Mitochondriale Ca2 + Retention Kapazität Assay und Ca2 +-mitochondriale Schwellung Assay ausgelöst
1. Mai 2018
Dieses Protokoll zielt darauf ab, beschreiben eine Methode zur Prüfung der Ca2 + Rückhaltevermögen und Ca2 +- ausgelöst mitochondriale Schwellung des isolierten Mitochondrien von SH-SY5Y Zellen Schritt für Schritt.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die mitochondriale Kalziumretentionskapazität bei kalziuminduzierter mitochondrialer Schwellung zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen bei der Erforschung der mitochondrialen Dysfunktion, wie z. B. eines abnormalen Energiestoffwechsels, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie sehr einfach und effektiv ist.
Zu Beginn säen Sie etwa drei Millionen SH-SY5Y-Zellen pro 10-Zentimeter-Zellkulturschale aus. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen dreimal mit etwa einem Milliliter eiskaltem PBS in einer 10 Zentimeter großen Zellkulturschale. Geben Sie einen Milliliter eiskaltes PBS in die 10 Zentimeter große Zellkulturschale und kratzen Sie die adhärenten Zellen in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie bei 800 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Während der Zentrifugation werden fünf Milliliter mitochondrialer Isolationspuffer hergestellt, ergänzt mit 50 Mikrolitern Proteaseinhibitor-Stammlösung. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet erneut mit einem Milliliter mitochondrialem Isolationspuffer
.Inkubieren Sie das 1,5-Milliliter-Röhrchen 30 Minuten lang auf Eis. Dann lysieren Sie die suspendierten Zellen mit einem Glashomogenisator manuell auf Eis auf und ab. Füllen Sie das Homogenat in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie dann fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 1.000 mal G, um den Schmutz zu entfernen. Nach der Zentrifugation wird der Überstand in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt, bevor der Überstand wie bisher erneut zentrifugiert wird. Nach dem Transfer des Überstands in ein neues Röhrchen wird 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 14.000 μg zentrifugiert.
Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet mit den Mitochondrien erneut mit einem Milliliter mitochondrialem Isolationspuffer. Dann zentrifugieren Sie die Lösung 15 Minuten lang bei 14.000 G und vier Grad Celsius, um die Mitochondrien auszufällen. Das resultierende Mitochondrien-Pellet muss vor jedem Assay auf Eis aufbewahrt und in 50 bis 100 Mikrolitern Kaliumchlorid-Medium resuspendiert werden, je nach Pelletvolumen.
Verwenden Sie schließlich fünf Mikroliter mitochondriale Lösung, um die mitochondriale Proteinkonzentration mit einem Standard-BCA-Assay zu messen, indem Sie OD562 mit einem Plattenleser messen. Bereiten Sie das Kaliumchlorid-Medium vor und fügen Sie den kalziumbindenden grünen Fluoreszenzfarbstoff vor dem Experiment in einer Endkonzentration von 0,5 Mikromolar hinzu. Um die mitochondriale Calciumretentionskapazität zu bestimmen, überträgt man zunächst einen Milliliter isolierter Mitochondrien in Kaliumchloridmedien, die 0,5 mikromolare calciumbindende grüne Fluoreszenzfarbstoffe enthalten, in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte.
Inkubieren Sie die Mitochondrien und den kalziumbindenden grünen Fluoreszenzfarbstoff in der Sechs-Well-Platte bei Raumtemperatur und schützen Sie sie eine Minute lang vor Umgebungslicht. Nach der Inkubation werden vier Mikroliter-Aliquots in der 20-Millimol-Calciumchloridlösung in jede Vertiefung der Sechs-Well-Platte gegeben, wobei die automatische Dispensiereinstellung verwendet wird, um 200 Nanomol Kalzium pro Milligramm mitochondrialem Protein einzuführen. Mit dem Fluoreszenzspektrometer überwachen Sie die Fluoreszenzänderungen alle drei Sekunden für zwei Minuten mit einer Anregungswellenlänge von 506 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 531 Nanometern.
