Name: Gründung der Larven Zebrafisch als Tier-Modell zu untersuchen Trypanosomen Trypanosoma Motilität In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Zebrafischlarven als transparentes In-vivo-Modell nutzen, um die Motilität von Trypanosoma cruzi mit Lichtscheibenmikroskopie zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbeobachtungen.

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Diese Arbeit wurde durch die Convocatoria Interfacultades von Vicerrectoría de Investigaciones De La Universidad de Los Andesund USAID Forschung und Innovation-Fellowship-Programm unterstützt. Wir danken Juan Rafael Buitrago und Yeferzon Ardila für Fisch Wartung und Unterstützung.

die folgenden Protokolle wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss von Los Andes Universität (CICUAL) genehmigt. Sicherheitsstufe 2 (BSL-2) Leitlinien sollten strikt befolgt werden, um Verunreinigungen mit dem Erreger zu verhindern T. Trypanosoma.
 Hinweis: Tier Pflege und Wartung: Casper Zebrafisch, eine gentechnisch veränderte Sorte Zebrafisch (Danio rerio) dient in diesem Protokoll aufgrund ihrer wertvollen optischen Transparenz in allen Entwicklungsstadien. Fische sind mit optimalen Bedingungen für die Arten 14, in einem 14 h Licht-10 h dunklen Zyklus, bei 28 ± 1 ° C bei einem pH-Wert (7,0-7,4) gesteuert Multi-Tank rezirkulierenden Wasser Pflegesystem manipuliert. Tiere sind mit live Artemia (Artemia Salina) zweimal täglich gefüttert und mit der Aufzucht Lebensmittel angereichert. Alle Protokolle von CICUAL an der Universidad de Los Andes (C.FUA_14-017) genehmigt wurden.
 1. Vorbereitung der Ei Wasser <ol><li>Prepare 0,6 g/L Aquarium Salz in umgekehrte Osmose (RO) oder deionisiertes Wasser (DI) und 0,01 mg/L Methylenblau der Projektmappe hinzufügen. 
	Hinweis: Die gemessene Leitfähigkeit von 400-500 µS/cm und der pH-Wert auf 7.2-7.9 sollte. Um den pH-Wert zu senken, das Ei Wasser für ein paar Stunden belüften.</li>
</ol> 2. Vorbereitung der Tricaine-Lager-Lösung <ol><li>Prepare 0,4 % Tricaine Stammlösung durch Auflösen von 400 mg Tricaine (MS-222) 97,9 mL destilliertem Wasser (DdH 2 O). Nachdem das Pulver komplett aufgelöst hat, stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit 2,1 mL 1M Tris (pH 9,0) und die Lösung im Kühlschrank.</li>
</ol> 3. Vorbereitung von 1,0 % niedriger Schmelzpunkt Agarose <ol><li>lösen sich die niedrig schmelzenden Punkt Agarose-Pulver in Ei Wasser, eine Endkonzentration von 1,0 %. Erhitzen Sie die Mischung in der Mikrowelle oder auf einer Heizplatte unter ständigen rühren bis die Agarose-Lösung homogen erscheint.</li>
	<li>Speichern die Aliquote bei 4 ° C nicht länger als eine Woche.</li>
</ol> 4. Paarung-Assay und Embryo Sammlung <ol><li>drei Tage vor Injektionen richten Sie Verpaarungen mit gesunden Paaren von männlichen und weiblichen Fisch für die Zucht von Panzern. Anreicherung mit Glasmurmeln und künstlichen Pflanzen verbessert laichen. Verpaarungen sollten im Laufe des Nachmittags einrichten und über Nacht gelassen.</li>
	<li>Am nächsten Morgen sammeln die erzeugten Eiern durch Entleerung des Tanks durch ein Sieb passieren und die Eiern mit dem Ei Wasser waschen. Entfernen Sie alle Eizellen durch Umkehrung der Sieb und gießt Ei Wasser durch das Sieb in eine Petrischale. Um die Embryonen gesund zu halten, ihr Wasser zu reinigen, indem Trümmer und Tote Embryos mit einem Kunststoff Transferpipette.</li>
	<li>Transfer der Embryonen zum Inkubator bei einer stabilen Temperatur von 28,5 ° C erlauben die Entwicklung der Embryonen nach dem Zebrafisch staging Standards 15. Untersuchen Sie die Embryonen zwei Mal am Tag, und entsorgen Sie therapeu Eiern um die Kupplung gesund zu halten.</li>
</ol> 5. Embryo-Dechorionation Hinweis: Diese Vorgehensweise ist erforderlich, wenn die Embryonen nicht zum Zeitpunkt der Injektion geschlüpft sind. In diesem Verfahren &#34; Larven &#34; sind Tiere aus ihren Chorion ab 48 h post an Düngung (hpf).
<ol><li>Am Tag des Experiments, legen Sie die Petrischale mit den gesunden Embryonen unter einen sezierenden Stereoskop.</li>
	<li>Entgegengesetzte Enden der Chorion mit zwei scharfen Pinzetten (Dumont Nr. 5) greifen und vorsichtig reißen und ziehen das Chorion öffnen. Etwa 5-6 Larven werden zu einem Zeitpunkt injiziert, und in der Regel 3-4 abgebildet.</li>
	<li>Des Chorions aus dem Wasser mit einer Transferpipette nehmen.</li>
</ol> 6. Vorbereitung von Injektionsmaterial <ol><li>bereiten 1.0 mm Nadeln dünnwandige Glaskapillaren mit einer Mikropipette Puller Gerät mit den folgenden Einstellungen: 2 leichte Gewichte 1 schweres Gewicht, 2 mm Top Pull + 5 mm bottom Pull, 75,9 ° C (Schritt 1) + () 78,2 ° C (Schritt 2). Speichern Sie die Nadeln in einer Petrischale auf einem Streifen Knetmasse. Die ideale Nadel hätte eine schmale Spitze, als T. Trypanosoma ca. 20 x 1-3 µm zu messen und wird durch die Nadel leicht passieren. Die Länge der Spitze kann variieren: ein längerer Tipp ist nützlich, um die tiefere Strukturen zu erreichen, aber eine kürzere Spitze steifere Injektion für den Benutzer einfacher machen werden. 
	Hinweis: Die Nadel Spitzengröße hängt von der Temperatur verwendet: eine höhere Temperatur für Schritt2 ergibt sich eine längere und feiner Spitze.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 1,5 % Agarose-Lösung in DdH 2 O und gießen Sie sie in einer 10 cm Petrischale. Deckung eine Tiefe von ca. 1,0 cm.</li>
	<li>Legen Sie eine vorgefertigte Mikroinjektion Form über die Agarose und festigen lassen.</li>
	<li>Heben die vorgefertigten Mikroinjektion Form heraus und fügen Sie Ei Wasser für die Lagerung bei 4 ° C. Dadurch wird verhindert, dass die Agarose austrocknen.</li>
	<li>Add Ei Wasser Tricaine-Stammlösung, eine Endkonzentration von 150 mg/L. Store bei 4 ° c</li>
</ol> 7. Zellkultur für Parasiten Wachstum <ol><li>Parasiten in einer menschlichen Astrozytom-Zelllinie (CRL-1718) mit der Methode von Vargas-Zambrano Et Al. beschrieben gepflegt werden 16</li> <li>beginnen die Kultur der menschlichen Zellen in ein T25 Kulturflaschen (Fläche = 25 cm 2) bei einer Dichte von 2 x 10 5 oder 4 x 10 5 Zellen in 4 mL RPMI-1640 Medium mit 10 % der fetalen Kälberserum (FCS), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 4,5 g/L Glukose 10 mM HEPES, 1 mM Pyruvat und 1 % Penicillin-Streptomycin (genannt &#34; komplette Medien &#34;). Inkubieren Astrozytom Kulturen bei 37 ° C in einer 5 % CO 2 Umgebung.</li>
	<li>Nach einer Monoschicht konfluierende lösen die Zellen mit 2 mL von 0,25 % des Trypsin-EDTA durch Inkubation sie für 3 min bei 37 ° C. visuell überprüfen Zellen für Ablösung, und blockieren die Trypsin-Lösung mit 3 mL RPMI-1640 mit 10 % FCS in der 15 mL Tube.</li>
	<li>Zentrifuge die Zellsuspension für 5 min bei 1.350 x g.</li>
	<li>Waschen die daraus resultierenden zellulare Pellet in DMEM Medium in einem 15-mL-Tube und Zentrifuge für 5 min bei 1.350 x g bei 22 ° c</li>
	<li>Zählen die Zellen manuell in einer Neubauer Kammer und suchen Sie nach Rentabilität in einem Lichtmikroskop bei 40 X Vergrößerung.</li>
	<li>Sanft wieder ausgesetzt die zelluläre pellet in 4 mL komplette Medien und neuen Zellkulturen mit 2 x 10 5 Zellen pro T25 Kultur Kolben erstellen.</li>
</ol> 8. T. Trypanosoma Kultur und Beschriftung <ol><li>Parasiten sind eine Sorte, die ursprünglich von einem infizierten Menschen erhalten und zeichnet sich als T. Trypanosoma DA Belastung (MHOM/CO/01/DA), Genotyp diskrete Eingabe Einheit (DTU) TcI 16. Nach 3 oder 4 Tage der Kultivierung, erfassen die bewegenden Parasiten von den menschlichen Astrozytom Zelle Kultur überstand und Zentrifuge für 5 min bei 1.350 x g. verwerfen das Medium. 
