Eine Methode für den Erhalt der ultradünnen Serienschnitte von Mikroorganismen im Transmissions-Elektronenmikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, serielle ultradünne Schnitte sicher und einfach herzustellen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten, indem sie quantitative und dreidimensionale Strukturinformationen einer ganzen Zelle auf elektronenmikroskopischer Ebene liefert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass serielle ultradünne Schnitte ohne eine teure Maschine durchgeführt werden können und mit dieser Methode hochauflösende Bilder erhalten werden können.

Um diesen Vorgang zu starten, reinigen Sie die Oberfläche eines Objektträgers. Tauchen Sie dann eine Hälfte des Objektträgers in 1,5%ige Formvar-Lösung in die obere Säule der Formvar-Stützfilmherstellungsvorrichtung, indem Sie die Lösung mit einem Gummiball mit Luft durch den Dreiwegehahn drücken. Lassen Sie die Lösung aus der Säule ab, indem Sie den Dreiwege-Absperrhahn öffnen und Luft ablassen, um den Druck zu verringern.

Nehmen Sie dann den Objektträger aus dem Gerät und trocknen Sie ihn an der Luft, um einen Film auf der Oberfläche des Objektträgers zu bilden. Kratzen Sie die vier Kanten der Folie auf dem Objektträger mit einer Rasierklinge ab. Nachdem Sie auf den Objektträger geatmet haben, um die Trennung des Films vom Objektträger zu erleichtern, lassen Sie den Objektträger von der Folie abschwimmen, indem Sie den Objektträger langsam in einem niedrigen horizontalen Winkel in Wasser tauchen.

Schöpfen Sie dann die Formvar-Folie mit Hilfe eines Aluminiumrosts mit Löchern aus dem Wasser. Um den Probenblock mit einer Ultraschall-Trimmklinge und einer Rasierklinge unter einem Stereomikroskop zu trimmen, stellen Sie zunächst sicher, dass sich Zellen auf der Oberfläche des Blocks befinden, indem Sie die Spitze des Blocks mit einem Lichtmikroskop beobachten. Montieren Sie dann den Probenblock in das Futter und montieren Sie das Futter auf einem Frästisch.

Schneiden Sie die Blöcke auf eine Größe von 0,7 x 1,0 Millimetern zu. Wenn das Epoxidharz sehr hart ist, schneiden Sie die Box zuerst mit einer Ultraschall-Trimmklinge ab und schneiden Sie den Block dann mit einer Rasierklinge weiter ab. Schneiden Sie eine Schulter ab, um die Schnittrichtung zu markieren.

Um den Probenblock mit einem Diamantmesser mit dem Mikrotom zu beschneiden, setzen Sie das Probenblockfutter in den Probenhalter des Ultramikrotoms ein. Schneiden Sie die Oberfläche des Blocks mit einem Diamantschneidermesser ab. Setzen Sie die Diamantmesserkante parallel zur Fläche des Probenblocks und schneiden Sie die Probenoberfläche so gering wie möglich, um keine Probe zu verlieren.

Schneiden Sie die linke Kante des Blocks mit dem Entschnittmesser ab, indem Sie den Messertisch um 30 Grad nach links drehen. Diese Kante wird bei der seriellen Schnitterstellung zur Oberseite der Probe. Schneiden Sie dann die Blockfläche in einem Abstand von etwa 100 Mikrometern vom linken Rand der Probe ab, indem Sie den Messertisch um 30 Grad nach rechts drehen.

Diese Kante wird bei der seriellen Schnittung zur Unterseite der Probe. Entfernen Sie das Trimmmesser und drehen Sie den Probenblock um 90 Grad im Uhrzeigersinn. Setzen Sie ein ultradünnes Trennmesser auf die Messerstufe.

Stellen Sie die Probenoberfläche und die Messerkante so ein, dass sie mit dem großen Teil der Probenoberfläche parallel zueinander stehen. Kleben Sie dann Klebeband auf das Spannfutter und den Spannfutterhalter des Mikrotoms und schneiden Sie das Klebeband an der Grenze ab. Nehmen Sie das Probenfutter aus dem Mikrotom und legen Sie es unter das Stereomikroskop.

Schneiden Sie den größten Teil der Probe mit einer Rasierklinge ab und lassen Sie den schlanken Teil übrig, aus dem Serienschnitte gewonnen werden. Machen Sie die Schnittseiten klebend, indem Sie mit einer Pasteurpipette etwa einen Mikroliter 0,5% Neoprenlösung auf die Probe tropfen, die für die Serienschnitte verwendet werden soll. Bedecken Sie dann die gesamte Probe mit Neoprenlösung. Nehmen Sie überschüssige Neoprenlösung sofort mit einem Stück Filterpapier auf, das in der Nähe der Probe platziert wird.