Die Platte ist mit einem Schütteln bei 600 U/min für drei Sekunden zwischen den Messwerten ausgestattet, das per Software gesteuert wird. Geben Sie weitere vier Mikroliter aliquot von 20 millimolaren Calciumchloridlösung in jede Vertiefung und überwachen Sie dann die Fluoreszenzänderungen alle drei Sekunden für zwei Minuten. Um eine durch Kalzium induzierte mitochondriale Schwellung zu bestimmen, wird ein Milliliter isolierter Mitochondrien in Kaliumchlorid-Medien in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte übertragen.
Fügen Sie dann 10 Mikroliter 20 millimolare wässrige Calciumchloridlösung zum mitochondrialen Protein hinzu, um eine mitochondriale Schwellung auszulösen. Zeichnen Sie mit einem per Software gesteuerten Mikroplatten-Reader die Abnahme der Absorption alle drei Sekunden für 10 Minuten bei 540 Nanometern auf. Repräsentative Ergebnisse der mitochondrialen Calciumretentionskapazität von Bongkrekic, einem Inhibitor der Calcium-induzierten mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore (MPTP), der Atractylosid öffnet, einem Aktivator der Calcium-induzierten MPTP-Öffnung und einer Blindkontrolle, sind hier dargestellt.
Die Kapazität bei der bongkrekischen Behandlung ist erwartungsgemäß viel höher als bei der Atractylosidgruppe. Repräsentative Ergebnisse der Calcium-induzierten mitochondrialen Schwellung von Bongkrekic, Atractylosid und der Kontrolle ohne Behandlung sind hier dargestellt. Die verminderte Absorption, die bei 540 Nanometern beobachtet wurde, deutet auf die mitochondrialen Schwellungen hin.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass BKA die MPTP-Öffnung hemmen kann, während ATR die MPTP-Öffnung erleichtern kann. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Lösungen auf Eis zu legen.
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Übersicht
Diese Studie beschreibt eine Methode zur Untersuchung der Ca2+-Rückhaltekapazität und der durch Ca2+ ausgelösten mitochondrialen Schwellung in isolierten Mitochondrien aus SH-SY5Y-Zellen. Das Protokoll ist darauf ausgerichtet, mitochondriale Dysfunktionen und abnormale Energiestoffwechselvorgänge zu erforschen, die entscheidend für das Verständnis der zellulären Energetik sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Mitochondriale Physiologie
- Neurowissenschaften
Hintergrund
- Die Mitochondrien spielen eine entscheidende Rolle im zellulären Energiestoffwechsel.
- Das Verständnis der mitochondrialen Kalziumretention ist entscheidend, um mitochondriale Dysfunktionen zu untersuchen.
- Die durch Kalzium induzierte mitochondriale Schwellung kann das Zellüberleben und die Zellfunktion beeinträchtigen.
- SH-SY5Y-Zellen stellen aufgrund ihrer dopaminergen Eigenschaften ein geeignetes Modell für neuronale Studien dar.
Zweck der Studie
- Beurteilung der mitochondrialen Kalzium-Retentionskapazität.
- Untersuchung der Wirkung von Kalzium auf die mitochondriale Schwellung.
- Vorstellung einer einfachen Methode zur Untersuchung der mitochondrialen Funktion.
Verwendete Methoden
- Zellkulturmethode mit SH-SY5Y-Zellen.
- Isolierung von Mitochondrien durch Zentrifugationsprotokolle.
- Bestimmung der mitochondrialen Proteinkonzentration mittels BCA-Assay.
- Fluoreszenzspektroskopie zur Überwachung der Kalziumretention und von Absorptionsänderungen zur Beurteilung der Schwellung.
- Die Versuchsdauer wird auf fünf Stunden geschätzt.
Hauptergebnisse
- Die Technik zeigte unterschiedliche Kalzium-Retentionskapazitäten zwischen den Behandlungen auf.
- Bongkrekinsäure hemmte die Öffnung des MPTP signifikant, während Atractylosid sie förderte.
- Die kalziuminduzierte Schwellung wurde durch Absorbanzmessungen verfolgt, was auf mitochondriale Reaktionen hinweist.
- Die Ergebnisse legen wichtige Schlussfolgerungen für das Verständnis der Mitochondrialdynamik in Bezug auf die Kalziumhomöostase nahe.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie liefert ein wertvolles Protokoll zur Untersuchung der mitochondrialen Kalziumdynamik.
