Name: Eine Methode für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen im Transmissions-Elektronenmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-17T10:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Erfahren Sie eine kostengünstige Methode zur Herstellung serieller ultradünner Schnitte von Mikroorganismen für die Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Technik ermöglicht hochaufgelöste dreidimensionale Zellstrukturanalysen ohne teure Geräte.

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Wir danken herzlichst Shigeo Kita für seine wertvollen Anregungen und Diskussionen. Wir danken auch John und Sumire Eckstein für ihre kritischen Lektüre des Manuskripts.

Hinweis: Die Proben, die in dieser Studie verwendet wurden, Mikroorganismen, schnell mit Propan in flüssigem Stickstoff eingefroren substituierte in Aceton, enthält 2 % Osmium ausgefällt und eingebettet in Epoxy Harz1,2,3Einfrieren, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. Vorbereitung der Trägerfolie (Abbildung 1-3)
Hinweis: Silberne Formvar Trägerfolie wird mit der auf Gußglas Methode19zubereitet.
<ol><li>100 mL 1,5 % zugeben Formvar in Ethylen Paraquatdichlorid zu einer Formvar-Herstellung-Apparatur (Abbildung 1). Tauchen Sie die Hälfte einer Glas-Folie (76 x 26 x 1,3 mm) in Formvar Lösung in der oberen Spalte des Geräts durch Drücken der Lösung mit Luft durch "a" mit einem Rubber Ball19.<ol>
<li>Lassen Sie die Lösung aus der Spalte durch die drei-Wege-Absperrhahn öffnen und loslassen Luft durch 'b', Druck zu verringern. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Gerät genommen und trockene Luft zu bilden einen Film auf der Oberfläche der Folie Glas. Verwenden Sie eine weißglühende Lampe zur Beschleunigung der Trocknung des Formvar Films.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nachdem die vier Kanten des Films auf dem Objektträger mit einer Rasierklinge (Abbildung 2a) abschaben, und atmen auf der Folie, die Trennung des Films aus der Folie20, zu erleichtern die Folie auf dem Wasser zu schweben, durch Eintauchen der Objektträger in der das Wasser langsam in einem niedrigen horizontalen Winkel (ca. 10°, Abb. 2 b).</li>
	<li>Schöpfe die Formvar Film aus dem Wasser mit einem Alu-Rack (30 x 25 x 3 mm) mit Löcher (4 mm Durchmesser) (Abb. 3a). Halten Sie das Gestell mit dem Formvar Film in den Exsikkator gestellt bis zur Verwendung (Abb. 3 b).</li>
</ol>2. Trimmen des Probe-Blocks mit einem Ultraschall trimmen Klinge und eine Rasierklinge 21 unter einem Stereomikroskop (Abbildung 4)
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass gibt es Zellen auf der Oberfläche des Blocks durch die Beobachtung der Spitze des Blocks mit einem Lichtmikroskop (Abbildung 4a).</li>
	<li>Montieren des Probe-Blocks in das Spannfutter (Block-Halter), und das Futter auf ein trimmen Bühne21 (Abbildung 4 b). Diese trimmen-Etappe hat einen Beleuchtung-Mechanismus von der Rückseite der Probe.</li>
	<li>Schneiden Sie den Block auf eine Größe von 0,7 mm x 1,0 mm (Abb. 4 c, 5d). Da das Epoxidharz sehr hart ist, schneiden Sie die Blöcke zuerst mit einem Ultraschall trimmen Klinge. Die Ultraschall trimmen Klinge ist eine neu eingeführte Maschine, und die Blöcke sind leicht getrimmt. Dann schneiden Sie den Block weiter mit einer Rasierklinge. Schneiden Sie eine Schulter markieren die Richtung des Schneidens (siehe Abbildung 5 d, Abbildung 8).</li>
</ol>(3) trimmen des Probe-Blocks mit Diamant Messer mit dem Mikrotom (Abbildung 5)
<ol><li>Inmitten des Probe Blocks Chuck Probenhalter für die regungsloses. Legen Sie die Probe 90° gegen den Uhrzeigersinn gegen die tatsächliche Position, wenn serielle ultradünnen Schnitt durchgeführt (siehe Abbildung 5-d).</li>
	<li>Schneiden Sie die Oberfläche des Blocks mit einem Diamant Trimmmesser (siehe Abbildung 5 d). Diamant Messerschneide parallel zur Fläche Probe-Block gesetzt, und schneiden Sie den Mindestbetrag der Probenoberfläche um nicht zu verlieren, jede Probe (Abb. 5D). Hinweis: Dieser Schritt ist getan, um die Probenoberfläche zu glätten. Der Teil der Probenoberfläche schlanke Teil intakt (daher dieser Teil ist nicht glänzend wie ein Spiegel, Abbildung 5 d), um keinen Teil der Probe für serielle Schnitt verlieren. Und zwar deshalb, weil das Muster auf der Oberfläche des Blocks ausgesetzt ist.</li>
	<li>Setzen Sie einen Spiegel (Mesa Schnitt, M) auf der Bühne Messer zum Schneiden von der Probe-Block (Abbildung 5 c) überwachen.</li>
	<li>Schneiden Sie den linken Rand (Dies wird die Oberseite, Abbildung 5 d, der Probe im seriellen Schnitt) des Blocks mit Trimmmesser durch rotierende Messer Stufe 30 ° nach links (Abb. 5a).</li>
