Name: Mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay und Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Lernen Sie die Bestimmung der mitochondrialen Ca²⁺-Retention und Ca²⁺-induzierten mitochondrialen Schwellung in isolierten Mitochondrien aus SH-SY5Y-Zellen. Diese einfache Methode ermöglicht die Untersuchung mitochondrialer Dysfunktion und zellulärer Energetik.

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Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse von Grant der herausragende Wissenschaftler von Shandong (JQ201421) und Zuschuss von NSFC (81371226).

1. Isolation von Mitochondrien
Hinweis: Alle Lösungen und Geräte sollten auf 0 - 4 ° C vorgekühlt und auf Eis gehalten werden.
<ol><li>Samen etwa 3 x 106 SH-SY5Y Zellen pro 10 cm Zelle Kulturschale. Zellkulturen in hoch-Glukose Dulbecco modifizierten Eagle Medium mit 10 % fötalen Rinderserum, Penicillin (100 U/mL)-Streptomycin (100 µg/mL). Bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5 % CO2 über Nacht behalten. Hinweis: mindestens 1-2 x 107 SH-SY5Y Zellen für jedes Assay Isolierung erforderlich sind.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit etwa 1 mL Eis kaltem PBS in einer Kulturschale 10 cm Zelle 3 Mal zu.</li>
	<li>Fügen Sie neue 1 mL Eis kaltem PBS in 10 cm Zelle Kulturschale und kratzen Sie die adhärenten Zellen in eine neue 1,5 mL Tube. Zentrifuge bei 800 X g für 10 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Während der Zentrifugation bereiten Sie 5 mL mitochondriale Isolierung Puffer (250 mM Saccharose, 10 mM KCl, 10 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazin-Ethanesulfonic Säure), 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) ergänzt mit 50 μL der Protease-Inhibitoren Lager Lösung (100 X Konzentration; 1 EDTA-freie Tablette aufgelöst in 500 µL DdH2O).</li>
	<li>Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Pellet mit 1 mL der mitochondrialen Isolierung Puffer. Inkubieren der 1,5 mL Tube für 30 min auf Eis.</li>
	<li>Lösen Sie die suspendierten Zellen mit einer Glas-Homogenisator (15-25 Schläge) rauf und runter manuell auf Eis. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass es gibt keine Luftblasen, wenn Zellen homogenisiert werden. Zählen die intakte Zellen und entblößten Kerne von Mikroskop optisch und bestätigen, dass > 90 % Zelle Bruch aufgetreten.</li>
	<li>Übertragen Sie das Homogenat in einem 1,5 mL-Tube und Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min bei 4 ° C, die Ablagerungen (Kerne und verbleibenden intakten Zellen) zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen den überstand in ein neues 1,5 mL-Tube und Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min 4 ° C.</li>
	<li>Den überstand zu übertragen, zu einem neuen Schlauch und Zentrifuge bei 14.000 x g für 15 min 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen des Überstands und das Pellet mit Mitochondrien mit 1 mL der mitochondrialen Isolierung Puffer Aufschwemmen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Lösung für 15 min bei 14.000 x g 4 ° C um die Mitochondrien auszufällen.</li>
	<li>Das daraus resultierende Mitochondrien Pellet muss ständig auf Eis und Nukleinsäuretablette in 50-100 μl KCl Medien (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 5 mM Glutamat, 5 mM Malate, und 2 μM Rotenon, pH 7,4) entsprechend dem Pellet-Volumen vor jedem Arsch ay.</li>
	<li>Verwenden Sie 5 μL der mitochondrialen Lösung zur Messung der mitochondrialen Proteinkonzentration von standard BCA-Test, Messung der OD562 mit einer Platte Leser13.</li>
</ol>2. Bestimmung der mitochondrialen Ca2 + Rückhaltevermögen