- Sie ermöglicht es Forschenden, die Mechanismen mitochondrialer Dysfunktion in verschiedenen Kontexten zu verstehen.
- Die Ergebnisse könnten Auswirkungen auf die neuronale Gesundheit und Krankheitsmodelle haben.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Beurteilung der mitochondrialen Kalziumhandhabung ist entscheidend, um Risiken bei der Zielvalidierung in Programmen zu neurodegenerativen und Stoffwechselerkrankungen zu minimieren. Diese Assays liefern quantitative, reproduzierbare Messgrößen für die Aktivität des mitochondrialen Permeabilitätsübergangs-Pores (mPTP), einem zentralen Mechanismus, der eine Fehlregulation von Kalzium mit dem Zelltod verbindet. Indem sie eine schnelle funktionelle Untersuchung von Substanzen ermöglichen, die die mPTP-Aktivität modulieren, unterstützen diese Methoden eine frühzeitige mechanistische Risikominimierung und erhöhen die Vorhersagesicherheit bei der Auswahl von Leitverbindungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen bezüglich mitochondrialer Dysfunktion in Krankheitsmodellen.
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert funktionelle Validierung von Zielstrukturen, die an der Kalziumhomöostase und der Regulation des mPTP beteiligt sind.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Vorhersagegenauigkeit, indem Inhibitoren und Aktivatoren des mPTP-Öffnens unterschieden werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert quantitative Fluoreszenz- und Absorptionsmesswerte, die für Hochdurchsatz-Screening-Formate geeignet sind.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Standardisierung von Assays unter Verwendung isolierter Mitochondrien und kontrollierter Kalziumflüsse.
- Operativer Wert: Unterstützt die Wiederverwendung der Plattform über verschiedene Substanzbibliotheken und Bedingungstests hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet die Kalzium-Retentionskapazität mit krankheitsrelevanten mitochondrialen Phänotypen in neuronalen Modellen.
- Wissenschaftlicher Wert: Passt sich translationalen Biomarkerstrategien an, indem die funktionelle mPTP-Aktivität gemessen wird.
- Operativer Wert: Erleichtert risikoadjustierte Weiterentwicklungsbewertungen durch die mechanistische Reduzierung von mitochondrialen Sicherheitsrisiken.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Assays lassen sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur präklinischen Bewertung einordnen, insbesondere für Programme, die auf mitochondriale Modulatoren oder neuroprotektive Wirkstoffe abzielen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung calciumvermittelter mitochondrialer Signalwege und die funktionelle Bindung an Zielstrukturen.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft von Assays durch quantitative, echtzeitige Überwachung des Calcium-Flusses und der Schwellkinetik.
- Analytik: Erzeugt Fluoreszenz- und Absorptionsmessungen, die den Vergleich der Wirkstoffeffekte auf die mPTP-Schwelle ermöglichen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Durchgängigkeit, indem die mitochondriale Funktion in zellulären Modellen untersucht wird, die für die jeweilige Erkrankung relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Kapazität zur Bewertung der Wirkstoffeffekte auf Mitochondrien über mehrere Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem mechanistische Unklarheiten bezüglich des mPTP reduziert werden.
- Operativer Wert: Liefert standardisierte, reproduzierbare Ergebnisse mittels detektionsbasiertem Mikroplattenreader.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem frühzeitig mitochondriale Sicherheitsrisiken identifiziert werden.
- Portfolio-Beitrag: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf funktionellen Mitochondriendaten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolierung von Mitochondrien und in Kalzium-Fluss-Assays.
- Setzt Zugang zu Zentrifugen, Homogenisatoren und Mikroplattenlesegeräten mit Fluoreszenz- und Absorptionsmessfunktion voraus.
- Erfordert standardisierte Protokolle für die mitochondriale Aufbereitung und die Beladung mit Kalziumfarbstoffen über verschiedene Teams hinweg.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Anwendung auf verschiedene Zelltypen oder Gewebequellen.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Empfindlichkeit der mitochondrialen Aufbereitung gegenüber Temperatur und Zeitablauf.