	Hinweis: Parasiten im kompletten Medium eignet sich für die Kultur wieder im Verhältnis 1:1 mit Astrozytom Zellen in T25 Kulturflaschen.</li>
	<li>Vorsichtig wieder auszusetzen das Pellet in 10 mL sterile 1 x Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) mit 0,1 % FCS und Zentrifuge für 5 min bei 1.350 x g.</li>
	<li>Den Überstand verwerfen und neu in 1 mL PBS auszusetzen. 10 µL für die Zählung der freischwimmenden Parasiten in einer Neubauer-Kammer nehmen.</li>
	<li>Nehmen den Rest neu suspendierten Parasiten (990 µL) und fügen Sie 1 µL Carboxyfluorescein Diacetat SuccinimiDyl Ester (CFSE), Endkonzentration 5.0 µM. für 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. 
	Hinweis: Sollte die CFSE-Lager bei 5 mM regelmÄÑig und gepflegt bei-20 ° c</li>
	<li>Pellet-Parasiten (1.350 x g, 5 min). Der Parasit Pellet durch Streichen der Röhre zu rekonstruieren und in 10 mL 1 X PBS-0.1% FCS von einem anschließenden Spin (1.350 x g, 5 min gefolgt) waschen.</li>
	<li>Überstand verwerfen und sanft wieder auszusetzen beschrifteten Parasit Pellet mit 1 X PBS-Puffer mit dem entsprechenden Volumen erhalten eine Endkonzentration von etwa 10-20 Parasiten/nL Injektionslösung.</li>
	<li>Verwenden Sie ein kleines Volumen (&#8764; 10 µL, ca. 1 x 10-4 -2 x 10-4-Parasiten) von Trypomastigotes, Rentabilität und Kennzeichnung zu beurteilen. Ein umgekehrtes Fluoreszenzmikroskop einsetzbar für direkte Visualisierung der Parasiten. Überprüfen Sie in der übertragenen Lichtmodus, dass die Parasiten bewegen. Im Fluoreszenz-Modus mithilfe des Filters Fluorescein erfolgt (FITC) Parasit Kennzeichnung bewerten.</li>
</ol> 9. Injektion von Zebrafischlarven <ol><li><ol>Parasit laden <li>nehmen 10 µL des Parasiten aus der Wiederfreisetzung (100 µL) und laden sie in die verschlossenen Glas Nadeln mit einer Pipettenspitze 10 µL Microloader.</li>
		<li>Glas Nadel in den Nadelhalter der Mikromanipulator, verwenden ein Magnetstativ, und neben das Stereoskop.</li>
		<li>Mit feinen Pinzetten unter das Stereoskop, schneiden Sie die Nadel ein stumpfes offen erstellen beenden und messen die Tropfengröße um ein Injektionsvolumen von 1 zu erhalten (Dies entspricht einem Wulst-Durchmesser von 0,12 0,13 mm gemessen in Mineralöl 17) nL. Ein längerer Tipp wird bevorzugt, so dass die Nadel Strukturen erreichen kann tief in die Fische ohne das Gewebe zu schädigen. In diesem Protokoll eine stumpfe Nadel verwendet, sondern eine abgeschrägte Nadel kann auch verwendet werden.</li>
	</ol></li> <li>Montage <ol><li>Larven von 48 zu betäuben hpf, mit 150 mg/L Tricaine. Prüfung, die sie nicht ansprechen, berühren, sondern sorgen dafür, dass das Herz schlägt.</li>
		<li>Legen Sie die Larven in die Mikroinjektion Agarose Schimmel in Seitenlage.</li>
		<li>Legen Sie den Nadelhalter neben das Stereoskop und dem Mikromanipulator so einstellen, dass die Spitze der Nadel in der Mitte des Sichtfeldes ist. Verschieben der Petrischale in Schritten 6.2 - 6.4 vorbereitet, so dass die Larven Eigelb in der Nähe der Spitze der Nadel ist. Überprüfen Sie den Zustand der Larve um sicherzustellen, dass das Herz schlagen weiter.</li>
		<li>Legen Sie die Microinjector-Werte wie folgt: Injektion Druck 9,6 Pfund pro Zoll (Psi), Nachdruck: 20 Psi; 100 ms-Reihe von Anspritzung; Periodenwert von 1,9 (entspricht 10,9 ms). Das Laufwerk der Injektion sollte zwischen 1-3 nL, mit ca. 10-20 Parasiten/nL.</li>
	</ol></li></ol> 10. Injektion des Parasiten <ol><li>Spritzen die Fische in der Superior-vorderen Teil das Eigelb auf den Kanal von Cuvier. Dieser Schritt sollte geübt werden, um Tiere überleben nach der Injektion zu gewährleisten. Es dauert ca. 10 min. 5-6 Larven erfolgreich Spritzen.</li>
	<li>Als ein Steuerelement Spritzen 1-2 Larven mit dem gleichen Fahrzeug Volumen (1 X PBS).</li>
	<li>Übertragen die Larve auf frisches Ei Wasser sofort.</li>
</ol> 11. LSFM Montage der injiziert Larven <ol><li>übertragen die Larve mit Parasiten zu einer leeren Petrischale injiziert und entfernen Sie vorsichtig das umgebende Wasser eine Plastik-Pipette mit saugfähigem Papier. Fügen Sie sofort 100 µL vorgewärmten 1,0 % niedrig schmelzenden Punkt Agarose (siehe Schritt 3 Vorbereitung Agarose) um die Larve zu decken. Sicherzustellen, dass die Agarose nicht über 40 ° c</li>
	<li>Fügen Sie einen geraden Draht im Inneren ein 1,0 mm Glas Kapillare und verwenden Sie es als ein Kolben um zu saugen bis die Larve in einer senkrechten Position. Stellen Sie sicher, eine kleine Menge Agarose über die Larve zu verlassen. Warten Sie, bis die Agarose erstarrt vor der Belichtung der Larve (Dies erfordert wenige Minuten). Falls erforderlich, push-out überschüssige Agarose unterhalb der Larve und schneiden Sie es aus</li>
	<li>Die Kapillare in das Mikroskop Probenhalter und schieben Sie das Ende mit der Larve, bis es frei von der Kapillare hängt. Die Probenkammer mit Tricaine Lösung (150 mg/L) und die Temperatur bei 28 gefüllt werden ° C.</li>
	<li>Positionieren die Larve vor der Schüler von der Erkennung Ziel mit einem XYZ-Mikromanipulator-System. Verwenden Sie für Drehungen um die Hochachse eine Rotationstisch. Positionierung der Larve im übertragenen Lichtmodus larvale Strukturen identifizieren getan werden.</li>
</ol> 12. LSFM Imaging von injiziert Parasiten <ol><li>Veränderung zu Fluoreszenz-Modus und stellen Sie die Beleuchtungsstärke als auch die Belichtungszeit verringern lichtbedingten und Zeitauflösung zu optimieren. Für diese besondere Experimente wir eine Leistung von 2,8 bis 3,0 mW für das Beispiel verwendet und jedes Bild für 200 ms mit einer Kamera mit 6,45 µm Pixel und ~ 70 % Quantenausbeute bei der Erkennung Wellenlängen ausgesetzt. Diese Einstellungen sollten ausreichend belichtete Aufnahmen bei ca. 5 Bildern/s. Achten Sie darauf, ein Ziel mit der höchsten möglichen numerischen Apertur verwenden führen.</li>
	<li>Starten Sie eine Videoaufnahme der Region of Interest (ROI). In unserem Fall sind Parasiten an Ventilen und frei beweglichen rund um den Bereich des Herzens beobachtet. Es wird empfohlen, eine Video von einer Ebene im Laufe der Zeit zu nehmen, oder das Mikromanipulator oder Piezo-Galvo-System verwenden, um verschiedene Ebenen zu konzentrieren, während der Parasit bewegt. 
