Name: Probenvorbereitung für die Endopeptidomic Analyse im menschlichen Liquor cerebrospinalis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Endopeptidomanalyse in menschlichem Liquor cerebrospinalis mittels Massenspektrometrie. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung niedrig abundanter Peptide als potenzielle Biomarker für neurodegenerative Erkrankungen.

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Vielen Dank an Tanveer Batth und Kollegen für die Beratung bei der Einrichtung der Pre-Fraktionierung-Methode.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Mittel vom schwedischen Forschungsrat, der Wallström und Sjöblom Foundation, die Waffe und Bertil Stohne Stiftung Stiftelse, Magnus Bergwall Stiftung, Åhlén Stiftung, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut und Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen und FoU Västra Götalandsregionen.
Die wichtigsten Empfänger von Zuschüssen für dieses Projekt waren Kaj Blennow, Henrik Zetterberg und Johan Gobom.

Die nachfolgend beschriebene Protokoll ist eine verfeinerte Version des einen in einer früheren Studie verwendet, wo eine große Menge von endogenen Peptiden in menschlichen CSF15identifiziert wurden. Updates für das ursprüngliche Protokoll betreffen kleine Änderungen der chemischen Vorbehandlung von CSF sowie Optimierung des Verlaufs für offline hohem pH-Wert RP HPLC Pre Fraktionierung verwendet.
Ethische Überlegungen
Alle Studien von schwedischen Patienten und Kontrolle von ethischen Komitees genehmigt worden: St. Göran (Nr. 2005-554-31/3). CSF aus Amsterdam Demenz Kohorte und Proben im National Hospital für Neurologie und Neurochirurgie, London gesammelt wurden für Forschung mit schriftlicher Zustimmung von allen teilnehmenden Patienten und Genehmigung von regionalen Ethik-Kommissionen eingesetzt. Hier hauptsächlich verwendete Material bestand aus übrig gebliebenen CSF von Proben zum Zweck der Diagnose und anonymisierte vor Aufnahme in unsere Studien. Es gibt keine Möglichkeit der Rückverfolgung der Probe jeden einzelnen Spender oder Gruppe von Gebern.
1. Gewinnung von menschlichen zerebrospinale Flüssigkeit (CSF):
<ol><li>Extrahieren von CSF durch Lumbalpunktion (muss durch einen ausgebildeten Arzt erfolgen) mit einem standardisierten Protokoll22.</li>
	<li>Zellenrückstand und andere nicht-löslichen Material durch Zentrifugation bei 2.500 x g für 20 min zu entfernen.</li>
	<li>Überprüfen Sie die CSF-Proben für die Verfärbung, die Blut-Kontamination durch Punktion Blutungen hinweisen. Die deutlich höhere Proteinkonzentration im Blut und das Vorhandensein von Proteasen kann großen Einfluss auf die Analyseergebnisse.</li>
</ol>(2) vor der Behandlung von CSF (1,5 mL Probenvolumen, keine Quantifizierung):
<ol><li>Tauen Sie 1,5 mL des CSF Aliquote bei Raumtemperatur (RT), übertragen Sie den Inhalt an 10 mL Polypropylenröhrchen und fügen Sie 80 µL 1 M Triethylammoniumhydrochlorid Bikarbonat (TEAB hinzu) als Pufferung Agent.</li>
	<li>Hinzufügen von 0,65 mL 8 M Guanidinium Hydrochlorid (GdnHCl) (aktive Konzentration GdnHCl: 2,4 M) und Vortex sanft bei RT für 10 Minuten. Hinweis: Der chaotropen Agent, GdnHCl, sowohl solvent Viskosität beeinflusst und interagiert mit der Polypeptidkette, die Ergebnisse in Protein entfaltet wird energetisch günstigen23. So GdnHCl löst Proteinaggregaten und erhöht die Regeneration von endogenen Peptiden während anschließende Filtration.</li>
