Visualisierung und Live Imaging Oligodendrozyt Organellen in organotypischen Gehirnscheiben mit Adeno-assoziierten Virus und konfokale Mikroskopie
23. Oktober 2017
Myelinating Oligodendrozyten fördern schnelle Aktionspotential Ausbreitung und neuronale überleben. Hier beschriebene ist ein Protokoll für Oligodendrozyt-spezifischen Ausdruck der fluoreszierende Proteine in organotypischen Gehirnscheiben mit nachfolgenden Zeitraffer Bildgebung. Darüber hinaus wird ein einfaches Verfahren zur Visualisierung von ungefärbten Myelin vorgestellt.
Das übergeordnete Ziel dieser viralen Transduktion und zeitraffenden Aufzeichnung besteht darin, die Bewegung von Mitochondrien in Oligodendrozyten in organspezifischen Hirnschnitten sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Oligodendrozyten zu beantworten, beispielsweise wie Oligodendrozyten und ihre Organellen auf Veränderungen in der lokalen Umgebung reagieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie detaillierte Informationen über die Struktur der Oligodendrozyten und die Dynamik ihrer Organellen in einer Präparation liefert, in der alle verschiedenen Gehirnzellen vorhanden sind und Oligodendrozyten kompaktes Myelin bilden. Transduzieren Sie Oligodendrozyten in Schnittkulturen am siebten Tag in vitro. Ziehen Sie zunächst 1,3 Mikroliter verdünntes AAV pro Schnitt auf. Stellen Sie sicher, dass die Außenseite der Pipettenspitze trocken ist, halten Sie die Pipette so nah wie möglich über den Kortex, ohne die Schnittfläche mit der Pipettenspitze zu berühren, und drücken Sie die Lösung langsam aus der Pipette. Sobald die Lösung den Schnitt berührt, bewegen Sie die Pipettenspitze über den Kortex, um die Lösung über die gesamte kortikale Fläche zu verteilen. Sobald alle Schnitte in einer Schale transduziert wurden, stellen Sie die Schale zurück in den Inkubator und wiederholen Sie den Vorgang bei den anderen Schalen. Untersuchen Sie die Schnitte auf die Expression fluoreszierender Marker und nehmen Sie die Schnitte auf, sobald die Expressionslevel der fluoreszierenden Marker ausreichend sind und die Schnitte gesund erscheinen. Beginnen Sie mit dem Aufbau der Bildgebungskammer, indem Sie Modellierknete verwenden, um Spritzenkanülen, die in einem Winkel von 45
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Übersicht
Diese Studie konzentriert sich auf die Dynamik von Oligodendrozyten mithilfe eines Protokolls für die Oligodendrozyten-spezifische Expression fluoreszierender Proteine in organotypischen Hirnschnitten. Durch die Anwendung der Zeitrafferaufnahmen zielen Forscher darauf ab, die Bewegung der Mitochondrien in Oligodendrozyten sichtbar zu machen und deren Reaktion auf Umweltveränderungen zu verstehen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Abbildungstechniken
Hintergrund
- Myelinbildende Oligodendrozyten sind entscheidend für eine effiziente neuronale Signalübertragung.
- Sie verbessern die Ausbreitung des Aktionspotentials und unterstützen das Überleben der Neuronen.
- Das Verständnis des Verhaltens von Oligodendrozyten kann Einblicke in die Gehirnfunktion und Krankheitsmechanismen liefern.
Zweck der Studie
- Um die Mitochondrienbewegung in Oligodendrozyten in einem organotypischen Hirnschnittmodell sichtbar zu machen.
- Um zu untersuchen, wie Oligodendrozyten auf lokale Umweltveränderungen reagieren.
- Um eine Methode bereitzustellen, die zur Beurteilung der Struktur und Dynamik von Oligodendrozyten beiträgt.
Verwendete Methoden
- Das Experiment nutzt organotypische Hirnschnitte, um das Verhalten von Oligodendrozyten zu beobachten.
- Oligodendrozyten werden am siebten Tag in vitro mittels eines viralen Vektors transduziert.
- Die Zeitrafferaufnahmemethode erfasst die dynamischen Veränderungen der Oligodendrozyten.
- Sorgfältige Pipettiermethoden werden angewandt, um eine gleichmäßige Transduktion über alle Schnitte hinweg sicherzustellen.
Hauptergebnisse
- Der Ansatz ermöglicht eine detaillierte Beobachtung der Oligodendrozytenbewegung und der Mitochondrialdynamik.
- Es wird erwartet, dass aus den Bildgebungsdaten Erkenntnisse über die strukturellen Reaktionen der Oligodendrozyten hervorgehen.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung der Oligodendrozyten-Dynamik in einem geeigneten Modell.