	Hinweis: Dieses Verfahren eignet sich für kurze Erfassungszeiten von bis zu 2 h. Für langfristige Anschaffung, die Larven montiert werden sollte mit alternativen Methoden 20.</li>
</ol> 13. Bildverarbeitung und Analyse der erworbenen Daten Hinweis: Bildverarbeitung erfolgte auf einem Personal Computer mit einem 2,90 GHz Prozessor, 8,00 GB Arbeitsspeicher und eine Grafikkarte mit 1,00 GB Speicher.
<ol><li>Öffnen die erworbenen Dataset in der Bildverarbeitungs-Software der Wahl. Die offene Software Fidschi empfiehlt sich für LSFM Datenverarbeitung und Analyse 21.</li>
	<li>In der Bildanalyse-Software passen Sie Helligkeit und Kontrast Ebenen, um die Bilder zu optimieren. 
	Hinweis: Keine festen Parameter sind in diesem Fall verwendet, aber die Auswahl der &#34; Auto &#34; Option kann hilfreich sein, eine erste Erweiterung zu erhalten.</li>
	<li>Wählen Sie den ROI. 
	Hinweis: Für die Verfolgung von einzelnen Parasiten, Fidschi hat sowohl manuelle als auch automatische Tracking-Plugins zur Verfügung.</li>
</ol> 14. Erholt sich abgebildet Larven <ol><li>entfernen die Larve sorgfältig aus dem Agarose mit feinen Zangen und ein Haar-Loop-Werkzeug. Die Fische wieder auf frisches Ei Wasser und suchen Sie nach Wiederherstellung übertragen, nach 15 min. zurück die Larve an Inkubator an 28 ± 0,5 ° c</li>
	<li>Fahren Sie alternativ mit der abgebildeten Larven mit einer Überdosis Tricaine einschläfern. Dann stellen die Larven in einer Lösung von Natriumhypochlorit (6,15 % NaClO) für 5 min um den Parasiten zu töten. Nach der Einrichtung entsorgen &#39; s Standardprotokolle.</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Diese Studie zeigt die Vorteile der Zebrafisch als Tiermodell für Erreger Verhalten in Vivozu studieren. Insbesondere diese Studie schlägt vor, eine Methode, um den Erreger Trypanosoma T. in seiner natürlichen Umgebung zu visualisieren: hematic Zirkulation. Die Umgebung des Kreislauf Mikroumgebung in Fisch ist vergleichbar mit der von Säugetieren und Trypanosomatids Mechanismen für Reisen, das Immunsystem auszuweichen und Anfügen an Zellen für eine Infektion in diesem Umfeld25entwickelt haben. Dieses Protokoll bietet eine Beschreibung der ein optimales Verfahren zur Kultur der T. Trypanosoma in einer menschlichen Zelllinie und anschließende Isolierung von flagellar Formulare für fluoreszierende Kennzeichnung. Es zeigt dann die passenden Einstellungen für erfolgreiche Injektion der Parasiten in durchsichtigen Zebrafisch für später Montage und Visualisierung mit LSFM. Dieses Protokoll bietet Anregungen für die effiziente und effektive in-Vivo Bildgebung der Parasit Lage und Bewegung im Umlauf mit LSFM.
Die Geissel der Trypanosomen ergibt sich aus seiner hinteren Region, fließt aus dem Zellkörper und hängt frei in den vorderen Teil des Organismus26. T. Trypanosoma treibt sich durch winken die Geissel vor den Körper, der der Parasit ganzen Körper schaukelt. Flagellar Bewegung ist nicht nur unverzichtbar für Parasiten Motilität, wie im Fall von T. Trypanosomen27 (der Erreger der afrikanischen Trypanosomiasis), aber es ist auch für zelluläre Infektion verwendet, wie in T. Trypanosoma5 nachgewiesen ,28. Zebrafisch sind, zwar nicht der natürliche Wirt für T. Trypanosomakann der Parasit Motilität in ein sich entwickelndes Kreislaufsystem mit den Protokollen beschrieben hier studiert werden. Darüber hinaus gibt es Trypanosomen-Arten, die infizieren Cypriniden, die Klasse der Zebrafisch, z. B. T. Carassii und T. Borreli25. Dieser Parasit Arten könnte verwendet werden, um in Echtzeit die Bewegungen und Befestigung Mechanismen von diesen Trypanosomatids zu studieren; solche Studien können Einblick in den Säugetier-Zelle Infektionsprozess verleihen.
In dieser Studie injiziert bewegliche T. Trypanosoma Parasiten waren, beobachteten Reisen durch den Kreislauf der beimpften Fisch, bewegen zusammen mit undurchsichtigen Erythrozyten und Strukturen in den Wänden des Herz-Kreislauf-System an. Wir verwendeten eine selbst gebaute LSFM mit 10 X achromatisch lange Arbeitsabstand Luft Ziel (17,6 mm) für die Beleuchtung-Arm mit einer numerischen Apertur von 0,25. Eine 40 X apochromatische Wasser eintauchen Ziel mit einer numerischen Apertur von 0,8 und einem Arbeitsabstand von 3,5 mm wurde für die Erkennung Arm verwendet. Die Erkennung Ziel war in die Probenkammer vertieft, während der Beleuchtung Ziel außerhalb der Kammer war. Ein Hafen in der Kammer mit einem Deckgläschen versiegelt und optische Kleber für die Beleuchtung-Strahl, den Plenarsaal betreten erlaubt, Lorenzo Et Al. dargestellt 18 für Beleuchtung, verwendeten wir ein 50 mW DPSS Laser bei 488 nm deren Kraft wurde durch einen akusto optischen durchstimmbare Filter moduliert. Der Erkennung Pfad verwendet Filter kompatibel mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP) oder FITC. Ein leichtes Blatt Mikroskop mit einer Kapillare Probenhalter (idealerweise mit automatischen Drehung) und Temperierung von die Probenkammer ausgestattet sollte für diese Anwendung geeignet. Das Mikroskop sollte ausgerichtet und kalibriert gemäß den Anweisungen des Herstellers oder des Benutzers standard Laborprotokolle vor Erwerb, wenn nötig. In diesem Protokoll gesteuert wir das Mikroskop mit der SPIM Software19.
Es ist wichtig zu beachten, dass in der Zirkulation der Zebrafisch, parasitäre Larven Anlage wirksam ist. In der Kardinal Ader blieb Parasiten beigefügten für bis zu mehreren Minuten; im Herzen hielt sie an Ventilen und Wände, oszillierende mit Herz Kontraktionen. Weitere Studien zu bleiben, um aufzuklären, ob T. Trypanosoma interagiert mit der fließenden Erythrozyten, die in die Richtung des Blutflusses zu treiben. In-vitro- Studien haben gezeigt, dass das Vorhandensein von festen Strukturen (z.B. Blutzellen) oder erhöhte Viskosität der Flüssigkeit, Blut in Vitrozu imitieren, hat erhebliche Auswirkungen auf die Beweglichkeit und Geschwindigkeit des Parasiten 9.
