Technik der minimal-invasiven quer Aortenstenose Verengung bei Mäusen für Induktion der linken Ventricular Hypertrophie
25. September 2017
Ziel dieses Protokolls ist es, Schritt für Schritt beschreiben die Technik der minimal-invasiven quer Aortenstenose Verengung (TAC) bei Mäusen. Durch Beseitigung der Intubation und Belüftung sind obligatorisch für häufig verwendete Standardverfahren, minimal-invasive TAC das operative Vorgehen vereinfacht und reduziert die Belastung auf das Tier setzen.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine minimalinvasive transversale Aortenverengung bei Mäusen zu etablieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Implementierung einer transversalen Aortenverengung bei Mäusen zu beantworten, z. B. wie man einen Durchgang unter dem Aortenbogen schafft. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie einfach und benutzerfreundlich ist und dass die Intubation und Beatmung der Mäuse überflüssig wird.
Ich werde das Verfahren mit unserer Postdoktorandin Simona Nemska demonstrieren, die die präoperative Tiervorbereitung und die postoperative Überwachung durchführen wird. Rasieren Sie am Tag des Eingriffs den Hals und die Brust einer betäubten Maus und desinfizieren Sie die exponierte Haut mit 70% Ethanol. Nachdem Sie den geeigneten Sedierungsgrad durch Einklemmen der Zehen bestätigt haben, befestigen Sie das Tier in Rückenlage auf einem sauberen Arbeitspolster aus Kork.
Verwenden Sie als Nächstes eine Messerklinge mit der Nummer 11, um einen 10 Millimeter langen Längsschnitt in der Mitte der Halswirbelsäule von der suprasternalen Kerbe bis zur Mitte der Brust zu machen, um das Brustbein freizulegen. Führen Sie mit einem Crile-Wood-Nadelhalter eine 4-0 monofile Bleinaht aus Polypropylen durch, um die Schilddrüse zurückzuziehen. Und kleben Sie die Naht auf das Arbeitspad.
Bewegen Sie dann das Arbeitspad unter ein Operationsmikroskop und verwenden Sie eine mikrochirurgische Pinzette, um die prätrachealen Muskeln stumpf zu trennen und die Luftröhre freizulegen. Schieben Sie die geschlossenen Spitzen einer gebogenen mikrochirurgischen Pinzette vorsichtig über die Luftröhre und hinter das Brustbein und öffnen und schließen Sie vorsichtig die gebogene Pinzette, um die Pleura stumpf zu präparieren. Greifen Sie mit der geraden mikrochirurgischen Pinzette die rechten supraklavikulären Muskeln und ziehen Sie sie sanft auf der Brust nach oben.
Schieben Sie die untere Spitze der Knochenzange unter das Brustbein und führen Sie eine drei bis vier Millimeter große obere Teilsternotomie durch, wobei der untere Teil der Mini-Sternotomie leicht nach links gerichtet wird. Führen Sie mit einem mikrochirurgischen Nadelhalter eine 7-0 monofile Bleinaht aus Polypropylen von innen nach außen des zweiten Interkostalraums auf jeder Seite der Mini-Sternotomie durch. Verwenden Sie 7-0 monofile Polypropylen-Haltenähte, um die Brustbeinkanten auf jeder Seite zu spreizen.
Und verwenden Sie die gebogene Pinzette, um die prätrachealen Muskeln, das Mediastinalfett und den Thymus sanft zur Seite zu bewegen, um den Aortenbogen unter geringer Vergrößerung sichtbar zu machen. Um das Weichgewebe unter dem Aortenbogen freizulegen, führen Sie bei geschlossenen Spitzen eine Bindezange unter den Zahnbogen ein und öffnen Sie die Pinzette vorsichtig. Verwenden Sie eine zweite Bindezange, um einen Tunnel in das Weichgewebe unter dem Aortenbogen zu bohren, indem Sie die Pinzette im Weichgewebe vorsichtig öffnen und schließen.
Führen Sie dann ein Stück 6-0-Seidenligatur durch das Auge einer Ligaturhilfe unter dem Aortenbogen hindurch und ziehen Sie mit einer Bindezange die Naht zwischen dem Ursprung der rechten Innominatarterie und der linken Arteria carotis communis heraus. Der schwierigste Schritt des Eingriffs ist das Einführen der Naht unter dem Aortenbogen. Wenn Sie beim Erstellen des Tunnels unter dem Bogen ausreichend vorsichtig vorgehen, wird das anschließende Legen der Naht erleichtert.