	<li>Hinzufügen von 60 µL von 200 mM von wässrigen tris(2-carboxyethyl) Phosphin-Hydrochlorid (DÄMMUND) (aktive Konzentration DÄMMUND: 6 mM) und inkubieren Sie bei 55 ° C für 1 h, Cystein Disulphides zu reduzieren.</li>
	<li>Fügen Sie 35 µL 400 mM Iodoacetamide (IAA) (aktive Konzentration IAA: 4 mM) und in der Dunkelheit für 30 min, Cysteine Alkylat bei RT inkubieren. Die Zugabe von einer Alkylgruppe sorgt dafür, dass Cystein Rückstände an jedem beliebigen Punkt während der nachfolgenden Probenvorbereitung neue umgeformt Brücken spontan bilden können.</li>
	<li>Fügen Sie 3,25 mL deionisiertes Wasser und Vortex kurz auf die Probe vor der MWCO Filtration, was zu einer Gesamtstichprobe Volumen von 5,5 mL verdünnen. Dieser Schritt dient dazu, GdnHCl, unterhalb von 1 M zu verdünnen, da eine höhere Konzentration beobachtet wurde, manchmal dazu führen, dass die Auswaschung von Polymeren Substanzen aus der Filter-Geräte.</li>
</ol>(3) vor der Behandlung von CSF (10 x 150 µL Probenvolumen, isobare Kennzeichnung-Quantifizierung):
<ol><li>Tau 150 µL des CSF Aliquote ab 10 Personen bei RT und anschließend den Inhalt auf einzelne 1,5 mL niedrig-Bindung Mikro-Zentrifuge Röhren übertragen und 8 µL 1 m TEAB als Pufferung Agent hinzufügen.</li>
	<li>Fügen Sie 65 µL 8 M GdnHCl (aktive Konzentration GdnHCl: 2,4 M) und Vortex sanft bei RT für 10 Minuten.</li>
	<li>Fügen Sie 6 µL von 200 mM von wässrigen DÄMMUND (aktive Konzentration DÄMMUND: 6 mM) und Inkubation bei 55 ° C für 1 h, Cystein Disulphides zu reduzieren.</li>
	<li>Fügen Sie 3,5 µL 400 mM wässrigen IAA (aktive Konzentration IAA: 6 mM) und inkubieren Sie bei RT und die Finsternis für 30 min Cysteine Alkylat.</li>
	<li>Bereiten Sie das isobare Labeling Kit (zB., Tandem Masse Tag 10plex isobare Kennzeichnung Reagenz). Lassen Sie die Isobaren Kennzeichnung-Reagenz-Fläschchen, RT vor dem Öffnen sie vermeiden unnötige Reagenz Hydratation, 41 µL Acetonitril HPLC-Grade (AcN) hinzufügen und auflösen durch sanfte Bewegung für 5 min zu erreichen.</li>
	<li>30 µL isobare Kennzeichnung Reagenzlösung auf die entsprechende Probe übertragen und für 1 h bei RT unter schonenden rühren inkubieren. Das isobare Kennzeichnung Reagenz enthält eine NHS-Ester-Gruppe, die mit der primären Amine an Peptid N-Termini sowie mit Lysin Rückstände reagiert.</li>
	<li>Fügen Sie 8 µL 5 % Hydroxylamin (aktive Konzentration Hydroxylamin: 0,16 %) und schütteln Sie sie leicht bei RT für 20 min die Kennzeichnung Reaktion zu stillen. Da die gesondert gekennzeichneten Proben zusammengefasst werden sollen, sicherstellen Sie, dass die Kennzeichnung Reaktion gestillt ist. Durch Zugabe von einer Fülle von Amin Gruppen in Form von Hydroxylamin die verbleibenden isobare Kennzeichnung Reagenz reagieren darf und ist so träge gemacht.</li>
	<li>Kombinieren Sie den Inhalt jeder der 10 individuell beschrifteten Proben in einem einzigen 15 mL Polypropylen Röhrchen.</li>
	<li>Die kombinierte Probe und Wirbel kurz, die AcN-Konzentration von 12 % auf 3 % und die Konzentration der GdnHCl GdnHCl, unter 1 M reduzieren, da eine höhere Konzentration beobachtet wurde, manchmal dazu führen, dass die Auswaschung von Polymere Substanzen fügen Sie 6,4 mL deionisiertes Wasser hinzu der Filter-Geräte.</li>