Es gibt viele Fragen über den Verlauf der Infektion von T. Trypanosoma beim Menschen nach Amastigoten phagocytic Zellen, die ursprünglich infizierten Zelle Typ29entkommen. Zum Beispiel, wie kommen sie zu ihren Zielorganen? Was sind die Mechanismen für Tropismus für die bevorzugte Organe, wie Herz-Kreislauf, Magen-Darm und zentralen Nervensystem? In dieser Studie wurden die Parasiten interessanterweise zunächst im Herzen abgebildet, weil es die höchste Dichte an Parasiten wurde. Das CFSE-Signal gesammelt jedoch anschließend 7 Tage Post Injektion in den Entwicklungsländern Darm. Obwohl die Anatomie der Fische und Säugetiere unterscheidet, zeigen die Ergebnisse dieser Studie eine Form der Tropismus, da es beobachtet wurde, dass Parasiten Tropismus gegenüber bekannten bevorzugte Zielorgane organismal Unterschiedlichkeit ausgestellt. Eine erhebliche Einschränkung dieser Studie betrifft die Temperatur in den Experimenten verwendet. Zebrafisch-Larven sollten während des gesamten Verfahrens rund 28 °C gehalten werden. Wenn diese Temperatur ähnlich dem Vektor-Host (Insekten der Unterfamilie Triatominae) sein mag, ist es ganz anders als die warmblütigen Säugetiere, die die endgültige Gastgeber (etwa 37 ° C) bilden. T. Trypanosoma ist bekannt, dass flagellar Wohnformen in beide Hosts; Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass dieser Faktor im Verhalten der Tiere in Vivoauswirken könnten.
Obwohl das adaptive Immunsystem Fish´s bis 4 Wochen-Düngung Post nicht ausgereift ist, ist das angeborene Immunsystem aktiv in Entwicklung10. So früh wie 48 oder 96 hpf, wurden phagocytic Zellen beobachtet, dass verschlungen Trypanosomen (Daten nicht gezeigt) beschriftet. Dies schränkt das Zeitfenster für die Visualisierung des Parasiten. Wenn eine Studie war es, auf die Bewertung der Fish´s Immunantwort konzentrieren, kann Injektion in einem späteren Stadium empfohlen werden. Darüber hinaus können Injektion von Parasiten in transgene Fische Linien mit beschrifteten Makrophagen und andere Zellen des Immunsystems beim Studium von Parasiten Anlage und möglichen Endozytose Mechanismen nützlich sein. Es ist wichtig zu beachten, dass wenn die Parasiten mit CFSE beschriftet sind, transgenen Zelle Etiketten nicht GLP sollte und eine Markierung in der gelben oder roten Ende des Spektrums erforderlich ist.
Um die genaue Bewegungsrichtung Parasit zu beurteilen, kann es sinnvoll, ihre Flugbahn in 3 Dimensionen (3D) zu folgen sein. Für 3D Visualisierung und Rekonstruktion des Prozesses ist ein High-Speed-System notwendig. Mit der Ausrüstung, die in diesem Protokoll verwendet ist es nur möglich, die Parasiten in einer Ebene sichtbar zu machen. In diesem Fall priorisiert wir Brennebene Stabilität während der Parasit-Bewegung, und die Aufnahme seiner Flugbahn in einer Ebene.
Die hier vorgeschlagene Methode ebnet den Weg für weitere Parasiten Verhalten im Kreislauf zu untersuchen. Zusammenfassend lässt sich sagen sind die wesentlichen Schritte zu imaging live fluoreszierende Parasiten im Zebrafischlarven:(i) verwenden der frühen geschlüpfte Embryonen (24-48 hpf) oder Larven oder Tiere zwischen 72-96 hpf mit keine Pigmentierung, damit sind transparent und leicht zu injizieren; (Ii) Bild Larven so bald wie möglich nach der Injektion, Parasit Freigabe durch phagocytic Zellen zu vermeiden; und (Iii) die LSFM auf der Website von Interesse (z.B. Herzbeutel Region) zu konzentrieren und den Fokus zu erhalten. Dieses neuartige Verfahren ermöglicht die Visualisierung von Trypomastigotes in einem Umfeld vergleichbar mit seiner natürlichen Infektion Nische, bietet erstmals die Möglichkeit T. Trypanosoma in einem lebenden Organismus zu studieren.

Chagas-Krankheit wird durch die Protozoen-Parasiten verursacht T. Trypanosoma. T. Trypanosomasind etwa 6 bis 7 Millionen Menschen weltweit infiziert. Die Krankheit ist vor allem in Lateinamerika übertragen, sondern wurde in den Vereinigten Staaten, Kanada und vielen europäischen sowie einigen westpazifischen Ländern, vor allem aufgrund der Migration von infizierten Personen1berichtet. Chagas ist weitgehend vektorübertragene und übertragen auf den Menschen durch Kontakt mit dem Kot von Hematophagic Insekten in der Unterfamilie Triatominae, allgemein bekannt als "Kissing Bugs". T. Trypanosoma kann jedoch auch über Bluttransfusionen, vertikale Übertragung von Mutter auf Kind oder Einnahme von kontaminierten mit Parasiten2übertragen werden. Der akuten Phase, die der Infektion ist vor allem asymptomatisch oder konstitutiv symptomatisch und dauert 6 bis 8 Wochen, nach denen Engagement des immunen Systems steuert Parasit Last, aber die Infektion3nicht vollständig beseitigt. Die meisten Menschen dann eintreten eine chronische asymptomatische Phase; jedoch entwickeln fast 30 % der Patienten eine symptomatische chronische Phase, in der das kardiale System und weniger häufig das Verdauungs- und Nervensystem kompromittierten4sind. Dieses Szenario stellt eine Herausforderung für Behandlung und Kontrolle, da gibt es keine Impfstoffe zur Verfügung, und es nur zwei wirksame Medikamente zur Chagas gibt: Benznidazol und Nifurtimox. Beide Behandlungen erfordern längere Verwaltung und möglicherweise schwere Nebenwirkungen2.
Erhöht das Verständnis des Verhaltens von T. Trypanosoma ist Verhalten in Vivo Schlüssel zur Bestimmung von parasitären Migration, zelluläre Anlage und Invasion in den Host; ein Mangel an in Vivo Modellen schränkt die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze. In-vitro- Studien von T. Trypanosoma Infektion haben gezeigt, dass die Beweglichkeit der Trypomastigotes ist wichtig für die Bindung an Host Zellmembranen und anschließende zellulären Invasion5. Energie Erschöpfung in Trypomastigotes in Kokultur mit einer anfälligen Zelllinie hat sich gezeigt, zur Verringerung der zellulären Invasion6. Interessanterweise ist in Trypanosomatids, flagellar Bewegung auch als Steuerhinterziehung Mechanismus gegen Parasiten-spezifische Antikörper7gekennzeichnet.
Flagellar Motilität wurde ausgiebig studiert in Vitro in Trypanosomen Trypanosomen, eine eng verwandte Parasiten, die afrikanische Trypanosomiasis8verursacht. In-vitro- Studien über die Motilität des diese Trypanosomen haben gezeigt, dass Simulation der Bedingungen von Blut oder Körperflüssigkeiten, wie Viskosität und das Vorhandensein von Hindernissen, die Vertreterin der Blutkörperchen, wichtig für Parasiten Vorwärtsbewegung9 . Als der wurde es nicht möglich, die Bewegung des Parasiten in den Blutkreislauf in Vivozu visualisieren noch.
