, die Methoden zur Bestimmung der mechanischen Eigenschaften (Steifigkeit, Viskosität, Adhäsion) auf den konkreten Fall von Embryonen und entwickelnden Organismen anzupassen. Zwei wichtige Punkte müssen berücksichtigt werden bei der Analyse der rheologische Ansätze zur Entwicklung zu studieren: aufdringlich Störungen zu vermeiden und gute Erreichbarkeit. In diesem Szenario zeigen Mikropipette Aspiration, MTC und Zugprüfung Einschränkungen. Im ersten Fall könnte die hohe Verformung, die eine Zelle leidet seine physiologischen und mechanischen Eigenschaften9ändern. Im zweiten Fall könnte die Notwendigkeit, sich fest das experimentelle Gewebe auf ein Substrat um sicherzustellen, dass die Spannungen angewendet das Zellskelett lokal verformen auch Auswirkungen auf die Zellen der Aktivierungsstatus und daher in ihrer mechanischen Eigenschaften10 bringen. . Letzte, einachsigen Zug-Ansätze werden durch die Geometrie der Entwicklung von Organismen und Zugänglichkeit11begrenzt.
AFM scheint für das Studium der Entwicklungsprozesse besser geeignet sein, wie es die Untersuchung von biologischen Proben direkt in ihrer natürlichen Umgebung ohne umständliche Probenvorbereitung ermöglicht. Darüber hinaus wie Dissoziation des embryonalen Gewebe in der Regel schwierig ist, bietet die geringere Größe der AFM Sonden ein hohes Maß an Vielseitigkeit ohne Einschränkung bei der Wahl der Art des Mediums (wässrige oder nichtwässrigen), Probentemperatur oder chemische Zusammensetzung der Probe. AFM ist vielseitig genug, um auf große Domänen angewendet werden und Zeitskalen und zum Abrufen von Eigenschaften von Gewebe in unterschiedlichen Entwicklungsstadien oder physiologischen Bedingungen beschäftigt. Gesamten nativen Gewebe wie Arterien13 oder Knochen14 untersucht worden sind, aus Sicht der topographischen und in einigen Fällen, wie der Sklera, mechanische Eigenschaften wurden auch abgerufen am15. Topographie ist auch in live ermöglicht die Visualisierung von zum Beispiel Zelle Umlagerung während Morphogenese Xenopus16Embryonen untersucht worden. Letzten, umfassenden Stichprobe Vorbereitung Protokolle wurden entwickelt, um mechanische Parameter zu bestimmen, während verschiedene Entwicklungsprozesse. Nanoindentation Karten wurden auf native fixierten Gewebeschnitten für die Küken embryonalen Verdauungstrakt11generiert; Kleber und mechanische Eigenschaften für einzelne Ektoderm, Mesoderm und Entoderm Progenitor-Zellen isoliert von gastrulating Zebrafish Embryos4abgerufen; Steifigkeit Messungen für die Epiblast und primitive Streak auf Explantaten von Vogelgrippe Embryonen17; und ein eindeutiges Muster von Steifigkeit Gradienten direkt im embryonalen Gehirn von Xenopus5definiert.
Annäherung an einfach zugänglichen morphogenetischen Prozesse kann ein erheblicher Qualitätssprung für die Anwendung von AFM für die Erkundung der Embryonalentwicklung entstehen. Zebrafisch-Epiboly ist ein wesentlicher und konservierte Ereignis, in dem verschiedene Geweben auf engstem Raum kugelförmig um den Ausbau der Blastoderm in wenigen Stunden direkte koordinieren. Zu Beginn der Zebrafisch Epiboly (sphärische Bühne) deckt eine oberflächliche Schicht von Zellen, die umhüllende Schicht (EVL), eine halbkugelförmige Kappe von Blastomeren auf die Tier-Pole des Embryos sitzt auf einer massiven Eigelb syncytial Zelle zentriert. Epiboly besteht aus den kortikalen pflanzlichen Ward Ausbau der EVL die tiefen Zellen (DCs) das Blastoderm und die äußere Schicht der syncytial Eigelb Zelle (E-YSL) um den Dotter. Epiboly endet mit der Schließung der EVL und die DCs Vegetal Pfosten18,19,20. Wie und wo Kräfte während Epiboly generiert werden und wie sie weltweit gekoppelt sind, ist nicht noch klar,1,21.
Hier beschreiben wir im Detail wie AFM zu folgern, dass passive mechanische Gewebeeigenschaften während Epiboly Progression im Zebrafisch Eigelb in VivoZelle angewendet. Dazu haben wir kleine Mikrosphären mit AFM Kragarmen als Sonden verbunden beschäftigt. Dies ermöglicht den Abruf von präzise lokale Informationen innerhalb der Zelloberfläche ungleichmäßige Eigelb und Zug Steigungen und ihre Dynamik im Laufe der Zeit zu studieren. Alternative AFM nähert sich z. B. die Verwendung von Keil Kragarme22, wird nicht Lokaldaten Render, die präzise genug ist. Die Keil-Technik, die sehr sorgfältige Handhabung Fähigkeiten, um einen Keil größer als die Größe der Stichprobe am Ende des Nadelträgers kleben erfordert, eignet sich nicht zum sondieren Embryo (~ 2-fach größer als die Länge des Nadelträgers) Mechanik.
Modellierung und Charakterisierung der viskoelastischen Eigenschaften der Zellen in qualitativer und quantitativer Hinsicht ermöglicht ein besseres Verständnis für die Biomechanik. Aus biomechanischer Sicht ist es wichtig zu verstehen, Epiboly und nicht nur Nachfrage wissen über Messungen der kortikalen Spannung und Dynamik, die durch AFM extrahiert werden können; so gibt es Bedarf an Informationen über die biophysikalischen Eigenschaften des Gewebes. Um diese Informationen zu extrahieren, eine Vielzahl von Zelle Rheologie Techniken wurden entwickelt, in den Jahren um verschiedene Zelltypen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen23charakterisieren. Dazu gehören AFM, MTC und optische Pinzette (OT). Diese Methoden sind jedoch unzureichend für mesoskopische Analysen auf der Ebene der Embryonen oder Organen nachgewiesen worden. Als Alternative haben wir erfolgreich Nanopartikel-Tracking Microrheology6 für in Vivo rheologischen Messungen angepasst. Diese Technik analysiert die Brownschen Verschiebungen einzelner Partikel und schließt lokale mikromechanische Eigenschaften.
Zusammen AFM und Nanopartikel Microrheology erlauben die Definition der kortikalen Zug Dynamik und internen mechanischen Eigenschaften von Eigelb während Epiboly. Diese Informationen unterstützt voll und ganz eine Modell in dem anisotropen Stress entwickelt sich als Folge der Unterschiede in der Verformung Antwort von der EVL und die Eigelb zytoplasmatischen Schicht (YCL) zu den isotropen Actomyosin Kontraktion des E-YSL Kortex ist wichtig für net Richtungsbewegung der EVL und Epiboly Progression1.

