Name: Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-05T08:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Lernen Sie die GSD-Superresolution-Mikroskopie zur Visualisierung und Quantifizierung von Membranproteinen in Säugerzellen. Diese Methode ermöglicht eine zehnfach höhere Auflösung als konventionelle Fluoreszenzmikroskopie.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der AHA an R.E.D (15SDG25560035) unterstützt. Autoren möchten Dr. Fernando Santana für den Einsatz des Mikroskops seiner Leica SR GSD-3D und Dr. Johannes Hell für die freundlicherweise Bereitstellung des FP1 Antikörpers erkennen.

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<li>Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One%2C+two+or+three%3F+Probing+the+stoichiometry+of+membrane+proteins+by+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy.</a> Sci Rep. 5, 14072(2015).</li>
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Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.

Die jüngste Explosion von Technologien, mit denen Bildgebung jenseits der Beugungsgrenze haben neue Fenster in die Komplexität der Säugetier-Zelle signalisieren in Raum und Zeit angeboten. Diese Technologien sind Sturm, STED, PALM, GSD, SIM und ihre Varianten (z.B. dSTORM, FPALM). Der Einfallsreichtum der Wissenschaftler hinter diesen Techniken ermöglichte uns, die Beschränkungen durch die Gesetze der Physik für die Beugung von Licht zu umgehen. Trotz dieser großen Leistung jede dieser Techniken macht eine Art K...

Zelluläre Reaktionen Signalisierung übersetzen wechselnde interne und externe Umgebungen um eine zelluläre Reaktion zu initiieren. Sie regelt alle Aspekte der menschlichen Physiologie, dienen als Grundlage für Hormon und Neurotransmitter-Freisetzung, der Herzschlag, Vision, Düngung und kognitive Funktion. Störung der diese Signalisierung Kaskaden kann gravierende Folgen in Form von pathophysiologischen Bedingungen wie Krebs, Parkinson und Alzheimer-Krankheit haben. Jahrzehntelang haben biologischer und medizinischer Forscher erfolgreich fluoreszierende Proteine, Sonden und Biosensoren gepaart mit Fluoreszenz-Mikroskopie als die wichtigsten Tools verwendet, um die genaue räumliche und zeitliche Organisation dieser zelluläre verstehen Signale.
Die Stärken des optischen Techniken wie Epifluoreszenz, konfokale, oder Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) sind ihre Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Kompatibilität mit live Cell imaging, während die große Einschränkung ist ihre Beugung begrenzte Auflösung, Bedeutung Strukturen oder Proteinkomplexe, die kleiner als 200-250 nm können nicht aufgelöst werden. Mit der theoretischen und praktischen Entwicklung von deterministischen Höchstauflösung (z.B.stimulierte Emission Depletion Mikroskopie (STED-1), strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM2) oder stochastische Höchstauflösung (z.B. , photoaktiviert Lokalisierung Mikroskopie (PALM3) oder Grundzustand Erschöpfung (GSD4,5)), laterale und axiale Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie erweitert darüber hinaus die Beugung Barriere zu Gunsten von Dutzende von Nanometern. So haben Ermittler nun die unvergleichliche Fähigkeit zu visualisieren und zu verstehen, wie Proteindynamik und Organisation Funktion auf in der Nähe von molekularer Ebene übersetzt.
Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie gefolgt von einzelnen Molekül zurück (GSDIM) oder einfach GSD umgeht wie es bekannt ist, die Beugungsgrenze durch Reduzierung der Anzahl der gleichzeitig emittierende Fluorophore4,5. Hochenergie-Laser-Licht wird zur begeistern der Fluorophore beschriftet Probe, bombardieren Elektronen mit Photonen und erhöhen die Wahrscheinlichkeit sie unterziehen einen "Spin-Flip" und geben Sie die Triole oder "Dark-Staat" aus dem angeregten Zustand4. Dies verbraucht effektiv den Grundzustand, daher der Name "Boden stand Erschöpfung". Im Triplett-Zustand Fluorophore emittieren keine Photonen und die Probe erscheint dunkler. Jedoch diese Fluorophore stochastisch in den Grundzustand zurück und können durch mehrere Photonen emittieren aufgeregt Grundzustand Übergänge vor der Rückkehr in den Triplett-Zustand gehen. Mit weniger Fluorophore aussenden zu einem bestimmten Zeitpunkt, Photon platzt aus einzelnen Fluorophore werden räumlich und zeitlich voneinander benachbarte Fluorophore emittiert. Das Platzen der Photonen kann mit einer Gaußschen Funktion, fit sein, die Position der Fluorophor mit einer Genauigkeit der Lokalisierung der berechneten Schwerpunkt davon, die abhängig von der numerischen Apertur (NA) des Objektivs, die Wellenlänge des Lichts verwendet entspricht für Erregung und entscheidend ist, die Anzahl der Photonen pro Fluorophor. Eine Einschränkung der GSD ist, dass da nur eine Teilmenge der Fluorophore aktiv jederzeit abgibt, Tausende von Bildern über mehrere Minuten zum Aufbau einer vollständigen Lokalisierung Karte gesammelt werden müssen. Die lange Erfassungszeit kombiniert mit der hohen Laser Leistungsbedarf bedeutet, dass GSD besser repariert anstatt live Proben geeignet ist.
Dieser Artikel beschreibt die Vorbereitung von festen Proben für die Höchstauflösung Mikroskopie Bildgebung der Membrane und das endoplasmatische Retikulum (ER)-resident Proteine (für eine Liste der notwendigen Verbrauchsmaterialien und Reagenzien siehe Tabelle of Materials). Beispiele wie dieses Protokolls leicht angepasst, um die Größe und Grad der Cluster-Bildung von L-Typ Voltage-gated Ca2 + -Kanäle (CaV1.2) in das Sarkolemm von kardialen Myozyten zu quantifizieren, oder verwendet werden kann, die zelluläre Verteilung von der Notaufnahme zu visualisieren, werden demonstriert. Verständnis für die Verteilung und Organisation dieser zellulären Komponenten ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Einleitung, Übersetzung und letztlich die Funktion der vielen Ca2 +-abhängige Signalisierung Kaskaden. Zum Beispiel sind CaV1.2 Kanäle für Erregung-Kontraktion Kupplung, während Rezeptor-vermittelte Ca2 + Entlassung aus der ER vielleicht die allgegenwärtige Signalkaskade in Säugetierzellen ist grundlegend wichtig.