	<li>Schneiden Sie die Block-Fläche an etwa 100 µm vom linken Rand der Probe (Dies wird die Unterseite der Probe in seriellen Schnitt, Abbildung 5 d) durch rotierende Messer Stufe 30 ° nach rechts (Abb. 5 b). Hinweis: Die Schnittserien schneidet sie aus dem schlanken Teil der Probe von etwa 90 nm x ca. 1 mm groß. Der Großteil wird zur Probenoberfläche und der Messerschneide anpassen, so dass sie parallel sind. Nach dem Einstellen der Probenoberfläche parallel zur Messerschneide sein, wird der große Teil mit einer Rasierklinge entfernt. Von oberen und unteren Rand der Probe mit dem Mikrotom schneiden, werden beide Seiten der Probe glatt und genau parallel zueinander (Abb. 5D), die ist notwendig, um gerade und ununterbrochene Band Abschnitte.</li>
</ol>4. anpassen der Probe Oberfläche und Messer Kante, so dass sie Parallel zu einander 21 Gesicht
<ol><li>Entfernen Sie das Schneidmesser, und drehen Sie den Probe Block 90° im Uhrzeigersinn.</li>
	<li>Legen Sie eine ultradünne Stationspunkte Messer auf der Messer-Bühne.</li>
	<li>Einstellen Sie die Probenoberfläche und der Messerschneide so, dass sie Parallel zueinander mit dem Großteil der Probenoberfläche konfrontiert. Hinweis: Der Großteil der Probe wird zur Einstellung verwendet, denn das Schneiden Gesicht des seriellen Schnitt so klein ist, macht es schwierig, Probe Oberfläche und Messer Rand mit diesen Teil nur, vor allem in vertikaler Richtung anpassen. So macht mit dem großen Teil der Probe Anpassung leicht.</li>
</ol>5. Verbreitung Neopren-Lösung auf die Probe-Block (Abbildung 6)
<ol><li>Um die Probe Futter an genau der gleichen Position wie die ursprüngliche Position zu platzieren, bringen Sie Klebeband auf das Futter und Futter Inhaber Mikrotom und schneiden Sie an der Grenze (Abb. 6a).</li>
	<li>Nehmen Sie das Präparat Chuck aus Mikrotom, und legen Sie es unter dem Stereomikroskop (Abb. 6 b). Schneiden Sie den Großteil der Probe mit einer Rasierklinge, indem man die schlanken Teil, unter dem Schnittserien erhältlich sind.</li>
	<li>Mit einer Pasteurpipette, fallen Sie ca. 1 µL 0,5 % Neopren Lösung (Abb. 6 b) auf die Probe, für serielle Schnitt verwendet werden, um den Abschnitt Seiten Klebstoff zu machen. Decken Sie die gesamte Probe mit Neopren-Lösung. Absorbieren Sie überschüssige Neopren Lösung sofort mit einem Stück Filterpapier in der Nähe der Probekörpers. Eine Band der Abschnitte ist essentiell für die Bilder von seriellen Zellteile und Neoprenkleber ist sehr nützlich für die Abschnitte zusammenkleben.</li>
	<li>3-Schlitz-Netze vorzubereiten (Größe der Schlitze: Mitte, 0,4 mm x 2,2 mm, beide Seiten 0,2 mm x 2,2 mm) (Abbildung 6 c) für die Abholung Schnittserien durch Biegen des Griffs der Netze 60°, behandeln die Netze mit 0,5 % Neopren-Lösung, und machen die Netze von hydrophilen Leuchten Sie Entlastung22.</li>
</ol>6. Herstellung Serienschnitte (Abbildung 7-9)
<ol><li>Ort der Probe Block Futter zurück in das Mikrotom an der gleichen Position wie 5.1 (Abb. 6a) durch Ausrichten der aufgezeichneten Teile. Dies hält die Block-Gesicht und die Messerschneide vollkommen parallel zueinander. Dann bringen Sie das Messer in der Nähe der Probe.</li>
	<li>Füllen Sie das Messer-Boot mit Wasser.</li>
	<li>Decken Sie das Mikrotom mit einer Kunststoff-Abdeckung, Luftstrom (Abbildung 7) zu verhindern. Hinweis: Luftstrom während der ultradünnen schneiden und Abruf der Abschnitte oft Probleme verursachen. Die Kunststoffabdeckung verfügt über drei Löcher: ein Loch ist für das Fernglas Objektive, und die beiden anderen Löcher sind für die Arme um den Betrieb zu ermöglichen, während der Deckel auf. Die hölzerne Armlehne dient für die Platzierung der Arme dabei heikle Arbeit, z. B. Abrufen von Schnittserien mit Gittern. Die hölzerne Armlehne befindet sich auf verschiedene Tabellen aus der Mikrotom-Tabelle (Abbildung 7, Pfeile), um nicht die Schwingung der Hände des Bedieners, Mikrotom zu übertragen.</li>
	<li>Fang an zu schneiden die Probe bei 200 nm Dicke (Abbildung 8). Einstellung bei 200 nm Dicke sparen Zeit, darin das Messer an der Oberfläche der Probe.</li>
	<li>Nach den ersten Schnitt gesetzt die Schnittdicke bis 70 nm (Abbildung 8).</li>
	<li>Wenn die Anzahl der Schnittserien erreicht 20 (genau gesagt, nach der Band erreicht etwa 1,8 mm; die Anzahl der Abschnitte abhängig von der Breite der Abschnitte variiert), setzen die Schnittdicke bis 10 nm (Abbildung 8) gleichzeitig schneiden. Hinweis: Da das Mikrotom 10 nm dicke Abschnitte schneiden kann, keine neuer Abschnitt erscheint, und die zuvor Zuschnitte von der Messerschneide getrennt werden. Es ist wichtig, um getrennte Abschnittsgruppen (Abbildung 9) für die Abholung Serienschnitte, Schwierigkeiten bei der Trennung von Abschnitten, die manuell über ein paar Haarsträhnen zu vermeiden. Da das Sichtfeld in der Transmissions-Elektronenmikroskop 2,0 mm ist, sollte Abschnitte höchstens 1,8 mm lang sein.</li>
	<li>Legen Sie die Schnittdicke bis 60 nm (Abbildung 8). Dies wird 70 nm Abschnitte (Abbildung 8) produzieren, weil die Maschine die letzten 10 nm Dicke hinzufügen wird.</li>