<ol><li>Bereiten Sie die KCl-Medien und fügen Sie die Ca2 +-Bindung grünen fluoreszierenden Farbstoff, eine Endkonzentration von 0,5 μM vor dem Experiment.</li>
	<li>1 mL der isolierten Mitochondrien (0,4 mg/mL) in KCl Medien mit 0,5 μM Ca2 +Transfer-grünen fluoreszierenden Farbstoff in jedem 6-Well-Platte auch verbindlich.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mitochondrien und die Ca2 +-Bindung grünen fluoreszierenden Farbstoff in der 6-Well-Platte bei Raumtemperatur geschützt vom Umgebungslicht für 1 min. hinzufügen 4 μL Aliquote eines 20 mm CaCl2 -Lösung (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 20 mM HEPES, Glutamat 5 mM, 5 mM-Malat, pH 7,4) zu jedem 6-Well-Platte verzichten nun mit Hilfe den automatischen Einstellung 200 Nmol Ca2 +/mg mitochondrialen Proteins einzuführen.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Fluoreszenz-Spektrometer, um die Fluoreszenz-Änderungen zu überwachen alle 3 s 2 min mit einer Wellenlänge von Erregung von 506 nm und einer Emissionswellenlänge von 531 nm. Die Platte ist ausgestattet mit schütteln bei 600 u/min für 3 s zwischen den Lesungen von Software (Abbildung 1) gesteuert.</li>
	<li>Fügen Sie eine zusätzliche 4 μL aliquoten 20 mM CaCl2 -Lösung in jede Vertiefung und überwachen den Fluoreszenz Änderungen alle 3 s für 2 min. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Fluoreszenz mit der Zeit zunimmt. Hinweis: Mitochondrien sind mit der zusätzlichen Ca2 + gekennzeichnet durch die erhöhte Aufnahme Fluoreszenz gefordert. Wenn die mPTP geöffnet wird, steigt die Fluoreszenz mit der Zeit.</li>
	<li>Interpretieren Sie den Gesamtbetrag von Ca2 + hinzugefügt, bis die mPTP als Ca2 + Rückhaltevermögen öffnet.</li>
</ol>3. Ermittlung der Ca 2 +-induzierten mitochondrialen Schwellung
<ol><li>Bereiten Sie die KCl-Medien vor dem Experiment.<ol>
<li>Übertragen Sie 1 mL isolierte Mitochondrien (0,4 mg/mL) in KCl Medien gut in jedes 6-Well-Platte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 10 μl 20 mm CaCl2 wässrige Lösung (500 Nmol/mg mitochondrialen Proteins) in mitochondrialen Proteins mitochondriale Schwellung auslösen.</li>
	<li>Aufzeichnen den Rückgang der Extinktion bei 540 nm alle 3 s auf einer Mikrotestplatte Reader Software für 10 min (Abbildung 2) gesteuert. Die Fluoreszenz-Änderungen werden durch den Zuzug von gelösten Stoffen durch die innere mitochondriale Membran verursacht. Hinweis: Die verminderte Absorption bei 540 nm entspricht den geschwollenen Mitochondrien. Wenn der Leser keine Abnahme der Absorption beachten, kann eine längere Intervall lesen oder Lesezeit übernommen werden.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+respiratory+stimulation%2C+accumulation+of+Ca%2B%2B+and+phosphate%2C+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li>
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<li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li>
<li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+ions+in+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li>
<li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium+and+cell+death%3A+a+deadly+triad+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li>
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<li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+free+calcium+levels+%28Rhod-2+fluorescence%29+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li>
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<li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li>
<li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li>
<li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca%282%2B%29+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li>
</ol>