- Die Ergebnisse könnten das Verständnis der Funktionen von Oligodendrozyten und deren Auswirkungen auf die neuronale Gesundheit verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung der Organellendynamik von Oligodendrozyten in einem physiologisch relevanten Hirnschnittmodell und unterstützt die Zielvalidierung bei demyelinisierenden Erkrankungen. Indem es das mitochondriale Verhalten mit Umweltreaktionen verknüpft, liefert es eine mechanistische Entlastung für neurotherapeutische Kandidaten, die die Gliafunktion beeinflussen. Der Ansatz erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem er die direkte Beobachtung des Gesundheitszustands von Oligodendrozyten und der Interaktionen der Myelinscheide ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung oligodendrozytenspezifischer Hypothesen bezüglich der Organellenreaktionen auf mikroumgebungsbedingte Veränderungen.
- Operativer Wert: Nutzt AAV-vermittelte Transduktion unter dem Promotor des myelinspezifischen Basisproteins für zelltypspezifische Markierung und verringert dadurch Nebenwirkungen an nichtzielgerichteten Strukturen.
- Predictiver Wert: Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, indem mitochondriale Dynamik mit der Gesundheit von Oligodendrozyten im intakten Gewebe korreliert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt quantitative Zeitrafferdaten zur mitochondrialen Bewegung und ermöglicht standardisierte Auswertungen für die Wirkstoff-Screening.
- Reproduzierbarkeit: Organotypische Schnitte bewahren native Zell-Zell-Interaktionen und verbessern so die Konsistenz zwischen Experimenten.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit konfokalen Mikroskopie-Plattformen, die in Entdeckungslaboren weit verbreitet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Direkt anwendbar auf Modelle der Demyelinisierung, bei denen ein Stress der Organellen von Oligodendrozyten eine Rolle spielt.
- Translationaler Kontinuität: Verknüpft in-vitro-Befunde mit der pathophysiologischen Ebene des Gewebes durch Live-Bildgebung myelinassoziiierter Prozesse.
- Mechanistische Entwederung Ermöglicht die Beurteilung, ob Testsubstanzen die Organellendysfunktion in Oligodendrozyten verbessern oder verschlechtern.
Pipeline- und Workflow-Integration
Passt in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur präklinischen Bewertung, insbesondere für Programme zu neurodegenerativen und demyelinisierenden Erkrankungen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung hinsichtlich der Organellenreaktionen von Oligodendrozyten auf pharmakologische oder genetische Störungen.
- Screening: Ermöglicht die Entwicklung von Assays zur mitochondrialen Beweglichkeit oder Morphologie als phänotypische Messgrößen.
- Analytik: Liefert quantitative bildgebende Ergebnisse (z. B. Geschwindigkeit, Dichte, Dauer der mitochondrialen Bewegung) für den vergleichenden Analysen.
- Translationale Forschung: Verbindet zelluläre Dynamik mit Myelinintegrität mittels komplementärer konfokaler Reflexionsmikroskopie zur markierungsfreien Visualisierung von Myelin.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das Protokoll kann durch Verwendung desselben AAV-Vektors auf andere Organellen (z. B. Lysosomen, ER) angepasst werden, wodurch die Plattformnutzung erweitert wird.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unklarheiten bei der Arzneimittelentwicklung, die auf Oligodendrozyten abzielt, indem das Echtzeit-Verhalten von Organellen visualisiert wird.
- Operationaler Wert: Ein standardisierter Transduktions- und Bildgebungsworkflow verbessert die Reproduzierbarkeit über verschiedene Standorte und Teams hinweg.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitig unerwünschte Wirkungen auf die Gesundheit von Gliazellen im Entdeckungsprozess aufgedeckt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen basierend auf ihren Auswirkungen auf die Physiologie von Oligodendrozyten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in viraler Transduktion, organotypischer Schnittkultur und konfokaler Mikroskopie.
- Hängt von der Verfügbarkeit von AAV, der Titrierungsoptimierung und der Promotorspezifität für die gezielte Ansprache von Oligodendrozyten ab.
- Benötigt eine Kontrolle der Umweltbedingungen (CO2, Temperatur), um die Gesundheit der Schnitte während der Zeitrafferaufnahmen zu gewährleisten.
- Die Anpassung auf andere Organellen erfordert die Validierung mitochondrialer Targeting-Signale im Vergleich zu alternativen Lokalisierungssequenzen.
- Eingeschränkt durch die Lebensfähigkeit der Schnitte über die Zeit sowie durch potenzielle Variabilität der Transduktionseffizienz zwischen verschiedenen Präparationen.