	<li>Legen Sie die Schnittdicke wieder auf 70 nm (Abbildung 8) und das Schneiden fortsetzen, bis 1,8 mm lange Abschnitte erhalten sind.</li>
	<li>Wiederholen Sie 6,6-6,8 bis fünf 1,8 mm lange Abschnitte (Abbildung 9) erreicht werden. Wir machen in der Regel fünf Abschnittsgruppen, da gibt es fünf Probenhalter in der Transmissions-Elektronenmikroskop in unserem Labor zur Verfügung, aber fünf nicht das Limit ist.</li>
</ol>7. Abholung Serienschnitte (Abbildung 10-12)
<ol><li>Legen Sie die "Abschnitt-Holding-Schleife"23 (innerer Durchmesser der Schleife: 5,0 mm) (Abb. 10a) auf die dritte Abschnittsgruppe (Abbildung 10). Hinweis: Es ist erforderlich, um die Abschnitte in der Reihenfolge ihrer schneiden zu fotografieren in der richtigen Reihenfolge abzurufen. Aber da auf dem Messer Boot gibt es fünf Abschnittsgruppen, ruft es oft verwirrend, welche Gruppen sind. Wenn Sie die Schleife auf der dritten Gruppe, wird klar, dass die beiden Gruppen in der Nähe der Betreiber sind die erste und zweite und entfernte zwei vom Betreiber sind die vierten und fünften Gruppen (Abbildung 10). Dadurch wird verhindert, die Reihenfolge vertauschen.</li>
	<li>Legen Sie "Wasser-Oberfläche-Erhöhung-Schleife"23 (WSRL, Innendurchmesser der Schleife: 4,0 mm) (Abb. 11a) auf der Bühne Messer (Abbildung 11 b). Die WSRL wird fest auf der Messer-Bühne stehen, weil es mit einem Magneten an der Unterseite ausgestattet.<ol>
<li>Legen Sie die Schleife der WSRL oberhalb der Schnittserien durch bewegte seinen Schaft und Griff. Senken Sie die Schlaufe des WSRL auf die Wasseroberfläche, so dass die Schleife in den Abschnitten umkreist.</li>
		<li>Drücken Sie die Schleife durch Drehen der Schraube nach unten, so dass die Wasseroberfläche durch Oberflächenspannung (Zahlen 11 c-d) auslöst. Verschieben Sie den Abschnitt in der Mitte der Schleife, positionieren Sie es an die Spitze des Wassers und passen Sie die Richtung des Abschnitts mithilfe einer Haar-Strang-21.</li>
		<li>Abschnittsgruppen durch Berührung mit einem nackten Schlitz-Raster, die von einer Pinzette gehalten und immer parallel zur Wasseroberfläche (Abbildung 11 d) abholen. Es ist wichtig für Abschnitte, das Netz zuerst berühren nicht das Wasser, um Abschnitte genau in der Mitte des Rasters (Abbildung 11 d) zu platzieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Gitter mit Abschnitten zusammen mit einem Tropfen Wasser auf Formvar Unterstützung Film16 (Abbildung 12), und entfernen Sie überschüssiges Wasser mit Filterpapier. Hinweis: Faltenbildung der die Trägerfolie ist oft ein Problem wenn Abschnitte mithilfe eines Rasters mit Trägerfolie abgeholt werden, weil Membran (Abschnitte) Membran (Trägerfolie) direkt berührt. Das Problem der immer Falten auf der Trägerfolie wird deutlich reduziert, indem ein Abschnitt tragenden Raster zusammen mit einem Tropfen Wasser auf die Formvar Unterstützung Film16.</li>
</ol>(8) Färbung Abschnitte16,24 (Abbildung 13)
<ol><li>Nach die Abschnitten vollständig getrocknet sind, reißen Sie den Formvar Film von rund um die Netze zu, und entfernen Sie die Gitter mit den Abschnitten.</li>
	<li>Legen Sie die Gitter in die Nut der die Färbung Rohr16 in der richtigen Reihenfolge (Abbildung 13), und Flecken Sie Abschnitte mit Uranyl Acetat und Blei Citrat24. Hinweis: Befindet sich eine Nut 0,6 mm tief entlang der Längsachse des Rohres mit einer Rasierklinge geschnitten. Die Röhre ist nützlich zur Vermeidung versehentlichen Bruch der Unterstützung Filme Verwendung einer Pinzette, da direkte Handhabung von Grids während der Färbung und waschen Prozess16 entfällt.</li>
</ol>9. Beobachtung der Schnittserien (Abbildung 14)
<ol><li>Legen Sie die 5 Raster im Multi-Probenhalter in der richtigen Reihenfolge (Bild 14a), Ausrichtung der Längsachse der Raster Schlitz senkrecht zur Probe Halter. Die Griffe (Pfeilspitzen) der Netze müssen nicht geschnitten werden, da die Raster-Fixierer die Griffe nicht berührt werden.</li>
	<li>Befestigen Sie die Gitter mit "Raster-Fixierer" (Abb. 14 b) und der Transmissions-Elektronenmikroskop einfügen Sie Probenhalter. Hinweis: Es ist oft nützlich, geringer Vergrößerung Bilder von allen Zellteile (Abbildung 15), interessante Mikroorganismen oder Zellen in gutem Zustand ohne Kontamination und mit gute Fixierung zu finden nehmen vor dem Fotografieren der Zielzelle.</li>
	<li>Machen Sie Fotos von den Zielzellen in allen Zellteile bei hoher Vergrößerung.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die hier vorgestellte Methode erfordert keine teure Ausrüstung. Es erfordert nur ein Alu-Rack (Abbildung 3), 3-Schlitz-Raster (Abbildung 6 c), Abschnitt-Holding Schleifen (Abb. 10a), Wasser-Oberfläche-Anhebung Schleife (Abbildung 11a) und eine Färbung Rohr (Abbildung 13). Es gibt viele Features des vorliegenden Verfahrens. Der große Teil der Probe wird verwendet, um die Pro...