<table><tbody><tr><td>KOH</td><td>Thermo Scientific</td><td>P250-500</td><td>Zum Reinigen von Deckglas</td></tr><tr><td>#1,5 Deckglas 18 x 18 mm</td><td>Marienfeld Superior</td><td>0107032)</td><td>Zum Züchten/Verarbeiten/Abbilden von Zellen</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>BP3994</td><td>Verdünnen auf 1x mit entionisiertem Wasser</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>Hilft bei der Zelladhäsion auf Deckglaslaminin</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>114956-81-9</td><td>Hilfsmittel bei der Zelladhäsion auf Deckglas</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150-059</td><td>Ventrikuläre Myozyten-Kulturmedien</td></tr><tr><td>DMEM 11995</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td>Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437028</td><td>Media Supplement</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Medien Zusatz</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CL</td><td>Zellkulturlösung</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Transientes Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Ca2+-frei PBS</td><td>Gibco</td><td>1419-144</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>100 % Methanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A414-4</td><td>Zellfixierung</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Elektron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Zellfixierung</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBR6504V</td><td>Zellfixierung</td></tr><tr><td>SEAblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>37527</td><td>BSA oder andere Blockierungslösungsalternativen existieren</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Detergens zur Permeabilisierung</td></tr><tr><td>der Zellen Kaninchen Anti-CaV1.2 (FP1)</td><td>Geschenk</td><td>N/A</td><td>Es gibt kommerzielle Anti-CaV1.2-Antikörper wie Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)</td></tr><tr><td>Mouse monoklonal anti-RFP</td><td>Rockland Inc.</td><td>200-301-379</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Donket Anti-Kaninchen-IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A31573</td><td>Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Anti-Maus-IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A11031</td><td>Sekundärer Antikörper</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Verhindert mikrobielles Wachstum für die Langzeitlagerung von Proben</td></tr><tr><td>Katalase</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td>Photoschaltender Pufferbestandteil</td></tr><tr><td>Glukoseoxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Photoschaltender Pufferbestandteil</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Photoschaltender Pufferbestandteil</td></tr><tr><td>Beta-Mercaptoethylaminhydrochlorid</td><td>Fisher</td><td>BP2664100</td><td>Photoschaltender Pufferbestandteil</td></tr>&<tr><td>beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>63689</td><td>Photoschaltender Pufferbestandteil</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td>Photoschaltender Pufferbestandteil</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>D14-212</td><td>Photoschaltender Pufferbestandteil</td></tr><tr><td>Glas Depression Objektträger</td><td>Neolab</td><td>1 &ndash; 6293</td><td>Zum Montieren von Proben</td></tr><tr><td>Twinsil</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>Zum Versiegeln von Deckglas</td></tr><tr><td>sec61&beta;- mCherry Plasmid</td><td>Addgene</td><td>49155</td><td></td></tr><tr><td>Leica SR GSD 3D-Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waschblocklösung</td><td></td><td></td><td>20 % SEAblock in PBS</td></tr><tr><td>Primärantikörper-Inkubationslösung</td><td></td><td></td><td>0,5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS</td></tr><tr><td>Sekundärantikörper-Inkubationslösung</td><td></td><td></td><td>1:1000 in PBS</td></tr></tbody></table>