X. Sonne überwacht die Experimente. Wei Li durchgeführt die Experimente. Chen Zhang und X. Sun schrieb die Zeitung.

Wir beschrieben hier, ein einfaches und effektives Protokoll für die mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay und Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst.
Stellen Sie für die mitochondriale Isolierung sicher, dass alle Materialien und Rohre auf Eis, besonders wenn die Zellen zu homogenisieren. 0,25 % Trypsin-EDTA kann auch verwendet werden, um Zellen aus der Schale für 5 min bei 37 ° c zu lösen Nach 15-25 Schlägen ist es notwendig, die intakte Zellmembran un...

Mitochondrien sind die zellulären Hauptorgane, fast 95 % der verwendeten in den Säugetier-Zellen durch Oxidative Phosphorylierung ATP zu produzieren. Es wird berichtet, dass die abgesonderten mikromolaren Konzentration von Ca2 + von Mitochondrien, die Anwesenheit von ADP und anorganischem Phosphat ADP zu ATP-Synthese1phosphorylieren verwendet werden können. Wenn die Konzentration der cytosolischen Ca2 + einen Schwellenwert überschreitet, Mitochondrien können Aufnahme Ca2 + schnell und Ausfluss es langsam. So können die funktionierenden Mitochondrien Zustrom der erhöhten cytosolischen Ca2 +. Irrelevant für die Teilnahme an der Oxidative Phosphorylierung, die mitochondriale Ca2 + auch an der cytosolischen kalziumsignale teilnehmen und aktivieren den mitochondrialen Apoptose-Mechanismus durch Induktion die Eröffnung der mPTP in der inneren mitochondrialen Membran-2. Es wurde allgemein anerkannt, dass abnorme Erhöhung der intrazellulären Ca2 + mitochondriale massive Schwellung hervorrufen kann, durch die Eröffnung der mPTP-3. So, dieses Protokoll zielt darauf ab, die Funktion der Mitochondrien zu bewerten, indem Sie die Quantifizierung der mitochondrialen Ca2 + Rückhaltevermögen und Ca2 +-trigged mitochondriale Schwellung.
Ca2 + Rückhaltevermögen ist das Maß für die Fähigkeit der Mitochondrien zur Aufnahme zytosolischen Kalzium. Mitochondrien können Puffer freie zytosolischen Kalzium und Kalzium-abhängigen zellulären Prozesse zu regulieren, indem Calciumaufnahme in Form von inaktiven Ausscheidungen. Beeinträchtigt Ca2 + Rückhaltevermögen tritt in Stress-Erscheinungen, die mit Energie-Begrenzung und auch Neurodegenerative Krankheiten4,5. Isolierte Mitochondrien oder Digitonin-permeabilized Zellen eingesetzt werden, um die Ca2 + Rückhaltevermögen zu identifizieren, und die erhöhte Fähigkeit zu akkumulieren Ca2 + durch isolierte Mitochondrien mit dem Additonal Glutamat und Malat erfolgt nicht durch die Mitochondriale Isolierung Verfahren6. Eine betitelten Menge an Digitonin sollte verwendet werden, um die Plasmamembranen von verschiedenen Zelltypen permeabilize. Das Hexapotassium Salz der Ca2 +-Bindung grünen fluoreszierenden Farbstoff, Ca2 +-sensible Zelle-impermeant Licht-erregbare Sichtanzeige, wurde weit verbreiteten7. Ca2 +-Bindung grün fluoreszierenden Farbstoff ist ein Low-Affinität-Indikator und verwendet, um anzuzeigen, dass intrazelluläre freie Ca2 + Konzentrationen im steigen weiter (5 min) Stimulationen8verlängert. Diese Methode war weniger empfindlich als die radioaktive Filtertechnik aber wesentlich vereinfacht. Das zusätzliche Ca2 + Kalzium grüne Fluoreszenz erhebt und die Ca2 + Aufnahme von Mitochondrien kehrt die Fluoreszenz Baseline. Fortlaufende Ergänzungen von Ca2 + wurden vorgenommen, bis die Mitochondrien zur Aufnahme Extramitochondrial Ca2 + 9nicht. Ein Fluoreszenz Mikrotestplatte Leser lässt sich regelmäßig Kalzium grüne Fluoreszenz Berichten.
Nach Ca2 + Akkumulation Mitochondrien depolarisiert, Ca2 + in das Medium abgegeben und begann anzuschwellen. Ca2 +-Mitochondrien Schwellung verwendet wird, um die mPTP Öffnung zeigen ausgelöst. Elektronenmikroskopie und die Abnahme der leichten Extinktion bei 540 nm kann verwendet werden, um die Ca2 +Messen-mitochondriale Schwellung10,11ausgelöst. Mitochondrien Volumen kann direkt durch nach vorne Winkel Lichtstreuung12, ermittelt werden, wo sinkt in die Extinktion passive Schwellung der mitochondrialen Matrix widerspiegeln.
Hier zeigen wir die Methodik zur Prüfung der mitochondrialen Ca2 + Rückhaltevermögen und Ca2 +-mitochondriale Schwellung in isolierten Mitochondrien aus SH-SY5Y Zellen ausgelöst.

<table><tbody><tr><td>SH-SY5Y Zelllinie</td><td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td><td>ATCC-Nummer: CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Calcium grün-5N</td><td>Life Technologies</td><td>c-3737</td><td>Ca2+-bindender grüner Fluoreszenzfarbstoff</td></tr><tr><td>vollständige Proteaseinhibitoren</td><td>Roche Molecular Biochemicals</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Glashomogenisator</td><td>Kimble Chase</td><td>9885303002</td><td></td></tr><tr><td>Glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES5063G-A7</td><td></td></tr><tr><td>Malat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46940-U</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>00457</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900050</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Blitzgeräte</td><td>Thermo Scientific</td><td>IC100E</td><td></td></tr><tr><td>Bongkrekate</td><td>Biovision</td><td>1820-100</td><td></td></tr><tr><td>Atractylosid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4992</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco mit hohem Glukosegehalt s modifiziertes Eagle Medium</td><td>Hyclone</td><td>SH30022</td><td>4,5 g/L Glukose, L-Glutamin, ohne Natriumpyruvat</td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Hyclone</td><td>SV30087</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>11860-038</td><td></td></tr><tr><td>BCA Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>NCI3225CH</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Zellkulturschale</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondriale ca2 + retention kapazität assay und ca2 +-mitochondriale schwellung assay ausgelöst