Zebrafisch-Larven sind ein leistungsfähiges Modell, Wirt-Pathogen Interaktionen in Vivozu studieren. Sie sind klein, kostengünstig und relativ leicht zu erziehen, im Vergleich mit anderen etablierten vertebrate Modelle für die Chagas-Krankheit. Zebrafisch angeborenen und der adaptiven Immunsystem ähnlich wie beim Menschen, aber ihre adaptiven Immunsystems beginnt in 4 Tage Post Düngung (Dpf) zu entwickeln und ist nicht reif für ein weiteres mehrere Wochen10. Während der frühen Entwicklung wenn nur Makrophagen vorhanden sind, gibt es ein großes Fenster für das Studium der Parasit Verhalten ohne sofortige immun Störung10. Allerdings liegt der größte Vorteil der Verwendung von Zebrafischlarven als Wirbeltier Modell für das Studium Erreger Verhalten in ihrer optischen Transparenz macht sie zugänglich für mikroskopische screening und imaging-11. Darüber hinaus gibt es mehrere Tools, Fisch Genetik zu manipulieren. Beispielsweise ist Casper Belastung einer mutierten Zebrafisch mit keine Pigmentierung, wodurch das Tier völlig transparent und nützlich für die Visualisierung der einzelnen Organe und für Echtzeitverfolgung von injizierten Zellen12.
Eine wichtige Einschränkung der longitudinalen Beobachtung schnell bewegenden Parasiten in live Zebrafisch mit konfokale oder Epifluoreszenz Mikroskopie liegt in der Unmöglichkeit der Bildgebung bei hohen Anschaffungs-Geschwindigkeiten und großen Eindringtiefen mit guter Bildqualität und niedrigem Risiko von lichtbedingten. Leichte Blech-Fluoreszenz-Micsroscopy (LSFM) ist ein aufstrebenden bildgebendes Verfahren, das überwindet diese Einschränkungen um diese Beobachtungen zu ermöglichen. Mit ein Ziel erkennen, Fluoreszenz und ein zweites orthogonal Beleuchtung-Ziel, das nur die Brennebene des Ziels Erkennung leuchtet, ist es möglich, hochauflösende optische Teile wie in einem confocal Mikroskop, aber mit zu erhalten deutlich reduzierte lichtbedingten, auch bezüglich Epifluoreszenz Mikroskopie13. Die hier verwendete LSFM-Technik nennt man einzelne Flugzeug Illumination Microscopy (SPIM), in denen eine dünne Folie aus Licht leuchtet auf eine Ebene innerhalb der Zebrafischlarven.
Das Ziel dieser Methodik ist, Larven Zebrafisch als eine tragfähige nicht-Infektionsmodell für das Verständnis von T. Trypanosoma Motilität und ähnliches Verhalten in Vivozu etablieren. Um dies zu erreichen, wir injiziert transparent Zebrafischlarven mit Gewebekulturen beschrifteten Trypomastigotes, zellulären Form verursacht die Infektion des Menschen, und die Bewegung der T. Trypanosoma in den Kreislauf der Zebrafisch identifiziert verwenden LSFM.

<table><tbody><tr><td>0,5-10 &mu; L Mikropipette</td><td>Fisherbrand</td><td>21-377-815</td><td></td></tr><tr><td>Agarose RA</td><td>Amresco</td><td>N605</td><td>Regular</td></tr><tr><td>Agarose SFR</td><td>Amresco</td><td>J234</td><td>Niedriger Schmelzpunkt</td></tr><tr><td>Aquarium Salz</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Zellzählkammer</td><td>Boeco</td><td>Neubauer&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflaschen</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>ThermoFisher</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Detektionsobjektiv</td><td>Nikon 40x 0,8NA&nbsp;</td><td>40x CFI APO NIR</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 feine Pinzette</td><td>World precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoat Methansulfonat Salz (Tricain)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00-01</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Chroma</td><td>ET-525/50M</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillaren für die Embryonalfixierung</td><td>Vitrez Medical</td><td>160215</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillaren zum Ziehen von Nadeln</td><td>World precision instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>156300-80</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Corporation</td><td>Revco</td><td></td></tr><tr><td>Larval Mikrospritzgussform</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>I-34</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>Crystalaser</td><td>DL488-050</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>250300-81</td><td></td></tr><tr><td>Methylenblau</td><td>Albor Qu&iacute; micos</td><td>12223</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulatorsystem</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-200</td><td>für LSFM&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikropipetten-Abzieher-Vorrichtung&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>CX31</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop (invers)</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Mehrzweckmikroskop</td><td>Nikon</td><td>AZ100M</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Zählkammer</td><td>Boeco Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 94x16</td><td>Greiner bio-one</td><td>633181</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff-Pasteurpipette</td><td>Fisherbrand</td><td>11577722</td><td></td></tr><tr><td>Rotationstisch</td><td>Newport</td><td>CONEX-PR50CC</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4130</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Nikon</td><td>C-LEDS</td><td></td></tr><tr><td>Tricain (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Amresco</td><td>M151</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>Tuben 15 ml</td><td>Corning</td><td>05-527-90</td><td></td></tr></tbody></table>

gründung der larven zebrafisch als tier-modell zu untersuchen trypanosomen trypanosoma motilität in vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas-Krankheit ist eine parasitäre Infektion durch Trypanosomen Trypanosoma, deren Motilität nicht nur wichtig für die Lokalisierung, sondern auch für zelluläre Bindung und Invasion ist. Aktuelle Tiermodelle für die Untersuchung von T. Trypanosoma ermöglichen begrenzt Beobachtung des Parasiten in-vivo, eine Herausforderung für Verständnis Parasit Verhalten in der Anfangsphase einer Infektion beim Menschen darstellt. Diese Protozoen hat eine flagellar Bühne in Vektor und Säugetieren beherbergt, aber es gibt keine Studien beschreiben die Motilität in Vivo. Das Ziel dieses Projektes war, ein live vertebrate Zebrafisch Modell um T. Trypanosoma Motilität im Gefäßsystem zu bewerten. Transparente Zebrafisch, die Larven mit Gewebekulturen injiziert wurden Trypomastigotes beschriftet und mit leichten Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM), eine nicht-invasive Methode zur Visualisierung von lebenden Organismen mit hoher optischer Auflösung beobachtet. Die Parasiten könnte für längere Zeit aufgrund dieser Technik relativ geringes Risiko von lichtbedingten im Vergleich zu konfokale visualisiert oder Epifluoreszenz Mikroskopie. T. Trypanosoma Parasiten beobachtet Reisen in das zirkulierende System live Zebrafisch in unterschiedlich großen Blutgefäßen und das Eigelb. Sie konnte auch den Dottersack-Wand und der ventrikulären Ventil trotz der starken Kräfte verbunden mit Herz Kontraktionen verbunden gesehen werden. LSFM von T. Trypanosoma-beimpften Zebrafischlarven ist eine wertvolle Methode, kann verwendet werden, um Parasiten im Umlauf zu visualisieren und auswerten ihrer Tropismus Migrationsmuster und Motilität im dynamischen Umfeld des Herz-Kreislauf-Systems von einem lebenden Tier.

Optimale Bedingungen für die Injektion:
Gruppen von Zebrafischlarven wurden in 24, 48, 72, 96 und 120 injiziert hpf, an verschiedenen anatomischen Standorten und ihr Überleben war jeden Tag für 5 Tage untersucht. Nach 5 Tagen-Injektion Post, Embryonen injiziert um 24 Uhr hpf hatte 6,25 % (2/32) überleben, während 95 % (38/40) der Larven an 48 injiziert hpf überlebt. Als Kontrolle wurden Larven mit 1 X PBS als Vehikel injiziert. Es gab keine Unterschiede im Überleben zwischen Fahrzeug injiziert und Parasiten injiziert Larven, zeigt keine parasitären abhängigen Auswirkungen auf die Überlebensrate der Fische (p = 0,08). Larven, die zwischen 72-120 hpf injiziert hatte vergleichbare Überlebensraten für 48 hpf injiziert Larven bei konstanter Injektionsvolumen. Für alle hier vorgestellten Verfahren dienten 48 hpf-Larven durch ihre einfache Manipulation und Organe und leicht durchlässigen Haut ohne offensichtlich Schaden nach Injektion entwickelt haben.