Positionieren Sie nun mit der geraden Pinzette eine abgestumpfte 27-Gauge-Nadel neben dem Aortenbogen und binden Sie mit den beiden Bindezangen die Naht eng um die Nadel und die Aorta zwischen der rechten Innominat- und der linken Halsschlagader. Wenn die Naht gesichert ist, entfernen Sie die Nadel schnell, aber vorsichtig, um eine Verengung mit einem Durchmesser von 0,4 Millimetern und eine reproduzierbare transversale Aortenverengung von 65 bis 70 % zu erreichen. Entfernen Sie nach Bestätigung der Blutstillung die 7-0 monofilen Stay-Nähte aus Polypropylen, die zum Spreizen der Brustbeinkanten verwendet werden.
Verwenden Sie einen mikrochirurgischen Nadelhalter, um eine einfache 6-0 monofile Polypropylen-Naht von außen nach innen des linken zweiten Interkostalraums und von innen nach außen des rechten zweiten Interkostalraums zu führen. Verwenden Sie den Crile-Wood Nadelhalter, um die Brustbeinkanten mit einem 6-0 monofilen Polypropylen-Naht zusammenzubringen. Und verschließen Sie die Haut mit einer 5-0 monofilen Polypropylen-Laufnaht in einer Schicht mit einem Crile-Wood-Nadelhalter.
Setzen Sie das Tier dann wieder in seinen Käfig in Bauchlage unter Erwärmung mit Überwachung, bis es sich vollständig erholt hat. Die Wirksamkeit der Induktion der linksventrikulären Hypertrophie kann validiert werden, indem das Verhältnis von Herzgewicht zu Körpergewicht der Scheintiere mit dem der Versuchstiere an den Tagen drei, sieben, 14 und 28 nach der Operation verglichen wird. Das Verhältnis steigt bei den gebänderten Tieren im Vergleich zu den Scheingruppen ab dem siebten Tag nach der Operation signifikant an und bleibt bei den verengten Tieren bis zum 28. Tag nach der Operation signifikant höher.
Die beobachtete Zunahme des Verhältnisses von Herz zu Körpergewicht ist ausschließlich auf einen Anstieg des Körpergewichtsverhältnisses des linken Ventrikels zurückzuführen, da das Körpergewichtsverhältnis des rechten Ventrikels zwischen der Querverengung der Aorta und den scheinoperierten Tieren über den gesamten Beobachtungszeitraum vergleichbar bleibt. Darüber hinaus ist die mRNA-Expression des natriuretischen Peptids im Gehirn, einer positiven Kontrolle für Herzhypertrophie in den linken Ventrikeln, bei den Tieren mit Aortenband signifikant höher als bei den scheinoperierten Kontrolltieren an Tag 14, was die Wirksamkeit der Technik weiter bestätigt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 20 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine Ligaturhilfe und eine Bindezange zu verwenden, ähnlich denen, die in unserem Protokoll verwendet werden. Nach ihrer Entwicklung lieferte diese Technik ein zuverlässiges und vereinfachtes Modell für die Erforschung der Mechanismen, die an der Entstehung der durch Drucküberlastung induzierten linksventrikulären Hypertrophie beteiligt sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie eine minimalinvasive transversale Aortenverengung bei Mäusen durchgeführt wird, wobei der Schwerpunkt auf der Passage unter dem Aortenbogen liegt.
Vergessen Sie nicht, dass die Schaffung des Durchgangs unter dem Aortenbogen der kritischste Schritt des Eingriffs ist und die Verwendung einer Ligaturhilfe und einer Bindezange das Verletzungsrisiko des Zahnbogens erheblich reduziert.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine minimalinvasive Technik zur Durchführung einer transversen Aortenkonstriktion (TAC) bei Mäusen. Durch den Verzicht auf Intubation und Beatmung vereinfacht diese Methode den Eingriff und minimiert die Belastung der Tiere.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Kardiovaskuläre Forschung
- Tiermodelle
- Minimalinvasive chirurgische Techniken
Hintergrund
- Die transversale Aortenkonstriktion ist ein gängiges Modell zur Untersuchung von Herzerkrankungen.
- Herkömmliche Methoden erfordern Intubation und Beatmung, was für das Tier belastend sein kann.
- Minimalinvasive Ansätze zielen darauf ab, diese Belastung zu verringern, während die experimentelle Integrität erhalten bleibt.
- Dieses Protokoll beschreibt einen vereinfachten Ansatz für die TAC bei Mäusen.
Zweck der Studie
- Eine benutzerfreundliche Methode zur Durchführung der TAC bei Mäusen etablieren.
- Die Notwendigkeit einer Intubation und Beatmung während des Eingriffs eliminieren.
- Die Erforschung kardiovaskulärer Erkrankungen auf weniger invasive Weise erleichtern.
Verwendete Methoden
- Vorbereitung der Maus durch Rasieren und Desinfizieren von Hals und Brust.