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

Die Produktion von ATP durch Oxidative Phosphorylierung ist die primäre Funktion der Mitochondrien. Mitochondrien in den höheren Eukaryotes auch an cytosolischen Ca2 + Pufferung und die ATP-Produktion in Mitochondrien kann durch intramitochondrial frei Ca2 + Konzentration vermittelt werden. Ca2 + Rückhaltevermögen kann als die Fähigkeit der Mitochondrien, Kalzium in der mitochondrialen Matrix zu behalten. Kumulierte intrazellulären Ca2 + führt zu der Durchlässigkeit der inneren mitochondrialen Membran bezeichnet die Öffnung des mitochondrialen Permeabilität Übergang Pore (mPTP), was dazu führt, das Austreten von Molekülen mit einer molekularen Gewicht weniger als 1,5 kDa. Ca2 +-Mitochondrien Schwellung verwendet wird, um die mPTP Öffnung zeigen ausgelöst. Hier beschreiben wir zwei Tests untersuchen die Ca2 + Rückhaltevermögen und Ca2 +-mitochondriale Schwellung in isolierten Mitochondrien ausgelöst. Nach bestimmten Mengen von Ca2 + werden hinzugefügt, können alle Schritte innerhalb eines Tages abgeschlossen und von einer Mikrotestplatte Leser aufgenommen. Somit können diese zwei einfachen und effektiven Assays ergriffen werden, um die Ca2 +bewerten-mitochondriale Funktionen.

Ca2 + Rückhaltevermögen Vertreter folgendes Ergebnis: Die Ergebnisse wurden als Fluoreszenz-Werte. Mit der zusätzlichen Impulsen von Ca2 + (200 Nmols/mg mitochondrialen Proteins), die Fluoreszenz durch doppelte über dem Ausgangswert mit der Eröffnung von mPTP erhöht. 5 μM Bongkrekate (BKA), ein Inhibitor von Ca2 +-induzierte mPTP Öffnung oder 1 μM Atractyloside (ATR), Aktivator von Ca2 +-induzierte mPTP Öffnung, wurden in den isolier...

Dieses Protokoll zielt darauf ab, beschreiben eine Methode zur Prüfung der Ca2 + Rückhaltevermögen und Ca2 +- ausgelöst mitochondriale Schwellung des isolierten Mitochondrien von SH-SY5Y Zellen Schritt für Schritt.

Mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay und Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die mitochondriale Kalzium-Retentionskapazität bei kalziuminduzierter mitochondrialer Schwellung zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen bei der Untersuchung mitochondrialer Dysfunktionen zu beantworten, wie beispielsweise abnormale Energiestoffwechselvorgänge. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie sehr einfach und effektiv ist.Beginnen Sie damit, etwa drei Millionen SH-SY5Y-Zellen pro 10-Zentimeter-Zellkulturschale auszusäen. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen dreimal mit jeweils etwa einem Milliliter eiskalter PBS in einer 10-Zentimeter-Zellkulturschale. Geben Sie ein Milliliter eiskalte PBS in die 10-Zentimeter-Zellkulturschale und lösen Sie die anhaftenden Zellen ab, indem Sie sie in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen abkratzen.Zentrifugieren Sie bei 800 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Während der Zentrifugation bereiten Sie fünf Milliliter mitochondriales Isolierpuffer, ergänzt mit 50 Mikrolitern Proteaseinhibitor-Stocklösung, vor. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter mitochondrialem Isolierpuffer.Den 1,5-Milliliter-Röhrchen 30 Minuten auf Eis inkubieren. Anschließend die suspendierten Zellen mit einem Glas-Homogenisator manuell auf und ab bewegen, währenddessen auf Eis gehalten wird. Das Homogenat in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen.Anschließend bei 1.000 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren, um den Zelltrümmer zu entfernen. Nach der Zentrifugation das Überstandsvolumen in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen und erneut wie zuvor zentrifugieren. Nach dem Überführen des Überstandes in ein neues Röhrchen bei 14.000 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet, das Mitochondrien enthält, in einem Milliliter mitochondrialem Isolierungspuffer. Zentrifugieren Sie die Lösung anschließend 15 Minuten bei 14.000 × g und vier Grad Celsius, um die Mitochondrien zu präzipitieren. Das erhaltene Mitochondrien-Pellet muss auf Eis gehalten und vor jedem Assay je nach Pelletvolumen in 50 bis 100 Mikroliter Kaliumchlorid-Medium resuspendiert werden.Verwenden Sie abschließend fünf Mikroliter der mitochondrialen Lösung, um die mitochondriale Proteinkonzentration mittels standardmäßiger BCA-Assay-Methode zu bestimmen, wobei der OD562 mit einem Plattenreader gemessen wird. Bereiten Sie das Kaliumchlorid-Medium vor und geben Sie den kalziumbindenden grün fluoreszierenden Farbstoff in einer Endkonzentration von 0,5 Mikromolar vor dem Experiment hinzu. Um die mitochondriale Kalzium-Retentionskapazität zu bestimmen, überführen Sie zunächst ein Milliliter isolierter Mitochondrien in Kaliumchlorid-Medium, das 0,5 Mikromolar kalziumbindenden grün fluoreszierenden Farbstoff enthält, in jede Vertiefung einer sechswelligen Platte.Die Mitochondrien und den kalziumbindenden grün fluoreszierenden Farbstoff in der 6-Loch-Platte bei Raumtemperatur für eine Minute vor Inkubation vor Umgebungslicht geschützt inkubieren. Nach der Inkubation vier Mikroliter Aliquote der 20 Millimolar Kalziumchloridlösung unter Verwendung der automatischen Dosiereinstellung zu jedem Loch der 6-Loch-Platte hinzufügen, um 200 Nanomol Kalzium pro Milligramm mitochondrialem Protein zuzugeben. Mit dem Fluoreszenzspektrometer alle drei Sekunden für zwei Minuten die Fluoreszenzänderungen bei einer Anregungswellenlänge von 506 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 531 Nanometern überwachen.Die Platte ist mit einer Schüttelung bei 600 U/min für drei Sekunden zwischen den Messungen ausgestattet, die über eine Software gesteuert wird. Geben Sie eine zusätzliche Portion von vier Mikroliter 20-Millimolar-Calciumchloridlösung zu jedem Brunnen hinzu und überwachen Sie anschließend alle drei Sekunden zwei Minuten lang die Änderungen der Fluoreszenz. Um die durch Calcium induzierte mitochondriale Schwellung zu bestimmen, überführen Sie ein Milliliter isolierter Mitochondrien in Kaliumchlorid-Medium in jeden Brunnen einer sechs-Loch-Platte.Dann 10 µL einer 20 mM wässrigen Calciumchloridlösung zum mitochondrialen Protein hinzufügen, um eine mitochondriale Schwellung auszulösen. Mit einem durch Software gesteuerten Mikroplattenreader die Abnahme der Extinktion alle drei Sekunden über einen Zeitraum von 10 Minuten bei 540 nm aufzeichnen. Hier sind repräsentative Ergebnisse der mitochondrialen Kalzium-Retentionskapazität von Bongkrekinsäure, einem Inhibitor der kalziuminduzierten mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangs-Pore (MPTP), Atractylosid, einem Aktivator der kalziuminduzierten MPTP-Öffnung, sowie einer Leerprobe als Kontrolle dargestellt.Die Kapazität in der Bongkrinsäure-Behandlung ist, wie erwartet, deutlich höher als in der Atractylosid-Gruppe. Hier werden repräsentative Ergebnisse der kalziuminduzierten mitochondrialen Schwellung unter Bongkrinsäure, Atractylosid und der unbehandelten Kontrolle gezeigt. Die abgenommene Extinktion, gemessen bei 540 Nanometern, weist auf mitochondriale Schwellungen hin.Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass BKA die Öffnung des MPTP hemmen kann, während ATR die Öffnung des MPTP fördern kann. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von fünf Stunden durchgeführt werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, alle Lösungen auf Eis zu halten.

mitochondrial-ca2-retention-capacity-assay-ca2-triggered

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeit-Messung der mitochondrialen Kalzium-Flüsse durch Fluoreszenz-Imaging. Das Verfahren nutzt ein zirkular permutiert YFP-basierte Dual-Anregung ratiometrische Calcium-Sensor (ratiometrisch PERICAM-mt) selektiv in den Mitochondrien zum Ausdruck gebracht.

Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Ein spektrofluorometrischen Protokoll für die Messung der mitochondrialen Permeabilitätsübergang Porenöffnung in isolierten Maus-Mitochondrien wird hier vorgestellt. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von Mitochondrien...

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

Dieses Video beschreibt einen auf Plattenlesern basierenden Assay zur Messung der mitochondrialen Kalziumaufnahme in isolierten Mitochondrien. Der Assay analysiert das Fluoreszenzsignal eines kalziumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs, um die Kinetik der mitochondrialen Kalziumaufnahme und der Kalziumüberladung zu untersuchen.

Mitochondrial Calcium Uptake Assay: Eine auf Plattenlesern basierende Methode zur Messung der Kalziumaufnahme in isolierten Mitochondrien

Dieses Video beschreibt einen auf konfokaler Mikroskopie basierenden Assay zur Messung der mitochondrialen Kalziumaufnahme in kultivierten Zellen. Der Assay verwendet den calciumsensitiven Fluoreszenzfarbstoff Rhod-2/AM zur Messung des mitochondrialen Calciums in permeabilisierten kultivierten Zellen.

Calcium-Influx-Assay zur Messung der mitochondrialen Calciumaufnahme in kultivierten Zellen

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Beurteilung der mitochondrialen Kalziumretentionskapazität durch Überwachung von Echtzeitänderungen der Fluoreszenz bei der Kalziumaufnahme der Mitochondrien. Dieser Assay ist nützlich für die Untersuchung der mitochondrialen Funktion und kalziumbezogener Prozesse, einschließlich Apoptose und neurodegenerativer Erkrankungen.

Bestimmung des Calciumretentionsvermögens isolierter Mitochondrien

Mitochondria kann das elektrochemische Potential über ihre innere Membran (Δ &amp; psi; m) verwenden , Calcium (Ca 2+) zu maskieren, so dass sie cytosolischen Ca 2+ zu formen innerhalb der Zelle signalisiert. Wir beschreiben ein Verfahren zum gleichzeitigen Messen Mitochondrien Ca 2+ -Aufnahme und ΔΨ m in lebenden Zellen Fluoreszenzfarbstoffe und konfokale Mikroskopie.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle zur Messung der mitochondrialen Ca2 + Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen. Für isolierte Mitochondrien wir ausführlich einen Platte Leser-basierte Ca2 + Import Assay mit Ca2 + sensible färben Kalzium grün-5N. Für kultivierten Zellen beschreiben wir eine konfokalen Mikroskopie-Verfahren unter Verwendung des Ca2 + Farbstoffs Rhod-2/AM.

Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen

In dieser Arbeit beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll zum Testen des mitochondrialen respiratorischen Substratflusses unter Verwendung von rekombinantem Perfringolysin O in Kombination mit mikroplattenbasierter Respirometrie. Mit diesem Protokoll zeigen wir, wie Metformin die mitochondriale Atmung von zwei verschiedenen Tumorzelllinien beeinflusst.

Messung des mitochondrialen Substratflusses in rekombinanten Perfringolysin O-permeabilisierten Zellen

Dieses Proktokol zielt darauf ab, eine Methode für die in vitro und in vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen bereitzustellen.

Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs)

Dieses Protokoll beschreibt einen vergleichenden Assay, der mitochondriale komplexe Aktivitäten CI+CIII und CII+CIII in Gegenwart oder Abwesenheit von Na+ verwendet, um die Existenz von teilweise segmentierten funktionellen CoQ-Pools zu untersuchen.

Innere Empfindlichkeit der mitochondrialen Membran gegenüber Na+ zeigt teilweise segmentierte funktionelle CoQ-Pools

Hier präsentieren wir eine Zusammenstellung von Assays zur direkten Messung der mitochondrialen Funktion in Säugetierzellen, unabhängig von ihrer Fähigkeit, molekularen Sauerstoff zu verbrauchen.

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

Lernen Sie die Bestimmung der mitochondrialen Ca²⁺-Retention und Ca²⁺-induzierten mitochondrialen Schwellung in isolierten Mitochondrien aus SH-SY5Y-Zellen. Diese einfache Methode ermöglicht die Untersuchung mitochondrialer Dysfunktion und zellulärer Energetik.

Mitochondriale Ca^{2 +} Retention Kapazität Assay und Ca^{2 +}-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst

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