Larven an 48 injiziert hpf waren in den Perikardialraum injiziert, tail, Muskel, Hinterhirn Ventrikel Gleichheitspartei Vesikel, Chorda und Leitung des Cuvier in dem Dottersack. Es gab keine Unterschiede für das Überleben der Larven an unterschiedlichen anatomischen Standorten injiziert. Allerdings war die schnellste und einfachste Region zu injizieren, dass das Rohr von Cuvier befindet sich im vorderen Teil der Dottersack (Abbildung 1, Film 1). Injektionen an diesem Standort erlaubt die Einführung von höheren Volumen mit einem geringeren Risiko von Verletzungen zu lebenswichtigen Strukturen. Darüber hinaus ist diese Region zwischen 24-72 hpf, einen optimalen Standort zu entwickelnden Gefäßsystem und Herz11direkt zugreifen.
Parasit-Visualisierung mit LSFM:
Im Zebrafischlarven mit LSFM aufgrund ihrer CFSE-Fluoreszenzsignal und die optische Transparenz der die Larven wurden innerhalb von 8-10 min nach Injektion von T. Trypanosoma in den Kanal von Cuvier Parasiten identifiziert. Nach der Inokulation wurden Parasiten beobachtet, dass entweder Mauern um das Herz-Kreislauf-System oder in die Richtung des Blutflusses (Abbildung 2, Abbildung 3) eingehalten. Wenn ein Parasit an einer kardialen Struktur wie der ventrikulären Ventil bleibt schwingt es mit Herz Kontraktionen, darauf hinweist, dass die molekularen Mechanismen für die Einhaltung des Parasiten in unserem vertebrate Modell (Film 2, Film 3 wirksam sein könnte Ergänzende Film 1). T. Trypanosoma eingehalten werden auch die Wände des larvalen Dottersack ( Abbildung 2, Movie 2), eine Struktur, die später resorbiert werden und werden Sie Teil der Zebrafisch Darm22. Dies könnte ähnlich wie was passiert während der Phase der chronischen Krankheit bei infizierten Menschen, wo sind Parasiten in Kardiomyozyten und in der Verdauung Nervensystem23,24gefunden werden. Wenn nicht angeschlossen, trieb die Parasiten durch den Blutfluss in die gleiche Richtung wie die Erythrozyten ( Abbildung 3, Movie 4). Parasiten in verschiedenen großen Gefäßen der Fische beobachtet werden konnte, aber wurden häufiger in den Perikardialraum und in der angrenzenden Eigelb-Region, die Durchblutung ( Abbildung 2, Abbildung 3, ergänzende Film 2) enthalten.
10 min Post Injektion war es schwieriger, vor Ort einzelne Formen des Parasiten aufgrund ihrer Verbreitung auf das Gefäßsystem und die Unfähigkeit, schnell Bildschirm verschiedene anatomische Standorte der Fische durch eine eingeschränkte Sichtfeld LSFM (bei 40 X Vergrößerung ). Nach 24 Stunden post Injection (Hpi), das CFSE-Signal beginnt in der Region in der Nähe von den Entwicklungsländern Darm (ergänzende Abbildung 1) ansammeln.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56238/56238fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Optimalen Injektionsstelle. (A) Bild der Larve 48 hpf zeigt der optimalen Injektionsstelle auf den Kanal von Cuvier (gelber Pfeil) mit einem regelmäßigen Stereoskop. (B) Magnified anzeigen Box in eine zeigt den Kanal von Cuvier (gelber Pfeil). Maßstabsleiste = 200 µm (A), 50 µm (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/56238fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56238/56238fig2.jpg"> 
Abbildung 2: LSFM Bilder eines statischen Parasiten in 48 hpf Larve. T. Trypanosoma Parasit (gelber Pfeil) bleibt an den Wänden der Dottersack, während die Zeitraffer-Sequenz eingehalten (7,2 s, 17,2 s und 27,2 s), ca ~ 15 min nach der Injektion von Parasiten. Keine Änderung der Stellung des Parasiten wird beobachtet, während eines Erwerb mindestens 30 s. a, Atrium; V, Ventrikel. Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/56238fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56238/56238fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Flugbahn eines Parasiten Reisen in den Perikardialraum mit LSFM. T. Trypanosoma Parasiten kann beim driften in den Perikardialraum (PS), nach der Richtung des Blutflusses (Track in rot dargestellt) nachverfolgt werden etwa ~ 15 min nach der Injektion von Parasiten. Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/56238fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/56238/56238mov1.jpg"> 
Movie 1: Blutzirkulation Tal von Eigelb in eine Larve 48 hpf. Film von einer Larve 48 hpf zeigt die Blut-Zirkulation-Tal oder Kanal von Cuvier mit einem regelmäßigen Stereoskop. Verschiedene Regionen konzentrieren während des Videos, roten Blutkörperchen zirkulieren in den Kanal zu zeigen. Gelber Pfeil zeigt die optimalen Injektionsstelle. Film aufgenommen wurde ca. 10-15 min nach der Injektion der Parasit. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Movie_1.mp4" target="_blank">Klicken Sie bitte hier um das Video herunterzuladen.</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/56238/56238mov2.jpg"> 
Film 2: T. Trypanosoma Parasiten an Wände von dem Dottersack befestigt. LSFM Film eine Larve 48 hpf zeigen, dass T. Trypanosoma Parasiten nach Parasiten Injektion der Dottersack ca 10-15 min eingehalten bleiben. Keine Änderung in der Position des Parasiten beobachtet während eines Erwerb mindestens 30 s. a, Atrium; V, Ventrikel. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Movie_2.mp4" target="_blank">Klicken Sie bitte hier um das Video herunterzuladen.</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/56238/56238mov3.jpg"> 
Film 3: T. Trypanosoma Parasiten an die Wände des Herzens befestigt. LSFM Film von einer Larve 48 zeigt, dass T. Trypanosoma Parasiten Dreijahres hpfn an der Herz-Kreislauf-Wand, trotz starken Herzen Kontraktionen eingehalten ca. 10-15 min nach der Injektion der Parasit. Erythrozyten können als schwarze abgerundete Schatten beobachtet werden. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Movie_3.mp4" target="_blank">Klicken Sie bitte hier um das Video herunterzuladen.</a>
<img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/56238/56238mov4.jpg"> 
Movie 4: Parasiten bewegt sich in den Perikardialraum. LSFM Film eine Larve 48 hpf zeigt T. Trypanosoma Parasiten treiben in den Perikardialraum. Zwei Parasiten können zu verschiedenen Zeitpunkten (ID 1, im roten Kreis und ID 2 im gelben Kreis), zurückverfolgt werden, nach einem ähnlichen Flugbahn. Der Film verzeichnete ca. 10-15 min nach der Injektion der Parasit. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Movie_4.mp4" target="_blank">Klicken Sie bitte hier um das Video herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung1: Akkumulation von CFSE-Fluoreszenzsignal im Eigelb. Stereoskop-Bildern der Wildtyp Larve injiziert um 48 hpf auf den Kanal von Cuvier. CFSE-Fluoreszenzsignal sammelt sich nach und nach in das Eigelb nach zwei Tagen-Injektion (48 Hpi Post). Maßstabsleiste = 500 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Supplemental_figure_1.tif" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.</a>
Ergänzende Film 1: Parasiten an Wänden und Ventile des Kreislaufsystems befestigt. Stereoskop Zeit Reihe Bilder der Wildtyp Larve injiziert um 48 hpf. Bilder werden in 0,2 s Abständen Erfassung T. Trypanosoma Parasiten bewegen im Gleichtakt mit Kontraktionen des Herzmuskels bei ventrikulären Valve aufgenommen. Film war ca. 30 min nach der Injektion der Parasit aufgezeichnet. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Supplemental_movie_1.mp4" target="_blank">Klicken Sie bitte hier um das Video herunterzuladen.</a>
Ergänzende Movie 2: Bewegung und eingehalten Parasiten in der periventrikulären Raum und Eigelb. LSFM Film eine Larve 48 hpf zeigt T. Trypanosoma Parasiten driften oder den Perikardialraum oder das Eigelb eingehalten. Übertragene Licht Blick beobachtet für die ersten 5 s. Die Fluoreszenz-Ansicht wurde vom 5.2-25,8 s beobachtet. Der Film verzeichnete ca. 10-15 min nach der Injektion der Parasit. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Supplemental_movie_2.mp4" target="_blank">Klicken Sie bitte hier um das Video herunterzuladen.</a>

In diesem Protokoll Eindringmittel beschrifteten T. Trypanosoma wurden in durchsichtigen Zebrafischlarven injiziert und Parasiten Motilität wurde in Vivo mit Lichtblattmikroskopie Fluoreszenz beobachtet.

