Name: Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-05T08:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Lernen Sie die GSD-Superresolution-Mikroskopie zur Visualisierung und Quantifizierung von Membranproteinen in Säugerzellen. Diese Methode ermöglicht eine zehnfach höhere Auflösung als konventionelle Fluoreszenzmikroskopie.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der AHA an R.E.D (15SDG25560035) unterstützt. Autoren möchten Dr. Fernando Santana für den Einsatz des Mikroskops seiner Leica SR GSD-3D und Dr. Johannes Hell für die freundlicherweise Bereitstellung des FP1 Antikörpers erkennen.

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<li>Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One%2C+two+or+three%3F+Probing+the+stoichiometry+of+membrane+proteins+by+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy.</a> Sci Rep. 5, 14072(2015).</li>
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Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.

Die jüngste Explosion von Technologien, mit denen Bildgebung jenseits der Beugungsgrenze haben neue Fenster in die Komplexität der Säugetier-Zelle signalisieren in Raum und Zeit angeboten. Diese Technologien sind Sturm, STED, PALM, GSD, SIM und ihre Varianten (z.B. dSTORM, FPALM). Der Einfallsreichtum der Wissenschaftler hinter diesen Techniken ermöglichte uns, die Beschränkungen durch die Gesetze der Physik für die Beugung von Licht zu umgehen. Trotz dieser großen Leistung jede dieser Techniken macht eine Art K...

Zelluläre Reaktionen Signalisierung übersetzen wechselnde interne und externe Umgebungen um eine zelluläre Reaktion zu initiieren. Sie regelt alle Aspekte der menschlichen Physiologie, dienen als Grundlage für Hormon und Neurotransmitter-Freisetzung, der Herzschlag, Vision, Düngung und kognitive Funktion. Störung der diese Signalisierung Kaskaden kann gravierende Folgen in Form von pathophysiologischen Bedingungen wie Krebs, Parkinson und Alzheimer-Krankheit haben. Jahrzehntelang haben biologischer und medizinischer Forscher erfolgreich fluoreszierende Proteine, Sonden und Biosensoren gepaart mit Fluoreszenz-Mikroskopie als die wichtigsten Tools verwendet, um die genaue räumliche und zeitliche Organisation dieser zelluläre verstehen Signale.
Die Stärken des optischen Techniken wie Epifluoreszenz, konfokale, oder Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) sind ihre Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Kompatibilität mit live Cell imaging, während die große Einschränkung ist ihre Beugung begrenzte Auflösung, Bedeutung Strukturen oder Proteinkomplexe, die kleiner als 200-250 nm können nicht aufgelöst werden. Mit der theoretischen und praktischen Entwicklung von deterministischen Höchstauflösung (z.B.stimulierte Emission Depletion Mikroskopie (STED-1), strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM2) oder stochastische Höchstauflösung (z.B. , photoaktiviert Lokalisierung Mikroskopie (PALM3) oder Grundzustand Erschöpfung (GSD4,5)), laterale und axiale Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie erweitert darüber hinaus die Beugung Barriere zu Gunsten von Dutzende von Nanometern. So haben Ermittler nun die unvergleichliche Fähigkeit zu visualisieren und zu verstehen, wie Proteindynamik und Organisation Funktion auf in der Nähe von molekularer Ebene übersetzt.
Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie gefolgt von einzelnen Molekül zurück (GSDIM) oder einfach GSD umgeht wie es bekannt ist, die Beugungsgrenze durch Reduzierung der Anzahl der gleichzeitig emittierende Fluorophore4,5. Hochenergie-Laser-Licht wird zur begeistern der Fluorophore beschriftet Probe, bombardieren Elektronen mit Photonen und erhöhen die Wahrscheinlichkeit sie unterziehen einen "Spin-Flip" und geben Sie die Triole oder "Dark-Staat" aus dem angeregten Zustand4. Dies verbraucht effektiv den Grundzustand, daher der Name "Boden stand Erschöpfung". Im Triplett-Zustand Fluorophore emittieren keine Photonen und die Probe erscheint dunkler. Jedoch diese Fluorophore stochastisch in den Grundzustand zurück und können durch mehrere Photonen emittieren aufgeregt Grundzustand Übergänge vor der Rückkehr in den Triplett-Zustand gehen. Mit weniger Fluorophore aussenden zu einem bestimmten Zeitpunkt, Photon platzt aus einzelnen Fluorophore werden räumlich und zeitlich voneinander benachbarte Fluorophore emittiert. Das Platzen der Photonen kann mit einer Gaußschen Funktion, fit sein, die Position der Fluorophor mit einer Genauigkeit der Lokalisierung der berechneten Schwerpunkt davon, die abhängig von der numerischen Apertur (NA) des Objektivs, die Wellenlänge des Lichts verwendet entspricht für Erregung und entscheidend ist, die Anzahl der Photonen pro Fluorophor. Eine Einschränkung der GSD ist, dass da nur eine Teilmenge der Fluorophore aktiv jederzeit abgibt, Tausende von Bildern über mehrere Minuten zum Aufbau einer vollständigen Lokalisierung Karte gesammelt werden müssen. Die lange Erfassungszeit kombiniert mit der hohen Laser Leistungsbedarf bedeutet, dass GSD besser repariert anstatt live Proben geeignet ist.
Dieser Artikel beschreibt die Vorbereitung von festen Proben für die Höchstauflösung Mikroskopie Bildgebung der Membrane und das endoplasmatische Retikulum (ER)-resident Proteine (für eine Liste der notwendigen Verbrauchsmaterialien und Reagenzien siehe Tabelle of Materials). Beispiele wie dieses Protokolls leicht angepasst, um die Größe und Grad der Cluster-Bildung von L-Typ Voltage-gated Ca2 + -Kanäle (CaV1.2) in das Sarkolemm von kardialen Myozyten zu quantifizieren, oder verwendet werden kann, die zelluläre Verteilung von der Notaufnahme zu visualisieren, werden demonstriert. Verständnis für die Verteilung und Organisation dieser zellulären Komponenten ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Einleitung, Übersetzung und letztlich die Funktion der vielen Ca2 +-abhängige Signalisierung Kaskaden. Zum Beispiel sind CaV1.2 Kanäle für Erregung-Kontraktion Kupplung, während Rezeptor-vermittelte Ca2 + Entlassung aus der ER vielleicht die allgegenwärtige Signalkaskade in Säugetierzellen ist grundlegend wichtig.