</ol>(4) Molekulargewicht Cut-off-Filtration
<ol><li>Um Potenziale zu entfernen Verunreinigungen, Zustand der MWCO filtert nach laden 10 mL wässrige 1 M GdnHCl, 25 mM TEAB und Zentrifugieren für 15 min bei 2.500 x g und RT, verwerfen die Durchströmung (FT).</li>
	<li>Die gesamte Probe Ladevolumen auf dem Filter (5 mL nicht radioaktiv markierten CSF (Schritt 2.5) oder 10 mL isobarically etikettiert CSF (Schritt 3,9)) und Zentrifugieren für 30 min bei 2.500 x g und RT, lassen die Durchströmung (FT) in den Auffangbehälter. Das Ergebnis der Filtration ist, dass größere Proteine und Restmüll Zellenrückstand Peptiden und kleine Proteinen getrennt werden. Diesen Schritt kann die Peptidomic entspricht der Verwendung von proteolytische Verdauung von Proteinen als Peptide in Proteomic Experimente zu generieren.</li>
	<li>Laden Sie 5 mL 25 mM TEAB (wässrigen) auf den Filter und Zentrifuge für 15 min bei 2.500 x g und RT, um Wiederherstellung von Peptiden zu erhöhen.</li>
	<li>Wirbel der kombinierten FTs aus den zwei vorherigen Schritten (insgesamt 10 mL nicht gekennzeichnet oder 15 mL isobarically etikettiert Probe), und gehen Sie zum Beispiel Versauerung.</li>
</ol>5. de-Salzen und Probe Clean-Up durch Festphasenextraktion
<ol><li>Ansäuern der gefilterten Probe aus Schritt 4.4 vor Festphasenextraktion (SPE). Die Säuerung wird durchgeführt, um die gelösten (Peptid) Wechselwirkung mit der stationären Phase der SPE-Patrone zu verbessern.</li>
	<li>Für die Stichprobe nicht beschriftet (Volume 10 mL): 550 µL 1 % Trifluoroacetic Säure (TFA) - Gesamtvolumen der Probe hinzufügen: 10,55 mL mit 0,05 % TFA.</li>
	<li>Für das Beispiel Isobaren gekennzeichnet (Volumen 15 mL): Fügen Sie 20 mL 0,1 % TFA ansäuern und AcN-Konzentration von 3 % auf 1 % - Gesamtvolumen der Probe zu senken: 30 mL mit 0.066 % TFA. Hinweis: TFA ist auch für seine Funktion als ein Ion-Paarung Reagenz hinzugefügt, die Aufbewahrung von Peptiden selbst nicht in der Lage, ausreichend stark hydrophobe Wechselwirkung mit Verpackungsmaterial der SPE Patrone auf Vorrat zu speichernden verbessert.</li>
	<li>Wenn pH > 3, Titrieren Probe mit 20 % Phosphorsäure bis Probe pH ist < 3.</li>
	<li>Zustand der SPE Kartuschen durch Zugabe von 1 mL 84 % AcN, 0,1 % Ameisensäure (FA), und entsorgen die FT einmal wiederholen. Konditionierung der Filterpatrone ist erforderlich, um unerwünschte Substanzen zu entfernen, die ansonsten zusammen mit den Peptiden in den nachfolgenden Schritten eluieren würde; Darüber hinaus Klimaanlage erhöht die Durchlässigkeit des Filters.</li>
	<li>Equilibrate die SPE Patrone durch Zugabe von 1 mL 0,1 % TFA, verwerfen FT. Wiederholung einmal. Stellen Sie sicher, dass der Filter nach dem letzten Gleichgewichtherstellung Schritt - nicht trocken läuft immer eine kleine Menge auf den Filter. Gleichgewichtherstellung der Filterpatrone wird durchgeführt, um den Filter, Peptide zu behalten, durch das Entfernen der hydrophoben Substanz (Acetonitril) links von der Klimaanlage Schritt vorzubereiten.</li>
	<li>Laden Sie das gesamte Probenvolumen (10,55 mL für radioaktiv markierten Proben oder 30 mL für isobarically versehenen Proben), in mehreren Portionen bei Bedarf zu, und lassen Sie die FT Abfall stoßen. Stellen Sie sicher, dass die Patrone nicht trocken laufen zwischen Probe laden runden oder nach das letzten Probenvolumen geladen wurde - halten Sie eine kleine Menge auf den Filter.</li>