Gründung der Larven Zebrafisch als Tier-Modell zu untersuchen Trypanosomen Trypanosoma Motilität In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Zebrafisch als In-vivo-Modell zur Untersuchung der Motilität von Trypanosoma cruzi zu etablieren. Trypanosoma cruzi ist der Parasit, der die Chagas-Krankheit verursacht. Dabei handelt es sich um eine vernachlässigte Tropenkrankheit, die hauptsächlich durch Vektoren in Lateinamerika und in einigen Regionen der Vereinigten Staaten übertragen wird.Der Parasit wird durch den Vektor-Fäkalien, die den infektiösen Teil enthalten, auf den Menschen übertragen und vervielfältigt sich anschließend in den Wirtszellen. Die Geißelbewegung ermöglicht es dem Parasiten, sich im Körper fortzubewegen. Sie ist jedoch auch für die Anheftung bei der zellulären Invasion unerlässlich.Infektionsmodelle in vivo mit Trypanosoma cruzi finden hauptsächlich bei Nagetieren statt. Die Arbeit mit Undurchsichtigkeit erschwert die Verfolgung des Parasiten im Tierinneren. Die Parasitenmotilität wurde bisher nur in vitro untersucht; daher würde ein In-vivo-Modell ein besseres Verständnis wesentlicher Aspekte der Parasitenbewegung unter Strömungsbedingungen ermöglichen.Auf der Suche nach einem alternativen Modell fanden wir die Zebrafischlarven. Die Zebrafischlarve ist ein leistungsfähiges Modell, um Wirt-Pathogen-Interaktionen in vivo zu untersuchen. Sie sind klein, kostengünstig und im Vergleich zu Mäusen sehr einfach zu züchten.Sehr wichtig für unsere Studie ist, dass ihr Immunsystem dem des Menschen sehr ähnlich ist. Ihr adaptives Immunsystem beginnt erst vier Tage nach der Befruchtung mit der Entwicklung und reift bis zu vier Wochen danach aus, sodass wir ein sehr großes Zeitfenster haben, um ohne immunologische Störungen arbeiten zu können. Der größte Vorteil des Zebrabärblings für unsere Studie ist jedoch seine optische Transparenz.Dies macht es zu einem idealen Modell für die mikroskopische Untersuchung und Bildgebung. In Kombination mit allen genetischen Manipulationstechniken sowie den verfügbaren transgenen und mutierten Linien ergeben sich zahlreiche Forschungsmöglichkeiten. In diesem Video zeigen wir, wie Larven einer Mutante der Casper-Linie, die aufgrund fehlender Pigmentierung vollständig durchsichtig ist, verwendet werden können, um T.cruzi-Parasiten in vivo sichtbar zu machen.Um das Innere dieser Zebrafische sichtbar zu machen, verwenden wir die Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie. Die Lichtscheibenfluoreszenzmikroskopie ist eine Gruppe von Techniken, bei denen nur die Fokusebene des Detektionsobjektivs beleuchtet wird. Die Konsequenz daraus ist, dass kein Licht im Vorder- oder Hintergrund vorhanden ist, was selbst in tieferen Regionen der Embryonen zu klaren, scharfen Bildern führt.Da nur der Teil der Probe beleuchtet wird, der von Interesse ist, tritt wesentlich weniger phototoxischer Schaden an der Probe auf, was es ermöglicht, über längere Zeiträume hinweg Videos aufzunehmen. Hier visualisieren wir lebende T.cruzi-Parasiten innerhalb von Zebrafischlarven. Die Art des Lichtblatts ermöglicht es uns, hochauflösende Videos mit guter räumlicher und zeitlicher Auflösung im Vergleich zu konfokalen Mikroskopen aufzunehmen.Soweit wir wissen, wurden lebende Trypanosomen noch nie innerhalb eines lebenden Organismus visualisiert. Drei Tage vor den Injektionen setzen Sie gesunde Paare von männlichen und weiblichen Fischen oder einen männlichen mit zwei weiblichen Fischen in Zuchtbecken zusammen, um die Gesamtanzahl der Eierproduktion zu erhöhen. Sammeln Sie die abgelegten Eier gemäß dem Textprotokoll mithilfe eines kleinen Siebs ein.Spülen Sie die Eier ab, indem Sie das Sieb umdrehen und Ei-Wasser durch das Sieb in eine Petrischale gießen. Um die Embryonen gesund zu halten, reinigen Sie deren Wasser, indem Sie jeglichen Schmutz oder unbefruchtete Eier mit einer Plastik-Transferpipette entfernen. Anschließend platzieren Sie die Embryonen in einem Inkubator bei 28 Grad Celsius und wiederholen Sie den Reinigungsvorgang alle drei Stunden, um nicht lebensfähige Eier zu entsorgen und den Gelege gesund zu halten.48 Stunden oder zwei Tage nach der Befruchtung überprüfen, ob die meisten Embryonen geschlüpft sind. Falls erforderlich, entchorionieren Sie die Embryonen unter dem Stereomikroskop, indem Sie mit zwei spitzen Pinzetten die gegenüberliegenden Enden des Chorions greifen und vorsichtig an einem Ende ziehen, um es zu öffnen. Entfernen Sie das Chorion mit einer Transferpipette aus dem Wasser.Verwenden Sie zur Injektion zunächst dünne Glas-Kapillaren und ein Mikropipetten-Ziehgerät, um Nadeln mit einem Durchmesser von einem Millimeter herzustellen. Bewahren Sie die verschlossenen Nadeln in einer Petrischale auf einem Streifen aus Modelliermasse auf. Um die Mikroinjektionsform herzustellen, bereiten Sie eine 1,5 %ige Agaroselösung in destilliertem Wasser vor und gießen diese in eine Petrischale.Platzieren Sie anschließend eine vorgefertigte Mikroinjektionsform für Larven auf das Agarose und lassen Sie sie bei Raumtemperatur auf einer ebenen Fläche vollständig erstarren. Heben Sie die Mikroinjektionsform vorsichtig heraus und fügen Sie Wasser zur Lagerung bei vier Grad Celsius hinzu. Dies verhindert, dass die Agarose austrocknet.Bereiten Sie die Anästhetikumlösung vor, indem Sie Ei-Wasser zu dem geeigneten Volumen der Tricain-Standardlösung hinzufügen, um eine Endkonzentration von 150 Milligramm pro Liter zu erhalten. Lagern Sie die Lösung bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie abschließend einen Vorrat an Niedrigschmelzpunkt-Agarose für die Bildgebung vor, indem Sie Niedrigschmelzpunkt-Agarose-Pulver in Ei-Wasser bis zu einer Endkonzentration von 1 % auflösen. Erhitzen Sie die Mischung, bis die Agarose-Lösung homogen erscheint, und lagern Sie Aliquote bei vier Grad in 1,5-Milliliter-Reaktionsgefäßen. Parasiten werden aus einem Trypanosoma cruzi 01/DA-Isolat gewonnen und in einer humanen Astrozytomzelllinie kultiviert, die mit komplettem Medium in T25-Flaschen ergänzt wird. Nach drei oder vier Tagen Kultivierung treten die Parasiten aus den Zellen aus, und Trypomastigoten können aus dem Überstand gewonnen werden. Zentrifugieren Sie diesen Überstand fünf Minuten lang und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 1X PBS mit fetalem Kälberserum.Anschließend fünf Minuten zentrifugieren, den Überstand verwerfen und in einem Milliliter PBS resuspendieren. Für die Zählung der frei schwimmenden Parasiten 10 Mikroliter in einer Neubauer-Kammer entnehmen. Den restlichen Teil der resuspendierten Parasiten nehmen und ein Mikroliter CFSE hinzufügen sowie 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Fügen Sie anschließend PBS hinzu, um ein Gesamtvolumen von 10 Millilitern zu erreichen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet, das die markierten Parasiten enthält, in 100 Mikrolitern PBS. Nach diesem Markierungsverfahren ist es wichtig, durch direkte Visualisierung der Parasiten am umgekehrten Fluoreszenzmikroskop zu überprüfen, ob die Parasiten lebendig sind und korrekt markiert wurden.