Richtige ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik ist unerlässlich, um Zellen und Zellbestandteile dreidimensional auf mikroskopischer Ebene Elektron zu studieren. Wir haben untersucht die Dynamik der Spindel Pol Körper im Zellzyklus von Hefezellen und offenbart morphologische Veränderungen ihrer Ultrastruktur während des Zellzyklus und die Zeit von Doppelarbeit1,2,3, 4,5. Im Jahr 2006 haben wir ein neues Wort "Structome" durch die Kombination von "Struktur" geprägt und "-Ome", und als die 'quantitative und dreidimensionalen Strukturinformationen einer ganzen Zelle auf mikroskopischer Ebene Elektron' 6,7definiert.
Durch eine Structome Analyse, die ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik erfordert, wurde festgestellt, dass eine Hefezelle von Saccharomyces Cerevisiae und Exophiala Dermatitidis etwa 200.000 Ribosomen7,8, ein hatte Escherichia coli Zelle 26.000 Ribosomen9, Mycobacterium Tuberculosis Zelle hatte 1.700 Ribosomen10 und Myojin Spirale Bakterien hatten nur 300 Ribosomen11. Diese Informationen sind hilfreich bei der Abschätzung der nicht nur der Wachstumsrate in jedem Organismus, sondern auch bei der Identifizierung von Arten9.
Darüber hinaus Structome Analyse führte zu die Entdeckung eines neuen Organismus; Parakaryon Myojinensis fand in der Tiefsee vor der Küste Japans, deren Zellstruktur waren ein Zwischenprodukt zwischen denen der Prokaryoten und Eukaryoten12,13,14,15. Derzeit gilt die ultradünnen Stationspunkte Reihentechnik so schwer sein, dass es lange, zu meistern dauern würde. In dieser Studie haben wir eine zuverlässige Methode entwickelt, in der jemand serielle ultradünnen Schneiden problemlos durchführen kann.