	<li>Pass 1 mL 0,1 % TFA über den Filter zu entfernen, salzen und Reagenzien und verwerfen die FT-Wiederholung einmal. Stellen Sie sicher, dass die Patrone nach jedem Waschen - nicht trocken läuft immer eine kleine Menge Flüssigkeit auf der Oberseite der Patrone.</li>
	<li>Statt 1,5 mL geringe Bindung Micro Zentrifugieren Rohre unter der Patrone und eluieren Probe indem man 1 mL von 84 % AcN, 0,1 % FA über die Patrone.</li>
	<li>Entfernen Sie das Lösungsmittel aus der de-gesalzene Probe durch Verdunstung in einer Vakuum-Zentrifuge laufen ohne aktive Heizung trocknen, bei-80 ° C lagern oder gehen Sie sofort zu hohem pH-Wert Fraktionierung.</li>
</ol>(6) Offline hohem pH-Wert Reverse Phase HPLC Probe Fraktionierung
<ol><li>
Bereiten Sie wässrigen hohem pH-Wert (HpH) mobilen Phasen: HpH Puffer A: Reinwasser HpH-Puffer B: 84 % AcN HpH-Puffer C: 25 mM NH4OH HpH laden Puffer: 2,5 mM NH4OH, 2 % AcN Hinweis: HpH laden Puffer wird als Transport-Lösung und Probe-Puffer verwendet.</li>
	<li>Wieder auflösen der Probe in 16 µL HpH laden Puffer durch sanfte Bewegung für 20 min.</li>
	<li>Laden Sie 15 µL der Probe auf einem HPLC-System mit einer internen Fraktionssammler für 96-Deep-Well-Platten konfiguriert nach Batth Et al. 20 mit geringfügigen Änderungen. Fraktionieren bei einem Durchfluss von 100 µL/min über einen pH-stabil-Trennsäule (C18 3,5 µm, 2,1 x 250 mm) und ein Bruchteil / min. über eine lineare 60 min-Gradienten zu sammeln.</li>
	<li>Verwenden Sie die folgende Steigung Zeit-Punkte: t = 0 min, B = 1 %, C = 10 %; t = 4 min, B = 1 %, C = 10 %, Start Fraktionssammlung; t = 76 min, B = 70 %, C = 10 %; Ende Fraktionssammlung; t = 76,5 min, B = 85 %, C = 10 %; t = 80 min, B = 85 %, C = 10 %; t = 80,5 min, B = 1 %, C = 10 % und t = 90 min, B = 1 %, C = 10 %.</li>
	<li>Sammeln Sie Brüche wiederholt in 12 Brunnen in einem kreisförmigen Muster, so verketten Bruchteile von 12 min, was 12 Fraktionen jeweils 6 verkettete Sub Fraktionen verteilt.</li>
	<li>Entfernen Sie des Lösungsmittels aus Proben von Vakuum Zentrifugation bei RT und 3000 u/min bis es trocken, und speichern Sie die Proben bei-80 ° C vor der LC-MS-Analyse.</li>
</ol>(7) LC-MS
<ol><li>
Bereiten Sie wässrige mobile Phasen: Puffer A: 0,1 % FA Puffer B: 0,1 % FA, 84 % AcN Puffer geladen: 0,05 % TFA, 2 % AcN Hinweis: Ladepuffer dient als Transportlösung, Probenpuffer und mobile Phase für die Beladung Pumpe.</li>
	<li>Lösen Sie jedes der 12 Fraktionen erneut durch Zugabe von 6 µL Ladepuffer und schütteln bei RT für 20 min auf</li>
	<li>Last 5 µL Probe auf eine Nano-Flow-HPLC, im Falle Spaltenkonfiguration (Trap-Säule: 75 µm 2 cm, C18100 Å Porengröße, 3 µm Partikelgröße; Trennsäule: C18, 75 µm x 500 mm, 100 Å Porengröße, 2 µm Partikelgröße , und führen Sie Peptid Trennung bei einem Volumenstrom von 150 nL/min mit der folgenden Farbverlauf: t = 0 min, B = 2 %; t = 10 min, B = 2 %; t = 11 min, B = 7 %; t = 100 min, B = 26 %; t = 170 min, B = 45 %; t = 175 min, B = 80 %; t = 181 min, B = 2 % und t = 210 min, B = 2 %.</li>
	<li>
Führen Sie MS auf hochauflösenden Hybrid Massenspektrometer mit der HPLC über eine Nano-ESI-Schnittstelle verbunden. Vollständiger Scan Spektren in MS-Modus in einer Auflösung von 120.000 (2.0e5 AGC Ziel) über den m/Z -Bereich 350-1.400 aufzeichnen.