Bereiten Sie als Nächstes drei Schlitzgitter für die Aufnahme von Serienschnitten vor. Biegen Sie dazu den Griff der Gitter um 60 Grad und behandeln Sie die Gitter mit 0,5%iger Neoprenlösung. Machen Sie dann die Gitter durch Glimmentladung hydrophil

Setzen Sie das Probenblockfutter in der gleichen Position wieder in das Mikrotom ein, indem Sie die geklebten Teile ausrichten. Dadurch bleiben die Blockfläche und die Messerschneide perfekt parallel zueinander. Bringen Sie dann das Messer nahe an die Probe.

Nachdem Sie das Messerschiffchen mit Wasser gefüllt haben, decken Sie das Mikrotom mit einer Plastikabdeckung ab, um einen Luftstrom zu verhindern. Beginnen Sie mit dem Schneiden der Probe bei einer Schnittdicke von 200 Nanometern. Nachdem der erste Abschnitt geschnitten wurde, stellen Sie die Schnittdicke auf 70 Nanometer ein.

Wenn die Anzahl der seriellen Abschnitte 20 erreicht, stellen Sie die Querschnittsdicke auf 10 Nanometer ein. Da das Mikrotom keine 10 Nanometer dicken Abschnitte schneiden kann, entsteht kein neuer Schnitt, und die zuvor geschnittenen Abschnitte werden von der Messerkante getrennt. Legen Sie als Nächstes die Schnittdicke auf 60 Nanometer fest.

Dadurch werden 70-Nanometer-Abschnitte hergestellt, da die Maschine die vorherigen 10 Nanometer Dicke hinzufügt. Stellen Sie abschließend die Schnittdicke auf 70 Nanometer zurück und fahren Sie mit dem Schneiden fort, bis 1,8 Millimeter lange Abschnitte erhalten sind. Um die seriellen Abschnitte aufzunehmen, platzieren Sie zuerst die Abschnittshalteschlaufe auf der dritten Abschnittsgruppe.

Platzieren Sie dann die Schlaufe zum Anheben der Wasseroberfläche auf dem Messertisch. Platzieren Sie die Schlaufe der WSRL knapp über den seriellen Abschnitten, indem Sie den Schaft und den Griff bewegen. Senken Sie die Schlaufe der WSRL auf die Wasseroberfläche, so dass die Schlaufe die Abschnitte umschließt.

Schieben Sie die Schlaufe nach unten, indem Sie die Schraube nach unten drehen, so dass die Wasseroberfläche durch die Oberflächenspannung angehoben wird. Verschieben Sie den Abschnitt in die Mitte der Schleife. Positionieren Sie es auf dem Scheitelpunkt des Wassers und passen Sie die Richtung des Abschnitts mit einer Haarsträhne an.

Sie Abschnittsgruppen auf, indem Sie sie mit einem blanken Schlitzgitter berühren, das mit Hilfe einer Pinzette parallel zur Wasseroberfläche gehalten wird. Legen Sie die Gitter mit Abschnitten zusammen mit einem winzigen Tropfen Wasser auf die Formvar-Trägerfolie. Entfernen Sie überschüssiges Wasser mit Filterpapier.

Nachdem die Abschnitte vollständig getrocknet sind, reißen Sie die Formvar-Folie um die Gitter herum; und entfernen Sie die Gitter, die die Abschnitte tragen. Legen Sie die Gitter in die Rille des Färberohrs in die richtige Reihenfolge und färben Sie die Abschnitte mit Uranylacetat und Bleicitrat. Setzen Sie die fünf Raster im Mehrprobenhalter in die richtige Reihenfolge, indem Sie die Längsachse des Rasterschlitzes senkrecht zur Achse des Probenhalters ausrichten.

Befestigen Sie das Gitter mit Gitterfixierern und setzen Sie den Probenhalter in das Transmissionselektronenmikroskop ein. Fahren Sie mit der Aufnahme von Bildern der Zielzellen und aller Zellabschnitte bei hoher Vergrößerung fort. Hier sehen Sie eine Ansicht von fünf Rastern mit geringer Vergrößerung, die serielle Schnitte tragen.

Auf einem Gitter wurden 18-25 Sektionen montiert. Beachten Sie, dass die Abschnitte miteinander verbunden sind und die gleiche Dicke haben. Hier sind serielle Schnitte der Perikarionmyogenese dargestellt.

Die Abbildung zeigt 12 von 67 vollständigen Abschnitten. Es wurde festgestellt, dass diese Zelle ein großes Nukleoid hat, das aus nackten DNA-Fasern mit einer einzigen Nukleoidmembran und Endosymbionten besteht, die Bakterien ähneln, aber keine Mitochondrien. Somit scheint dieser Organismus eine intermediäre Lebensform zu sein, die sich vom Prokaryoten zum Eukaryoten entwickelt.

Hier sind serielle Schnitte von Escherichia coli zu sehen. Die Abbildung zeigt 12 vollständige Abschnitte. Interessanterweise wurde festgestellt, dass diese Zelle 21.700 Ribosomen enthält.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man serielle ultradünne Schnitte erstellt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.