<table><tbody><tr><td>Formvar Apparatur</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>652</td><td>B 180 x T 180 x H 300 mm</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Matsunami Co. Ltd., Osaka-76</td><td></td> <td>x 26 x 1,3 mm</td></tr><tr><td>Aluminiumgestell mit 4 mm Löchern</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>658</td><td>B 30 x T 25 x H 3 mm, Siehe dieses Dokument</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon Co. Ltd., </td><td></td><td>Tokyo-SMZ 645</td></tr><tr><td>LED-Beleuchtung für Stereomikroskop</td><td>Nikon Co. Ltd.,</td><td></td> <td>Tokyo-SM-LW 61 Ji</td></tr><tr><td>Trimmtisch</td><td>Sunmag Co.Ltd.,</td> <td>Tokyo-Kippmechanismus</td> <td>ausgestattet, Siehe dieses Papier</td></tr><tr><td>LED-Beleuchtung für Trimmtisch</td><td>Sunmag Co.Ltd.,</td> <td>Tokyo-Siehe</td> <td>dieses Papier</td></tr><tr><td>Ultraschall-Trimmklinge</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo</td><td>5240</td><td>EM-240, Siehe dieses Papier</td></tr><tr><td>Diamantmesser zum Trimmen</td><td>von Diatome Co. Ltd.,</td> <td>Schweiz-45</td><td>&deg;</td></tr><tr><td>Diamantmesser zum ultradünnen Schneiden</td><td>Diatome Co. Ltd.,</td> <td>Schweiz-45</td><td>&deg;</td></tr><tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica Microsystems,</td><td></td> <td>Wien-Ultracut S</td></tr><tr><td>Mesa-Schnitt</td><td>Leica Microsystems,</td> <td>Wien-Spiegel</td><td></td></tr> <tr><td>0,5 % Neopren W Lösung</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>605</td><td></td></tr><tr><td>Spezielles 3-Schlitz-Nickelgitter</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>2458</td><td>Siehe dieses Dokument</td></tr><tr><td>Spezielles 3-Schlitz-Kupfergitter</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>2459</td><td>Siehe dieses Dokument</td></tr><tr><td>Abschnittshalteschlaufe</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>526</td><td>Siehe dieses Dokument</td></tr><tr><td>Wasseroberflächen-Anhebungsschlaufe</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>527</td><td>Siehe dieses Papier</td></tr><tr><td>Färberohr</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>463</td><td>Siehe dieses Dokument</td></tr><tr><td>Mehrprobenhalter</td><td>JEOL Co. Ltd.,</td><td></td> <td>Tokyo-EM-11170</td></tr><tr><td>JEM-1400</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokio</td> <td>-</td> <td>Transmissionselektronenmikroskop</td></tr></tbody></table>