<table><tbody><tr><td>KOH</td><td>Thermo Scientific</td><td>P250-500</td><td>Zum Reinigen von Deckglas</td></tr><tr><td>#1,5 Deckglas 18 x 18 mm</td><td>Marienfeld Superior</td><td>0107032)</td><td>Zum Züchten/Verarbeiten/Abbilden von Zellen</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>BP3994</td><td>Verdünnen auf 1x mit entionisiertem Wasser</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>Hilft bei der Zelladhäsion auf Deckglaslaminin</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>114956-81-9</td><td>Hilfsmittel bei der Zelladhäsion auf Deckglas</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150-059</td><td>Ventrikuläre Myozyten-Kulturmedien</td></tr><tr><td>DMEM 11995</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td>Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437028</td><td>Media Supplement</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Medien Zusatz</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CL</td><td>Zellkulturlösung</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Transientes Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Ca2+-frei PBS</td><td>Gibco</td><td>1419-144</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>100 % Methanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A414-4</td><td>Zellfixierung</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Elektron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Zellfixierung</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBR6504V</td><td>Zellfixierung</td></tr><tr><td>SEAblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>37527</td><td>BSA oder andere Blockierungslösungsalternativen existieren</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Detergens zur Permeabilisierung</td></tr><tr><td>der Zellen Kaninchen Anti-CaV1.2 (FP1)</td><td>Geschenk</td><td>N/A</td><td>Es gibt kommerzielle Anti-CaV1.2-Antikörper wie Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)</td></tr><tr><td>Mouse monoklonal anti-RFP</td><td>Rockland Inc.</td><td>200-301-379</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Donket Anti-Kaninchen-IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A31573</td><td>Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Anti-Maus-IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A11031</td><td>Sekundärer Antikörper</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Verhindert mikrobielles Wachstum für die Langzeitlagerung von Proben</td></tr><tr><td>Katalase</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td>Photoschaltender Pufferbestandteil</td></tr><tr><td>Glukoseoxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Photoschaltender Pufferbestandteil</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Photoschaltender Pufferbestandteil</td></tr><tr><td>Beta-Mercaptoethylaminhydrochlorid</td><td>Fisher</td><td>BP2664100</td><td>Photoschaltender Pufferbestandteil</td></tr>&<tr><td>beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>63689</td><td>Photoschaltender Pufferbestandteil</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td>Photoschaltender Pufferbestandteil</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D14-212</td><td>Photoschaltender Pufferbestandteil</td></tr><tr><td>Glas Depression Objektträger</td><td>Neolab</td><td>1 &ndash; 6293</td><td>Zum Montieren von Proben</td></tr><tr><td>Twinsil</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>Zum Versiegeln von Deckglas</td></tr><tr><td>sec61&beta;- mCherry Plasmid</td><td>Addgene</td><td>49155</td><td></td></tr><tr><td>Leica SR GSD 3D-Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waschblocklösung</td><td></td><td></td><td>20 % SEAblock in PBS</td></tr><tr><td>Primärantikörper-Inkubationslösung</td><td></td><td></td><td>0,5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS</td></tr><tr><td>Sekundärantikörper-Inkubationslösung</td><td></td><td></td><td>1:1000 in PBS</td></tr></tbody></table>