<table><tbody><tr><td>Inverses optisches Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TE2000</td><td>Visualisierung der Probe und des AFM Cantilevers</td></tr><tr><td>Rasterkraftmikroskop (AFM)</td><td>Sonderanfertigung-Jedes</td><td></td> <td>kommerzialisierte AFM kann eingesetzt werden</td></tr><tr><td>Inverses Konfokales Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Nanorheologie-Datenerfassung</td></tr><tr><td>Agarose D1 Low EEO</td><td>Conda</td><td>8016.00</td><td>Embryonen gießen</td></tr><tr><td>Ultrareine LMP Agarose (niedrigschmelzend)</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>Sicherung von Embryonen</td></tr><tr><td>Zebrafisch-Mikroinjektions- und Transplantationsformen</td><td>World Precision Instruments</td><td>Z-MOLDS</td><td>Gießen von Embryonen. Es können auch Sonderanfertigungen mit den Originalmaßen verwendet werden</td></tr>: <tr><td>Dumont 5 Pinzetten</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td>mit 1,5 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>Si3N4 Ausleger</td><td>Novascan</td><td>PT. GS</td><td>Vermessung des Embryos mittels AFM. Kugelförmige Spitze: 4,5 & Mikro; m Durchmesser und k=0,01 N/m</td></tr><tr><td>Fluoreszierende Nanopartikel</td><td>Life Technologies</td><td>FluoSpheres F8811,Zur</td> <td>Verfolgung der Nanorheologie</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Sutter</td><td>Instruments P-2000</td><td>Herstellung von maßgeschneiderten Mikronadeln</td></tr><tr><td>Borosilikat-Kapillarglas</td><td>Warner Instruments</td><td>G100TF-4</td><td>Herstellung von maßgeschneiderten Mikronadeln</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td>Manipulation der Mikropipette</td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet Express</td><td>Steuerung von Injektionszeit und -druck</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>DFC365FX</td><td>Visualisierung der Embryonen während der Injektion</td></tr><tr><td>Analysesoftware</td><td>MathWorks</td><td>Matlab</td><td>Analyse von AFM- und Partikelverfolgungsdaten</td></tr><tr><td>Zebrafish</td><td>AB und TL Wildtyp</td><td>- </td><td>Stämme, die für die Embryonenentnahme verwendet werden</td></tr><tr><td>Glasbodenplatten</td><td>Mat Tek</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>Einbetten von Embryonen für die Nanorheologie-Datenerfassung</td></tr><tr><td>Tischmikrometer</td><td>FST</td><td>29025-02</td><td>Messung des Injektionsvolumens</td></tr></tbody></table>