grundzustand erschöpfung super-resolution imaging in säugerzellen

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Fortschritte in der Fluoreszenz-Mikroskopie und Zellbiologie korrelieren eng mit der verstärkten Fähigkeit zu visualisieren, zelluläre Ereignisse führt häufig zu dramatischen Sprünge in unserem Verständnis, wie Zellen funktionieren. Die Entwicklung und Verfügbarkeit der Höchstauflösung Mikroskopie wurde erheblich erweitert die Grenzen der optischen Auflösung von ~ 250-20 nm. Biologen sind nicht mehr nur auf die Beschreibung der molekularer Interaktionen in Bezug auf NS1 innerhalb eines Bereichs von Beugung begrenzt, sondern es ist nun möglich, die dynamischen Wechselwirkungen einzelner Moleküle zu visualisieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Proteinen Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie für feste Zelle Bildgebung. Wir bieten Beispiele aus zwei verschiedenen Membranproteinen, Bestandteil des endoplasmatischen Retikulum Translocon, sec61β undeiner Plasmamembran lokalisiert Voltage-gated Typ L Ca 2 + -Kanäle (CaV1.2). Diskutiert werden spezifische Mikroskop Parameter, Fixierung Methoden, Foto-Umschaltung Puffer Formulierung und Fallstricke und Herausforderungen der digitalen Bildverarbeitung.

Wie in der Einleitung beschrieben, gibt es viele andere super-Auflösung Mikroskopie bildgebende Modalitäten. Dieses Protokoll konzentriert sich auf GSD Höchstauflösung Bildgebung. Repräsentative Bilder und Lokalisierung Karten sind in Abbildung 2 und Abbildung 3gezeigt.
Abbildung 2 zeigt eine COS-7-Zelle, mit der ER Protein, mCherry-Sec61β ...

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für den Nachweis von einem oder mehreren Plasma und/oder intrazellulären Membranproteinen mit Grundzustand Erschöpfung (GSD) Super-Auflösung Mikroskopie in Säugerzellen. Hier besprechen wir die Vorteile und die Überlegungen der Verwendung solcher Ansätze zur Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Proteinen.

Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Das übergeordnete Ziel dieser fluoreszenzbasierten Bildgebungstechnik besteht darin, zelluläre Proteine in fixierten Zellen mit einer auflösungsbeschränkten Unterschwellenauflösung sichtbar zu machen und zu quantifizieren, und zwar mithilfe einer Form der Super-Auflösungsmikroskopie, die als Mikroskopie der Grundzustandserschöpfung und individuellen Molekül-Rückkehr bezeichnet wird. Diese Methode hilft, zentrale Fragen im Bereich der Zellbiologie und Membranbiophysik zu beantworten, da sie die durch Beugung begrenzte Auflösung umgeht und es Forschern so ermöglicht, die Verteilung zellulärer Proteine präziser zu definieren, darzustellen und zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieses Protokolls liegt darin, dass es die Aufnahme von Bildern mit einer etwa zehnfach verbesserten Auflösung im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren der Fluoreszenzmikroskopie, wie beispielsweise der konfokalen Mikroskopie, ermöglicht.Den Versuch wird Oscar Vivas, ein Postdoktorand in meinem Labor, und Karen Hannigan, eine Postdoktorandin im Labor von Rose Dixon, demonstrieren. Zunächst bereiten Sie die Deckgläser und Zellen wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben vor. Danach fixieren Sie die Proben und

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben eine super-resolution imaging Methode, um die strukturelle Organisation des bakteriellen FtsZ-Ring, ein wesentlicher Vorrichtung zur Zellteilung zu untersuchen. Diese Methode basiert auf quantitativen Analysen von photoaktivierten Lokalisierungs-Mikroskopie (PALM) Bilder und kann auf andere bakterielle Proteine ​​des Zytoskeletts angewendet werden.

Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Raumzeitliche Informationen über dynamische Proteine in lebenden Zellen sind entscheidend für das Verständnis der Biologie. Eine Art von hochauflösender Mikroskopie, die als schnelle 3D-strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (f3D-SIM) bezeichnet wird, enthüllt einzigartige Informationen über den zytokinetischen Z-Ring in Bakterien: sowohl sein kügelchenartiges Aussehen als auch die schnelle Dynamik von FtsZ innerhalb des Rings.