grundzustand erschöpfung super-resolution imaging in säugerzellen

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Fortschritte in der Fluoreszenz-Mikroskopie und Zellbiologie korrelieren eng mit der verstärkten Fähigkeit zu visualisieren, zelluläre Ereignisse führt häufig zu dramatischen Sprünge in unserem Verständnis, wie Zellen funktionieren. Die Entwicklung und Verfügbarkeit der Höchstauflösung Mikroskopie wurde erheblich erweitert die Grenzen der optischen Auflösung von ~ 250-20 nm. Biologen sind nicht mehr nur auf die Beschreibung der molekularer Interaktionen in Bezug auf NS1 innerhalb eines Bereichs von Beugung begrenzt, sondern es ist nun möglich, die dynamischen Wechselwirkungen einzelner Moleküle zu visualisieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Proteinen Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie für feste Zelle Bildgebung. Wir bieten Beispiele aus zwei verschiedenen Membranproteinen, Bestandteil des endoplasmatischen Retikulum Translocon, sec61β undeiner Plasmamembran lokalisiert Voltage-gated Typ L Ca 2 + -Kanäle (CaV1.2). Diskutiert werden spezifische Mikroskop Parameter, Fixierung Methoden, Foto-Umschaltung Puffer Formulierung und Fallstricke und Herausforderungen der digitalen Bildverarbeitung.

Wie in der Einleitung beschrieben, gibt es viele andere super-Auflösung Mikroskopie bildgebende Modalitäten. Dieses Protokoll konzentriert sich auf GSD Höchstauflösung Bildgebung. Repräsentative Bilder und Lokalisierung Karten sind in Abbildung 2 und Abbildung 3gezeigt.
Abbildung 2 zeigt eine COS-7-Zelle, mit der ER Protein, mCherry-Sec61β ...

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für den Nachweis von einem oder mehreren Plasma und/oder intrazellulären Membranproteinen mit Grundzustand Erschöpfung (GSD) Super-Auflösung Mikroskopie in Säugerzellen. Hier besprechen wir die Vorteile und die Überlegungen der Verwendung solcher Ansätze zur Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Proteinen.

Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Das übergeordnete Ziel dieser fluoreszenzbasierten Bildgebungstechnik besteht darin, zelluläre Proteine in fixierten Zellen mit einer auflösungsbeschränkten Unterschwellenauflösung sichtbar zu machen und zu quantifizieren, und zwar mithilfe einer Form der Super-Auflösungsmikroskopie, die als Mikroskopie der Grundzustandserschöpfung und individuellen Molekül-Rückkehr bezeichnet wird. Diese Methode hilft, zentrale Fragen im Bereich der Zellbiologie und Membranbiophysik zu beantworten, da sie die durch Beugung begrenzte Auflösung umgeht und es Forschern so ermöglicht, die Verteilung zellulärer Proteine präziser zu definieren, darzustellen und zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass es die Aufnahme von Bildern mit einer etwa zehnfach verbesserten Auflösung im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, wie beispielsweise der konfokalen Mikroskopie, ermöglicht.Den Versuch wird Oscar Vivas, ein Postdoktorand in meinem Labor, und Karen Hannigan, eine Postdoktorandin im Labor von Rose Dixon, demonstrieren. Zunächst bereiten Sie die Deckgläser und Zellen wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben vor. Danach fixieren Sie die Proben und führen eine Immunzytochemie durch, um die Plasmamembran und/oder die intrazellulären Membranproteine interessierter Art zu markieren.Bereiten Sie als Nächstes die Sauerstoff-scavengende Glock-Lösung vor, indem Sie 12,5 µL einer katalasehaltigen Stammlösung, 3,5 mg Glucose-Oxidase und 0,5 µL einer einmolaren Tris-Lösung zu 49,5 µL PBS in einem 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen hinzufügen. Verschließen Sie das Röhrchen und wirbeln Sie es kurz um, um die Bestandteile aufzulösen. Zentrifugieren Sie anschließend die Lösung drei Minuten lang.Bereiten Sie nun die photochemische Schaltlösung durch Auflösen von Beta-Mercaptoethylamin in PBS auf eine Konzentration von 100 Millimolar vor und stellen Sie den pH-Wert auf 8,0 ein. Portionieren Sie die Thiallösung und lagern Sie sie bis zu einer Woche im Gefrierschrank. Unmittelbar vor der Bildgebung mischen Sie die Thial- und Sauerstoffscavenger-Komponenten mit einem Salzpuffer und lagern die Lösung auf Eis.Unter Verwendung von 100 Mikrolitern der hergestellten Photo-Switching-Pufferlösung werden Deckgläser mit angefärbten Zellen auf Vertiefungsrutschen aufgebracht. Danach werden die Ränder des Deckglases mit einem Silikonkleber versiegelt, um eine schnelle Oxidation des Abbildungspuffers zu verhindern. Vor der Bildaufnahme einige Minuten warten, bis der Silikonkleber vollständig ausgehärtet ist.Andernfalls driftet die Deckglasplatte. Wählen Sie zunächst einen geeigneten Laser aus, um die Probe basierend auf dem gewählten Fluorophor zu beleuchten. Verwenden Sie für ein Alexa-647-Fluorophor einen 642-Nanometer-Laser.Als Nächstes wählen Sie den geeigneten dichroitischen Abbildungswürfel und das Objektiv aus. Öffnen Sie die Abbildungssoftware. Wählen Sie den 2D-Aufnahmemodus und stellen Sie dann die Belichtungszeit auf 11 Millisekunden ein.Stellen Sie außerdem die EM-Verstärkung auf 300 ein und wählen Sie eine geeignete Detektionsschwelle. Aktivieren Sie anschließend die automatische Ereignissteuerung und stellen Sie die Anzahl der Ereignisse pro Bild auf acht ein. Geben Sie die Pixelgröße mit 20 Nanometern an.Wechseln Sie im GSD-Tools-Tab zu den Optionen für die hochauflösende Bildberechnung und stellen Sie sicher, dass der Histogramm-Modus ausgewählt ist. Um Proteine an der Plasmamembran abzubilden, wählen Sie