Überprüfen Sie im Durchlichtmodus, ob sich die Parasiten bewegen. Im Fluoreszenzmodus verwenden Sie den Feet-See-Filter, um die Parasitenmarkierung zu beurteilen. Füllen Sie zunächst die verschlossene Glasnadel mit 10 Mikrolitern der Lösung, die die Parasiten enthält, unter Verwendung einer Mikrolader-Pipettenspitze. Danach wird die Glasnadel in den Nadelhalter des Mikromanipulators eingesetzt. Unter dem Stereomikroskop wird mit feiner Pinzette etwa fünf Millimeter der Nadelspitze abgeschnitten. Anschließend wird der Larve 48 Stunden nach der Befruchtung in einer Tricain-Lösung ein Betäubungsmittel verabreicht, bis sie nicht mehr auf Berührung reagiert.Platzieren Sie die Larve in lateraler Position auf der Agaroseplatte unter dem Stereomikroskop. Stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass die Nadelspitze im Zentrum des Larvenyolks liegt. Stellen Sie die Parameter des Mikroinjektors ein.Injizieren Sie den Fisch im Blutkreislauf-Tal des Dotters. Überprüfen Sie, ob das Herz schlägt, und überführen Sie die Larve unverzüglich zur Erholung in frisches Ei-Wasser. Überführen Sie das injizierte Embryo in eine leere Petrischale und entfernen Sie vorsichtig das umgebende Wasser mit einer Plastikpipette und Saugpapier.Gegeben Sie sofort etwa 100 Mikroliter vorgewärmtes 1 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt hinzu, um das Embryo zu bedecken. Stellen Sie sicher, dass die Agarose nicht wärmer als 40 Grad Celsius ist. Führen Sie einen geraden Draht in eine Glas-Kapillare ein und verwenden Sie ihn als Kolben, um das Embryo in vertikaler Position aufzunehmen.Dies sollte schnell erfolgen, bevor sich das Agarose verfestigt. Während des Aufsaugens der Agarose darauf achten, etwas Agarose oberhalb des Embryos zurückzulassen und warten, bis es erstarrt ist. Falls nötig, die überschüssige Agarose unterhalb des Embryos herausdrücken und abschneiden.Füllen Sie die Probenkammer mit Tricaine-Lösung und stellen Sie die Temperatur der Probenkammer auf 28 Grad Celsius ein. Setzen Sie danach die Kapillare, die das Embryo enthält, in den Probenträger des Mikroskops ein und platzieren Sie sie auf der Mikromanipulator-Bühne. Drücken Sie das Ende, das das Embryo enthält, so weit heraus, dass es frei hängt.Positionieren Sie die Probe im Durchlichtmodus mithilfe eines XYZ-Mikromanipulatorsystems und eines Drehstages, der eine Drehung um die vertikale Achse ermöglicht, vor der Pupille des detektierenden Objektivs. Es ist hilfreich, zuerst eine Begrenzung der Kapillare scharfzustellen und dann die Probe zu verschieben, um den Embryo sowie die Strukturen von Interesse, wie beispielsweise das Herz oder die Gefäße, zu finden. Wechseln Sie nun in den Fluoreszenzmodus, verwenden Sie einen Laser mit einer Wellenlänge von 488 Nanometern oder einer ähnlichen Wellenlänge und stellen Sie die Beleuchtungsintensität sowie die Belichtungszeit so ein, dass eine Photo-Bleaching minimiert und die zeitliche Auflösung optimiert wird.Dazu sollte ein Objektiv mit einer guten numerischen Apertur gewählt werden. Starten Sie die Videoaufnahme des interessierenden Bereichs. In unserem Fall werden Parasiten beobachtet, die an den Klappen haften und sich frei im Herzbereich bewegen.Es wird empfohlen, ein Video einer einzelnen Ebene über die Zeit aufzunehmen oder den Mikromanipulator bzw. das Piezo- und Galvo-System zu verwenden, um verschiedene Ebenen zu fokussieren und der Parasitenbewegung zu folgen. Nach Abschluss der Aufnahme sollte das Embryo vorsichtig mit feinen Pinzetten und einem Haarschleifenwerkzeug aus dem Agarose entnommen werden. Das Fischchen wird anschließend in frisches Ei-Wasser zurückgebracht und 15 Minuten lang auf Erholung überprüft.Entsorgen Sie anschließend gemäß den Standardprotokollen Ihrer Einrichtung. Für alle hier beschriebenen Verfahren wurden Embryonen 48 Stunden nach der Befruchtung verwendet. Es könnten verschiedene anatomische Stellen zur Inokulation des Parasiten genutzt werden; jedoch ist das Blutgefäßnetz des Dottersacks oder der Ductus Cuvieri die schnellste und einfachste Region, um eine Injektion vorzunehmen und das Herz-Kreislauf-System zu erreichen.In acht bis zehn Minuten nach der Injektion von Trypanosoma cruzi in den Ductus Cuvieri werden die Parasiten im sich entwickelnden Herz-Kreislauf-System beobachtet. Einige Parasiten verbleiben an den Wänden des embryonalen Dottersacks oder an Herzkstrukturen wie der atrioventrikulären Klappe angeheftet. Die Parasiten sind bei Herzkontraktionen oszillierend zu sehen, was ihre wirksame Adhärenzmechanismus demonstriert.Außerdem werden Parasiten beobachtet, die mit dem Blutfluss in dieselbe Richtung wie die Erythrozyten im Perikardraum und in den Blutgefäßen treiben. Die von uns entwickelte Methode ermöglicht die In-vivo-Beobachtung von T.cruzi-Parasiten in transparenten Zebrafischlarven. Dies kann sehr nützlich sein, um die Dynamik eines Krankheitserregers, wie beispielsweise die Beweglichkeit durch Blut und Herzstrukturen in einem lebenden Wirbeltierorganismus, zu visualisieren und zu analysieren.Es ist wichtig, die Zeitspanne zwischen Injektion und Visualisierung kurz zu halten, um den frei schwimmenden Parasiten beobachten zu können. Außerdem ist es entscheidend, die Aufnahmeparameter bei Verwendung des Lichtblattmikroskops zu optimieren, um photoinduzierte Schäden zu minimieren und dennoch Bilder von guter Qualität zu erhalten. Die Mikroinjektion von T.cruzi in Zebrafischarven ist eine effektive Methode, um den Parasiten in die Blutbahn einzubringen.Mithilfe dieser Methode haben Sie die CFC-Markierung des Parasiten als praktisches Verfahren kennengelernt, das eine klare Visualisierung des Parasiten im Fisch ermöglicht. Die Injektion in den Ductus Cuvieri ist eine schonende Methode, um sicherzustellen, dass die Parasiten die Durchblutung passieren. T. cruzi neigt dazu, sich an den Herzklappen und den großen Gefäßen des Fisches anzulagern.Doch gemäß unseren Experimenten tritt keine zelluläre Infektion auf. Weitere Studien sind erforderlich, um ihre Tropezität zu klären.

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