afm und microrheology in den zebrafish embryos eigelb zelle

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Aufklärung der Faktoren, die die räumlich-zeitliche Organisation der sich entwickelnden Gewebe direkt ist einer der Hauptgründe für die Verwendung in der Studie der Entwicklung. Verschiedene Thesen behaupten, wichtige Beiträge zum Verständnis der mechanischen Eigenschaften von Zellen und Geweben in ihrer raumzeitlichen Organisation in verschiedenen Entwicklungs- und morphogenetischen Prozessen gewesen zu sein. Jedoch wegen des Mangels an zuverlässige und zugängliche Tools zur Messung von Materialeigenschaften und Zug Parameter in Vivo, war Überprüfung dieser Hypothesen schwierig. Hier stellen wir Ihnen Methoden beschäftigt Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Teilchen verfolgen mit dem Ziel, die mechanischen Eigenschaften der intakten Zebrafish Embryos Eigelb Zelle während der Epiboly zu quantifizieren. Epiboly ist eine frühe konservierten Entwicklungsprozess, dessen Studie durch die Transparenz des Embryos erleichtert wird. Diese Methoden sind einfach zu implementieren, zuverlässig und vielseitig einsetzbar, da sie aufdringliche Interventionen überwinden, die Gewebe Mechanik beeinflussen könnten. Eine einfache Strategie wurde für die Montage von Proben, AFM-Aufnahme und Nanopartikel-Injektionen und Nachverfolgung angewendet. Dieser Ansatz macht diese Methoden leicht anpassbar an andere Entwicklungsstörungen Zeiten oder Organismen.

Kortikale Spannung Messungen Für jeden Messpunkt wurden fünf Kraft-Weg (F-Z)-Kurven von AFM erworben, durch Rampen der Cantilever bei 1 Hz mit einer Spitze-Spitze-Amplitude von 5 µm (Geschwindigkeit = 10 µm/s) bis zu einer maximalen Einbuchtung von ~ 2 µm. Dieses Verfahren dauerte weniger als 20 min und war nicht betroffen von Epiboly fortschreiten. Jede experimentelle Bedingung wurde in mindestens 5 Embryonen getestet.
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Das Fehlen von Instrumenten zur Messung von Materialeigenschaften und Zug Parameter in Vivo verhindert Validierung ihrer Rolle während der Entwicklung. Wir beschäftigten Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Nanopartikel-Tracking, mechanische Eigenschaften auf die intakte Zebrafish Embryos Eigelb Zelle während der Epiboly zu quantifizieren. Diese Methoden sind zuverlässig und vielseitig einsetzbar, aufdringliche Interventionen zu vermeiden.

AFM und Microrheology in den Zebrafish Embryos Eigelb Zelle

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin, spezifische Methoden zur Bestimmung mechanischer Eigenschaften wie Steifigkeit, Viskosität und Adhäsion auf den speziellen Fall von Embryonen und sich entwickelnden Organismen anzupassen. Die in dieser Arbeit vorgestellten Methoden können Fragen im Bereich der Mechanobiologie beantworten, beispielsweise wie diese Eigenschaften auf genetische oder physikalische Reize während der Entwicklung oder auf eine Beeinflussung der zellulären Aktivitäten reagieren. Ein großer Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Gewinnung entscheidender Informationen bei minimaler Manipulation ermöglicht und somit Fragen adressiert, die mit anderen Verfahren nicht zugänglich sind. Diese Methoden liefern Erkenntnisse zum Verständnis der Rolle der Dotterzelle während eines und können anschließend auf verschiedene Bereiche im Embryo, unterschiedliche Entwicklungsstadien sowie sogar auf andere Modellorganismen angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methoden ist entscheidend, da das Montieren und Handhaben von Embryonen schwer zu erlernen ist. Sammeln Sie zunächst Zebrafisch-Embryonen und ziehen Sie diese bei 28 Grad Celsius in E3-Emb

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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