eine methode für den erhalt der ultradünnen serienschnitte von mikroorganismen im transmissions-elektronenmikroskopie

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Beobachtung von Zellen und Zellbestandteile in drei Dimensionen bei hoher Vergrößerung im Transmissions-Elektronenmikroskopie erfordert Vorbereitung ultradünne Schnittserien der Probe. Obwohl Vorbereitung ultradünne Schnittserien gilt als sehr schwierig sein, ist es ziemlich einfach, wenn die richtige Methode verwendet wird. In diesem Beitrag zeigen wir eine schrittweise Anleitung für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen sicher. Die wichtigsten Punkte dieser Methode sind: 1) verwenden Sie den großen Teil der Probe und Probe Oberfläche und Messer Rand anpassen, so dass sie parallel zueinander; (2) zu schneiden Schnittserien in Gruppen und vermeiden Schwierigkeiten beim trennen Abschnitte mit ein paar Haarsträhnen, wenn eine Gruppe von Serienschnitte auf den Schlitz-Netzen abgerufen werden; (3) zu verwenden, eine "Abschnitt-Holding-Schleife" und zu vermeiden, mischen Sie die Reihenfolge der Abschnittsgruppen; (4), verwenden Sie eine Wasser-Oberfläche-Erhöhung-Schleife, und stellen Sie sicher die Abschnitte auf der Spitze des Wassers positioniert sind und dass sie das Raster zuerst berühren, um sie in die gewünschte Position auf den Gittern zu platzieren; (5), verwenden Sie die Trägerfolie auf ein Aluminium-Gestell und machen es einfacher, die Abschnitte auf den Gittern zu erholen und zu vermeiden, von der Trägerfolie Faltenbildung; und 6) verwenden Sie eine Färbung zu vermeiden, versehentlich brechen die Unterstützung-Filme mit einer Pinzette. Diese neue Methode ermöglicht ultradünne Schnittserien ohne Schwierigkeiten. Die Methode ermöglicht die Zellstrukturen von Mikroorganismen mit hoher Auflösung in 3D, zu analysieren, die nicht mithilfe der automatischen Band sammeln regungsloses Methode und serielle Block-Gesicht oder fokussierten Ionenstrahl Rasterelektronenmikroskopie erreicht werden kann.

In diesem Protokoll wurden 3-Schlitz-Raster für die Abholung Schnittserien verwendet. Die Gitter sind aus Nickel oder Kupfer gefertigt. Die Schnittserien befinden sich auf den mittleren Schlitz. Die Schlitze auf beiden Seiten sind notwendig, um die Abschnitte anzuzeigen, wenn sie mit dem Netz aufnehmen. Um die Netze parallel mit der Schnittserien halten, wenn sie mit einer Pinzette (Abbildung 11 d) aufnehmen, ist der Griff gebogen (Abb. 6...