den TIRF-Modus aus und passen Sie den Einfallswinkel an, um die Eindringtiefe zu bestimmen. Stellen Sie anschließend die Laserintensität auf 100 % ein, um Elektronen in den dunklen Zustand zu überführen.Als Nächstes wählen Sie Einzelmolekülnachweis während des Pumpvorgangs aus und stellen die automatische Aufnahme ein, wenn die Frame-Korrelation 0,20 beträgt. Stellen Sie für die Aufnahme die Laserintensität auf 50 % und die Anzahl der Aufnahmeframes auf 60.000 ein. Beginnen Sie anschließend mit der Bildaufnahme.Um die Größe von Proteinclustern zu quantifizieren, öffnen Sie die Bilddatei einer Einzelmolekül-Lokalisierungskarte mit einem 10-Nanometer-Histogramm in ImageJ. Gehen Sie im Menü „Image“ zu „Adjust“ und verwenden Sie die Option „Auto“, um Helligkeit und Kontrast des Bildes zu optimieren. Wählen Sie anschließend im Menü „Type“ die Option „8-bit“.Öffnen Sie als Nächstes das Menü „Analysieren“, klicken Sie auf „Skala festlegen“ und geben Sie die hier gezeigten Werte ein. Wählen Sie dann im Menü „Analysieren“ die Option „Messungen festlegen“ und aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben der Option „Fläche“. Gehen Sie anschließend zurück zum Menü „Bild“, wählen Sie „Anpassen“, „Schwellenwert“ und danach „Über/Unter“.Verschieben Sie den Maximalwert auf 255, den Minimalwert auf eins und klicken Sie auf „Übernehmen“. Öffnen Sie abschließend das Menü „Analysieren“ und wählen Sie „Partikel analysieren“. Aktivieren Sie die Optionen für Pixel-Einheiten, Ergebnisse anzeigen und Zusammenfassen.Danach die Größe auf vier bis unendlich einstellen, die Option „Bare Outlines“ auswählen und auf „OK“ klicken. Die hier abgebildete Zelle wurde mit dem endoplasmatischen Retikulum-Protein mCherry-Sec61 beta transfiziert und mittels beugungsbegrenzter TIRF-Mikroskopie sowie superauflösender GSD-Mikroskopie im TIRF-Modus abgebildet. Diese Kurven stellen den Durchmesser der ER-Tubuli dar. Das rechte Bild zeigt eine Verbesserung der lateralen Auflösung und stellt eine genauere Darstellung der Struktur der ER-Tubuli dar.Die Verbesserung der Auflösung, die durch die Super-Auflösungs-GSD-Bildgebung geboten wird, wird in diesen Aufnahmen weiter veranschaulicht, die ein markiertes Herzmuskelzelle mit einem Anti-CAV-1.2-Antikörper zeigen. Im GSD-Modus ist die Verbesserung der lateralen Auflösung deutlich, und einzelne Kanalcluster lassen sich leichter identifizieren. Sobald der Protokollablauf beherrscht ist, kann dieser in weniger als drei Tagen abgeschlossen werden.Die Super-Auflösungs-Bildgebung einer einzelnen Zelle dauert 10 bis 30 Minuten, abhängig von der erforderlichen Anzahl an Bildrahmen. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Elektronenmikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie das fluoreszierende Protein von Interesse mit der komplexen zellulären Umgebung interagiert. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proben vorbereitet, aufgenommen und analysiert werden, um ein oder mehrere zelluläre Proteine mittels Super-Auflösungs-Mikroskopie sichtbar zu machen, basierend auf der Anreicherung einzelner Moleküle nach Ausschöpfung des Grundzustands.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben eine super-resolution imaging Methode, um die strukturelle Organisation des bakteriellen FtsZ-Ring, ein wesentlicher Vorrichtung zur Zellteilung zu untersuchen. Diese Methode basiert auf quantitativen Analysen von photoaktivierten Lokalisierungs-Mikroskopie (PALM) Bilder und kann auf andere bakterielle Proteine ​​des Zytoskeletts angewendet werden.

Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Raumzeitliche Informationen über dynamische Proteine in lebenden Zellen sind entscheidend für das Verständnis der Biologie. Eine Art von hochauflösender Mikroskopie, die als schnelle 3D-strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (f3D-SIM) bezeichnet wird, enthüllt einzigartige Informationen über den zytokinetischen Z-Ring in Bakterien: sowohl sein kügelchenartiges Aussehen als auch die schnelle Dynamik von FtsZ innerhalb des Rings.

Super-Resolution Imaging der zytokinetischen Z-Ring im Live-Bakterien mit Schnelle 3D-Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Wir beschreiben hier eine Kombination aus der glasgestützten Lipid-Doppelschichttechnik zur Bildung immunologischer Synapsen und der superhochauflösenden Bildgebungstechnik der STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion). Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Benutzern die notwendigen Anweisungen zur Verfügung zu stellen, um diese beiden Techniken erfolgreich durchzuführen.

Super-Resolution Imaging der natürlichen Killerzell Immunologische Synapse auf einem Glas-gestützten Planar Lipiddoppelschicht

PI (4,5) P 2 regelt verschiedene Zellfunktionen, aber die nanoskaligen Organisation in der Zellplasmamembran ist wenig bekannt. Durch Markierung PI (4,5) P 2 mit einer zweifarbige Fluoreszenzsonde zur Domäne Pleckstrin Homology fusioniert beschreiben wir einen neuen Ansatz der PI (4,5) P 2 in der räumlichen Verteilung der Plasmamembran im Nanometerbereich zu studieren .

Einzelmolekül-Super-Resolution Imaging von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat in der Plasmamembran mit neuartigen Fluoreszenzsonden

Herkömmliche BODIPY-Konjugate können für die livezellige Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) durch Ausnutzung ihrer vorübergehend bildenden, rot verschiebeten Bodenzustandsdimer eingesetzt werden. Wir präsentieren ein optimiertes SMLM-Protokoll zur Verfolgung und Auflösung subzellulärer neutraler Lipide und Fettsäuren in lebenden Säugetier- und Hefezellen auf der nanoskopischen Längenskala.

Konventionelle BODIPY-Konjugate für Live-Cell Super-Resolution-Mikroskopie und Single-Molecule Tracking

Hier wird ein Protokoll für die hochauflösende Bildgebung von Lebendzellen in intaktem Gewebe vorgestellt. Wir haben die Bedingungen für die Abbildung einer hochempfindlichen adulten Stammzellpopulation in ihrer nativen Gewebeumgebung standardisiert. Diese Technik beinhaltet das Ausbalancieren der zeitlichen und räumlichen Auflösung, um die direkte Beobachtung biologischer Phänomene in lebendem Gewebe zu ermöglichen.

Hochauflösende Live-Cell-Bildgebung subzellulärer Strukturen

Die Basalmembran ist essentiell für die Gewebe- und Organmorphogenese während der Entwicklung. Um die Mechanismen, die zur richtigen Platzierung dieser Struktur führen, besser zu verstehen, beschreibt das vorgestellte Protokoll Methoden zur Visualisierung und Charakterisierung des intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen in Epithelzellen mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie.

Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

Die hochauflösende Mikroskopie kann einen detaillierten Einblick in die Organisation von Komponenten innerhalb des synaptonemalen Komplexes bei der Meiose geben. Hier demonstrieren wir ein Protokoll zur Auflösung einzelner Proteine des Synaptonemalkomplexes Caenorhabditis elegans .

Super-Resolution-Mikroskopie des synaptonemalen Komplexes in der Keimbahn von Caenorhabditis elegans

Dieser Artikel bietet ein einfaches und klares Protokoll zur ortsspezifischen Markierung von Salmonella-sezernierten Effektoren mittels genetischer Code-Expansion (GCE) und zur Abbildung der subzellulären Lokalisation von sezernierten Proteinen in HeLa-Zellen mit Hilfe der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie...

Super-Resolution-Bildgebung von bakteriell sezernierten Proteinen mittels genetischer Code-Expansion

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Durchführung der tiefen, ganzzelligen Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) mit einem rotierenden Scheibenkonfokalmikroskop mit optischer Photonenzuordnung, wodurch DNA-PAINT-Bildgebung ohne individuelle Optik oder komplexe Beleuchtung erforderlich ist.

Ganzzell-Superauflösungsbildgebung mittels DNA-PAINT auf einer rotierenden Scheibe konfokal mit optischer Photonenumzuweisung

Dieses Protokoll beschreibt die fortschrittlichen Bildgebungsanwendungen und das gemeinsame Ressourcenmanagement eines laserabtastenden konfokalen Mikroskopsystems, das mit einem multiplexierten Array-Detektor für hochauflösende zelluläre und subzelluläre Bildgebung integriert ist. Der Workflow ermöglicht multimodale Bildgebung von Konfokal bis Superauflösung (~120 nm) innerhalb einer einzigen Plattform und macht die Visualisierung im Nanomaßstab zugänglicher.

Superauflösende Bildgebung und gemeinsames Management: Ein Protokoll für konfokale Mikroskopie mit Multiplex-Detektion

Lernen Sie die GSD-Superresolution-Mikroskopie zur Visualisierung und Quantifizierung von Membranproteinen in Säugerzellen. Diese Methode ermöglicht eine zehnfach höhere Auflösung als konventionelle Fluoreszenzmikroskopie.

Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen

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