Super-Resolution Imaging der zytokinetischen Z-Ring im Live-Bakterien mit Schnelle 3D-Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Wir beschreiben hier eine Kombination aus der glasgestützten Lipid-Doppelschichttechnik zur Bildung immunologischer Synapsen und der superhochauflösenden Bildgebungstechnik der STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion). Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Benutzern die notwendigen Anweisungen zur Verfügung zu stellen, um diese beiden Techniken erfolgreich durchzuführen.

Super-Resolution Imaging der natürlichen Killerzell Immunologische Synapse auf einem Glas-gestützten Planar Lipiddoppelschicht

PI (4,5) P 2 regelt verschiedene Zellfunktionen, aber die nanoskaligen Organisation in der Zellplasmamembran ist wenig bekannt. Durch Markierung PI (4,5) P 2 mit einer zweifarbige Fluoreszenzsonde zur Domäne Pleckstrin Homology fusioniert beschreiben wir einen neuen Ansatz der PI (4,5) P 2 in der räumlichen Verteilung der Plasmamembran im Nanometerbereich zu studieren .

Einzelmolekül-Super-Resolution Imaging von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat in der Plasmamembran mit neuartigen Fluoreszenzsonden

Herkömmliche BODIPY-Konjugate können für die livezellige Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) durch Ausnutzung ihrer vorübergehend bildenden, rot verschiebeten Bodenzustandsdimer eingesetzt werden. Wir präsentieren ein optimiertes SMLM-Protokoll zur Verfolgung und Auflösung subzellulärer neutraler Lipide und Fettsäuren in lebenden Säugetier- und Hefezellen auf der nanoskopischen Längenskala.

Konventionelle BODIPY-Konjugate für Live-Cell Super-Resolution-Mikroskopie und Single-Molecule Tracking

Hier wird ein Protokoll für die hochauflösende Bildgebung von Lebendzellen in intaktem Gewebe vorgestellt. Wir haben die Bedingungen für die Abbildung einer hochempfindlichen adulten Stammzellpopulation in ihrer nativen Gewebeumgebung standardisiert. Diese Technik beinhaltet das Ausbalancieren der zeitlichen und räumlichen Auflösung, um die direkte Beobachtung biologischer Phänomene in lebendem Gewebe zu ermöglichen.

Hochauflösende Live-Cell-Bildgebung subzellulärer Strukturen

Die Basalmembran ist essentiell für die Gewebe- und Organmorphogenese während der Entwicklung. Um die Mechanismen, die zur richtigen Platzierung dieser Struktur führen, besser zu verstehen, beschreibt das vorgestellte Protokoll Methoden zur Visualisierung und Charakterisierung des intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen in Epithelzellen mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie.

Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

Die hochauflösende Mikroskopie kann einen detaillierten Einblick in die Organisation von Komponenten innerhalb des synaptonemalen Komplexes bei der Meiose geben. Hier demonstrieren wir ein Protokoll zur Auflösung einzelner Proteine des Synaptonemalkomplexes Caenorhabditis elegans .

Super-Resolution-Mikroskopie des synaptonemalen Komplexes in der Keimbahn von Caenorhabditis elegans

Dieser Artikel bietet ein einfaches und klares Protokoll zur ortsspezifischen Markierung von Salmonella-sezernierten Effektoren mittels genetischer Code-Expansion (GCE) und zur Abbildung der subzellulären Lokalisation von sezernierten Proteinen in HeLa-Zellen mit Hilfe der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie...

Super-Resolution-Bildgebung von bakteriell sezernierten Proteinen mittels genetischer Code-Expansion

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Durchführung der tiefen, ganzzelligen Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) mit einem rotierenden Scheibenkonfokalmikroskop mit optischer Photonenzuordnung, wodurch DNA-PAINT-Bildgebung ohne individuelle Optik oder komplexe Beleuchtung erforderlich ist.

Ganzzell-Superauflösungsbildgebung mittels DNA-PAINT auf einer rotierenden Scheibe konfokal mit optischer Photonenumzuweisung

Dieses Protokoll beschreibt die fortschrittlichen Bildgebungsanwendungen und das gemeinsame Ressourcenmanagement eines laserabtastenden konfokalen Mikroskopsystems, das mit einem multiplexierten Array-Detektor für hochauflösende zelluläre und subzelluläre Bildgebung integriert ist. Der Workflow ermöglicht multimodale Bildgebung von Konfokal bis Superauflösung (~120 nm) innerhalb einer einzigen Plattform und macht die Visualisierung im Nanomaßstab zugänglicher.

Superauflösende Bildgebung und gemeinsames Management: Ein Protokoll für konfokale Mikroskopie mit Multiplex-Detektion

Lernen Sie die GSD-Superresolution-Mikroskopie zur Visualisierung und Quantifizierung von Membranproteinen in Säugerzellen. Diese Methode ermöglicht eine zehnfach höhere Auflösung als konventionelle Fluoreszenzmikroskopie.

Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen

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