Diese Studie bietet zuverlässige und einfache Verfahren zur Erlangung von ultradünnen Schnittserien eines Mikroorganismus ohne teure Ausrüstung im Transmissions-Elektronenmikroskopie.

Eine Methode für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen im Transmissions-Elektronenmikroskopie

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Serienschnitte im Ultramikrotomverfahren sicher und einfach herzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, indem sie quantitative und dreidimensionale Strukturinformationen einer ganzen Zelle auf Elektronenmikroskop-Ebene liefert. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Herstellung von Serienschnitten im Ultramikrotomverfahren ohne teure Geräte durchgeführt werden kann und mit dieser Methode hochauflösende Bilder erzielt werden können.Um dieses Verfahren zu beginnen, reinigen Sie die Oberfläche eines Objektträgers. Tauchen Sie dann die eine Hälfte des Objektträgers in die 1,5 %ige Formvar-Lösung in der oberen Säule der Formvar-Trägerfolien-Herstellungsapparatur, indem Sie die Lösung mit Luft durch das Dreiweg-Hahnventil unter Verwendung eines Gummiballs pressen. Lassen Sie die Lösung aus der Säule ablaufen, indem Sie das Dreiweg-Hahnventil öffnen und die Luft entweichen lassen, um den Druck zu verringern.Entnehmen Sie dann die Objektplatte aus der Apparatur und trocknen Sie sie an der Luft, um einen Film auf der Oberfläche der Objektplatte zu bilden. Schaben Sie die vier Ränder des Films auf der Objektplatte mit einem Rasiermesser ab. Nachdem Sie auf die Platte geatmet haben, um die Trennung des Films von der Platte zu erleichtern, lösen Sie den Film, indem Sie die Objektplatte langsam unter einem flachen horizontalen Winkel ins Wasser eintauchen.Danach heben Sie den Formvar-Film mit einem aluminiumhaltigen Rack mit Löchern aus dem Wasser. Um den Probenblock mit einer Ultraschallschleifscheibe und einer Rasierklinge unter einem Stereomikroskop zu beschneiden, überprüfen Sie zunächst unter dem Lichtmikroskop die Blockspitze daraufhin, ob sich Zellen auf der Oberfläche des Blocks befinden. Danach montieren Sie den Probenblock in die Spannfutter und befestigen das Spannfutter auf einer Beschneideplattform.Schneiden Sie die Blöcke auf eine Größe von 0,7 bei 1,0 Millimetern zu. Falls das Epoxidharz sehr hart ist, schneiden Sie zuerst mit einer ultraschallbetriebenen Schneidklinge eine Vertiefung ein und führen anschließend die weitere Zurechtstutzung mit einer Rasierklinge durch. Schneiden Sie eine Schulter ab, um die Schneidrichtung zu markieren.Um den Probenblock mit einem Diamantschleifmesser am Mikrotom zu beschneiden, setzen Sie die Probenblockspanne in der Probenhalterung des Ultramikrotoms ein. Schneiden Sie die Oberfläche des Blocks mit einem Diamantschleifmesser ab. Richten Sie die Schneide des Diamantschleifmessers parallel zur Oberfläche des Probenblocks aus und schneiden Sie eine möglichst geringe Menge an Probenmaterial ab, um keinen Verlust der Probe zu verursachen.Schneiden Sie die linke Kante des Blocks mit dem Trimm-Messer, indem Sie den Messertisch um 30 Grad nach links drehen. Diese Kante wird die obere Seite der Probe beim seriellen Schneiden. Anschließend schneiden Sie die Blockoberfläche etwa 100 µm von der linken Kante der Probe entfernt, indem Sie den Messertisch um 30 Grad nach rechts drehen.Diese Kante wird die Unterseite der Probe beim Serienschnitten. Entfernen Sie das Trimmesser und drehen Sie den Probenblock um 90 Grad im Uhrzeigersinn. Bringen Sie ein Ultramikrotomschwert am Messertisch an.Stellen Sie die Probenoberfläche und die Messerkante so ein, dass sie parallel zueinander liegen, wobei Sie den größeren Teil der Probenoberfläche verwenden. Bringen Sie anschließend Klebeband auf der Spannbacke und der Spannbackenhalterung des Mikrotoms an und schneiden Sie das Band an der Grenzfläche durch. Nehmen Sie die Probenhalterung aus dem Mikrotom und platzieren Sie sie unter dem Stereomikroskop.Schneiden Sie mit einer Rasierklinge den größeren Teil der Probe ab und lassen Sie den schmalen Teil stehen, aus dem die Serienschnitte gewonnen werden sollen. Machen Sie die Schnittflächen klebrig, indem Sie mit einer Pasteurpipette etwa einen Mikroliter einer 0,5 %igen Neopren-Lösung auf die Probe auftragen, die für die Serienschnitte verwendet werden soll. Bedecken Sie anschließend die gesamte Probe mit der Neopren-Lösung. Saugen Sie überschüssige Neopren-Lösung sofort mit einem Stück Filterpapier auf, das in der Nähe der Probe platziert wird.Bereiten Sie anschließend drei Schlitzgitter zur Aufnahme serieller Schnitte vor. Biegen Sie hierzu den Griff der Gitter um 60 Grad und behandeln Sie die Gitter mit einer 0,5 %igen Neopren-Lösung. Anschließend machen Sie die Gitter durch Glutentladung hydrophil.Setzen Sie den Probeklotzhalter am Mikrotom an der gleichen Position wieder ein, indem Sie die markierten Stellen ausrichten. Dadurch verbleiben die Blockoberfläche und die Messerkante exakt parallel zueinander. Bewegen Sie anschließend das Messer nahe an die Probe heran.Nachdem das Messerboot mit Wasser gefüllt wurde, bedecken Sie das Mikrotom mit einer Plastikabdeckung, um Luftströmungen zu verhindern. Beginnen Sie mit dem Schneiden der Probe bei einer Schnittdicke von 200 Nanometern. Nachdem der erste Schnitt angefertigt wurde, stellen Sie die Schnittdicke auf 70 Nanometer ein.Wenn die Anzahl der seriellen Schnitte 20 erreicht, stellen Sie die Schnittdicke auf 10 Nanometer ein. Da das Mikrotom keine 10 Nanometer dicken Schnitte anfertigen kann, erscheint kein neuer Schnitt, und die zuvor geschnittenen Schnitte lösen sich von der Messerkante. Danach stellen Sie die Schnittdicke auf 60 Nanometer ein.Dadurch entstehen 70 Nanometer dicke Schnitte, da die Maschine die vorherige Dicke von 10 Nanometern hinzufügt. Stellen Sie abschließend die Schnittdicke wieder auf 70 Nanometer ein und fahren Sie mit dem Schneiden fort, bis 1,8 Millimeter lange Schnitte erhalten sind. Um die Serienschnitte aufzunehmen, platzieren Sie zuerst die Halteschleife für die Schnitte auf der dritten Schnittgruppe.Dann platzieren Sie die Wasseroberflächenanhebungs-Schleife auf der Messerbühne. Bringen Sie die Schleife der WSRL durch Bewegen ihres Schafts und Griffs direkt über die Serienschnitte an. Senken Sie die Schleife der WSRL auf die Wasseroberfläche ab, sodass die Schleife die Schnitte umschließt.Drücken Sie die Schleife nach unten, indem Sie die Schraube nach unten drehen, sodass die Wasseroberfläche durch die Oberflächenspannung angehoben wird. Bewegen Sie den Schnitt in die Mitte der Schleife. Positionieren Sie ihn auf der Spitze des Wassers und justieren Sie die Ausrichtung des Schnitts mit einem Haar.Heben Sie die Schnittgruppen auf, indem Sie sie mit einem blanken Schlitzgitter berühren, das mit einer Pinzette gehalten wird und parallel zur Wasseroberfläche bleibt. Platzieren Sie die Gitter mit den Schnitten zusammen mit einem kleinen Wassertropfen auf dem Formvar-Trägerfilm. Entfernen Sie überschüssiges Wasser mit Filterpapier.Nachdem die Schnitte vollständig getrocknet sind, reißen Sie den Formvar-Film um die Objektträger herum auf und entfernen Sie die Objektträger mit den Schnitten. Legen Sie die Objektträger in der richtigen Reihenfolge in die Nut des Färberohrs und färben Sie die Schnitte mit Uranylacetat und Bleicitrat. Setzen Sie die fünf Objektträger in der richtigen Reihenfolge in den Mehrfachpräparathalter ein, wobei die lange Achse des Schlitzes im Objektträger senkrecht zur Achse des Präparathalters ausgerichtet sein muss.Fixieren Sie das Raster mit Rasterfixiermitteln und fügen Sie den Probenträger in das Transmissionselektronenmikroskop ein. Machen Sie anschließend Aufnahmen der Zielzellen und aller Zellschnitte mit hoher Vergrößerung. Gezeigt ist hier eine Aufnahme mit niedriger Vergrößerung von fünf Rastern, die serielle Schnitte enthalten.18–25 Schnitte wurden auf einem Objektträger aufgebracht. Beachten Sie, dass die Schnitte miteinander verbunden sind und dieselbe Dicke aufweisen. Hier werden serielle Schnitte der Perikarion-Myogenese gezeigt.Die Abbildung zeigt 12 von 67 vollständigen Schnitten. Es wurde festgestellt, dass diese Zelle einen großen Nukleoid aufweist, der aus nackten DNA-Fasern besteht, mit einer einzigen Nukleoidmembran und Endosymbionten, die Bakterien ähneln, jedoch keine Mitochondrien enthält. Somit scheint dieses Organismus eine Zwischenform des Lebens zu sein, die sich vom Prokaryoten zum Eukaryoten entwickelt.Hier sind Serienschnitte von Escherichia coli dargestellt. Die Abbildung zeigt 12 vollständige Schnitte. Interessanterweise wurde festgestellt, dass diese Zelle 21.700 Ribosomen enthält.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man serielle ultradünne Schnitte anfertigt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Engineering

Ingenieurwesen

Quelle: Lutz, D., et.al.  Beurteilung der ultrastrukturellen Neuroplastizitätsparameter nach in utero-Transduktion des sich entwickelnden Mausgehirns und des Rückenmarks. J. Vis. Exp. (2019). Dieses Video zeigt die Präparation und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Analyse eines Gehirnschnitts eines Maus-Welpen. Das Protokoll beginnt mit Osmiumtetroxid-fixiertem Gewebe, das in Harz eingebettet ist, gefolgt von präzisem Trimmen zur Isolierung der interessierenden Region und Ultramikrotomie...