- Überprüfung der Sedierungstiefe durch Zehenquetschtest.
- Befestigung der Maus in Rückenlage auf einer sauberen Arbeitsunterlage.
- Demonstration des chirurgischen Eingriffs durch geschultes Personal.
Hauptergebnisse
- Die Technik reduziert erfolgreich den mit herkömmlichen TAC-Methoden verbundenen Stress.
- Die postoperative Überwachung wird vereinfacht und verbessert somit das Wohlergehen der Tiere.
- Belegt eine einfache Handhabung für Forschende.
- Erleichtert weitere Studien zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen.
Schlussfolgerungen
- Die minimalinvasive TAC ist eine gangbare Alternative zu herkömmlichen Methoden.
- Dieser Ansatz kann die Forschungsqualität verbessern und gleichzeitig das Wohlergehen der Tiere sicherstellen.
- Zukünftige Studien können auf dieser Technik aufbauen, um verschiedene kardiovaskuläre Erkrankungen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll stellt eine vereinfachte, minimalinvasive Methode zur Induktion einer linksventrikulären Hypertrophie bei Mäusen bereit und trägt damit dem Bedarf an effizienten und stressarmen präklinischen Modellen in der kardiovaskulären Arzneimittelforschung Rechnung. Durch den Verzicht auf Intubation und Beatmung wird der Eingriff weniger komplex und die Belastung für die Tiere verringert, was eine höhere Durchsatzkapazität und ein verbessertes Wohlergehen in Studien zur Target-Validierung ermöglicht. Das Modell erlaubt eine zuverlässige Beurteilung therapeutischer Kandidaten, die auf die durch Drucküberlastung induzierte kardiale Remodellierung abzielen, und unterstützt so eine frühzeitige mechanistische Ent-Risikobewertung im Entdeckungsprozess.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in Modellen der durch Drucküberlastung induzierten linksventrikulären Hypertrophie.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch reproduzierbare Induktion einer kardialen Hypertrophie mit geringer Letalität.
- Predictiver Wert: Fördert die Zielvalidität, indem molekulare Marker wie die Hochregulierung von BNP als Antwort auf eine Aortenkonstriktion bestätigt werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening-Untersuchung vor, indem konsistente LVH-Phänotypen etabliert werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch standardisierte chirurgische Technik und quantifizierbare Herz-zu-Körper-Gewichts-Verhältnisse.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform aufgrund der kurzen Operationsdauer (20 Minuten) und des geringen Ausrüstungsbedarfs.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die translationale Biomarker-Abstimmung durch signifikante Hochregulation von BNP-mRNA bei konstriktierten Tieren.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung mit anhaltender LVH von Tag 7 bis Tag 28 nach der Operation.
- Risikominderung: Leitet risikoadjustierte Entscheidungen für die Weiterentwicklung durch Modellierung des krankheitsbedingten Fortschritts im Zusammenhang mit menschlichem Herzversagen ab.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Leitstruktur-Identifizierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung und bietet ein krankheitsrelevantes System für mechanistische Untersuchungen der kardialen Hypertrophie.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen bei kardiovaskulären Mechanismen durch Drucküberlastung.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Tests durch reproduzierbare LVH-Induktion und quantifizierbare phänotypische Endpunkte.
- Analytik: Ermöglicht den quantitativen Vergleich mithilfe des Herz-zu-Körper-Gewichts-Verhältnisses und molekularer Biomarker über experimentelle Gruppen hinweg.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität durch anhaltende hypertrophe Reaktion und Validierung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbares Modell der kardiovaskulären Pathologie aufgrund seiner Einfachheit, geringen Kosten und hohen Effizienz.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Unklarheiten in den Signalwegen der kardialen Hypertrophie.
- Operativer Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der chirurgischen Induktion über verschiedene Studienstandorte hinweg.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitaleffizienz und vermindertes biologisches Risiko in fortgeschrittenen Phasen kardiovaskulärer Programme.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung basierend auf der validierten Leistung von Krankheitsmodellen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert mikrochirurgische Fachkenntnisse und Vertrautheit mit Ligaturhilfsmitteln und Knotenzangen.
- Setzt Stereomikroskopie und mikrochirurgische Instrumente für eine präzise Manipulation des Aortenbogens voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Teams hinsichtlich der Nahtplatzierung und Überprüfung der Einengung.
- Beinhaltet Anpassungen für verschiedene Mausstämme oder Altersgruppen, die über das spezifizierte C57BL/6-Modell hinausgehen.
- Ist durch die technische Schwierigkeit eingeschränkt, einen zuverlässigen Durchgang unter dem Aortenbogen zu schaffen, was für die Reproduzierbarkeit entscheidend ist.