Ultrastrukturelle Analyse eines Schnitts aus dem Gehirn einer Maus mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Vorbereitung von Proben mit geringer Zellzahl für die Analyse der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).

Ein alternativer Ansatz für die Probenvorbereitung mit geringer Zellzahl für die TEM-Analyse

Dieser Bericht beschreibt ein Probenvorbereitungsprotokoll und spezifische Bildgebungsbedingungen für die Durchführung der Rastertransmissionselektronentomographie von dicken biologischen Proben.

Vorbereitung und Beobachtung von Dick biologischen Proben durch Scanning Transmission Electron Tomography

Hier bieten wir eine einfache, kostengünstige und zeitsparendes Protokoll zu chemisch fixieren Primaten Hirngewebe mit Acrolein Fixiermittel, so dass für die Langzeitarchivierung, die kompatibel mit vorge Einbettung Immunhistochemie für die Transmissionselektronenmikroskopie.

Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

Dieses Protokoll zielt auf bestimmte Zellen im Gewebe für die Bildgebung mit nanoskaligen Auflösung mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM). Große Anzahl von Schnittserien aus biologischem Material Harz eingebettet werden zuerst in einem Lichtmikroskop, das Ziel zu identifizieren und dann hierarchisch im SEM abgebildet.

Multimodale hierarchische Darstellung der Schnittserien für die Suche nach spezifischen zellulären Ziele innerhalb großer Mengen

Wir beschreiben, Fixierung, Paraffin einbetten und dünne Stationspunkte Techniken für mikrobielle Kolonie Biofilmen. In vorbereiteten Proben können Biofilm Unterkonstruktion und Reporter Expressionsmuster von Mikroskopie visualisiert werden.

Paraffin einbetten und dünn schneiden von mikrobiellen Kolonie Biofilmen für die mikroskopische Analyse

Wir präsentieren ein Protokoll zur Untersuchung der Verteilung von Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum in ganzen Zellen nach genetischer Veränderung mittels korrelativer Licht- und Volumenelektronenmikroskopie einschließlich Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung, serielle Steilerstellung von Zellen mit und ohne Zielgen im selben Abschnitt und serielle Bildgebung mittels Elektronenmikroskopie.

Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Hier zeigen wir, wie man das Sandwich-Gefriergerät zum schnellen Einfrieren von biologischen Proben verwendet, einschließlich Bakterien, Hefen, kultivierten Zellen, isolierten Zellen, tierischem und menschlichem Gewebe und Viren. Wir zeigen auch, wie man Proben für ultradünne Schnitte nach schnellem Einfrieren vorbereitet.

Schnelles Einfrieren mit Sandwich-Gefriergerät zur guten ultrastrukturellen Konservierung biologischer Proben in der Elektronenmikroskopie

Ein einfaches und umfassendes Protokoll, um dreidimensionale Details von Membrankontaktstellen zwischen Organellen in Hepatozyten aus der Leber oder Zellen in anderen Geweben zu erfassen.

Dreidimensionale Charakterisierung von interorganellen Kontaktstellen in Hepatozyten mittels serieller Schnittelektronenmikroskopie

Dieses Protokoll zielt darauf ab, detaillierte Verfahren zum Sammeln, Fixieren und Pflegen mykoheterotropher Pflanzenproben bereitzustellen, wobei verschiedene Mikroskopietechniken wie Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie, Licht-, Konfokal- und Fluoreszenzmikroskopie angewendet werden, um die Pilzbesiedlung in Pflanzengeweben und Samen zu untersuchen, die mit Mykorrhizapilzen gekeimt sind.

Mikroskopische Techniken zur Interpretation der Pilzbesiedlung in mykoheterotrophen Pflanzengeweben und der symbiotischen Keimung von Samen

Dieses Videoprotokoll veranschaulicht die Durchführung einer Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie von virologischen Proben. Für optimale Ergebnisse werden die Proben durch Hochdruckgefrieren und anschließende Gefriersubstitution vorbereitet.

Rastertransmissionselektronenmikroskopie-Tomographie in der Virologie: 3D-Bildgebung von unter hohem Druck eingefrorenen, gefriersubstituierten Proben

Erfahren Sie eine kostengünstige Methode zur Herstellung serieller ultradünner Schnitte von Mikroorganismen für die Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Technik ermöglicht hochaufgelöste dreidimensionale Zellstrukturanalysen ohne teure Geräte.

Eine Methode für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen im Transmissions-Elektronenmikroskopie

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