	<ol>
<li>Betreiben Sie das Massenspektrometer in datenabhängiges Akquisitionsmodus, wählen Sie MS/MS-Spektren von den obersten zehn intensivsten Gipfeln mit m/Z > 150 und in der Intensität Range 1.0e4-1.0e5 für Fragment Ionenanalytik. Isolieren Sie Vorläufer Ionen mit einem Quadrupol-Isolierung-Fenster von 1 m/Z, maximale Einspritzzeit von 100 ms und die RF-Linse bei 60 %.</li>
		<li>Wenden Sie dynamische Ausgrenzung mit Ausschluss von 15 s und ein m/Z -Toleranz von ±10 ppm. Fragmentierung in der höheren Aufprallenergie Dissoziation (HCD) Zelle führen und MS/MS Übernahmen in der Orbitrap bei einer Auflösung von 50.000 (5.0e4 AGC Zielwert) aufzeichnen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. die Peptid-Identifikation
<ol><li>
Reichen Sie für Peptid-Identifikation die resultierenden Ausgabe-Dateien aus der massenspektrometrischen Analyse einer Proteomics-Suchmaschine, die Anwendung der folgenden Einstellungen ein: Hinweis: In unserem früheren Studie15, drei Suchmaschinen; Maskottchen v2.4, Sequest HT und Gipfeln 7.5 parallel verwendet wurden und die hier angegebenen Einstellungen wurden für alle drei Suchmaschinen eingesetzt, sofern nicht anders angegeben. Der Großteil der anpassbare Einstellungen sind universell für Peptid/Proteinidentifikation und entsprechende Einstellungen in einer bestimmten Suchmaschine haben sollte. Spektrum-Selektor: Min. Vorläufer Masse: 350 Da Max. Vorläufer Masse: 5.000 Da Scantyp: voll Signal-/Rauschverhältnis Schwelle: 1,5 Sequenz-Datenbank-Suche Datenbank: UniProt_SwissProt [version2015_11] Taxonomie: Homo sapiens Enzym: keiner Max. Spaltungen verpasst: 0 Instrument (nur Maskottchen): ESI-Trap Min. Peptid Länge (nur SequestHT): 6 Max. Peptid-Länge (nur SequestHT): 144 Vorläufer Masse Toleranz: 15 ppm Fragmentieren Masse Toleranz: 0,05 Da Statische Änderungen: Carbamidomethyl (C); [Wenn gekennzeichnet] TMT10plex (N-Bezeichnung) Dynamische Änderungen: Oxidation (M); [Wenn gekennzeichnet] TMT10plex (K) Peptid-Spektrum passen (PSM) validator Kaffeemaschine (Maskottchen und Sequest HT nur) oder Köder Fusion (nur Spitzen) Ziel der FDR: 0,01 Validierung anhand: Q-Wert</li>
</ol>

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<li>Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+the+effect+of+urea+and+guanidinium+chloride+on+the+dynamics+of+unfolded+polypeptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains.</a> J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).</li>
<li>Hölttä, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+Workflow+for+Multiplex+CSF+Proteomics+and+Peptidomics+Identification+of+Candidate+Cerebrospinal+Fluid+Biomarkers+of+Alzheimer%E2%80%99s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease.</a> J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte, finanziellen oder sonstigen zwischen Autoren sind berichtet worden.

Die Einführung eines hohem pH-Wert RP HPLC Pre Fraktionierung Schritts auf ein zuvor entwickelte Protokoll für die Wiederherstellung von endogenen Peptiden durch Molekulargewicht Ultrafiltration11 relative Probe Komplexität reduziert und dadurch für eine 5-fach größere erlaubt Probenvolumen untersucht werden. Dies wiederum erhöht die Konzentration der Teilmenge von Peptiden in jede Fraktion vertreten und dadurch verbessert die Chancen auf Erkennung von niedrigen reichlich Peptide.
<p class="jo...

Biomarker im Liquor cerebrospinalis (CSF) sind derzeit verwandelt Forschung in Neurodegenerative Erkrankungen. Bei der Alzheimer-Krankheit die häufigste Neurodegenerative Erkrankung, Auswirkungen auf mehr als 60 Millionen Menschen weltweit1,2, ein Biomarker-Triplett bestehend aus Peptid Amyloid Beta, Mikrotubuli-stabilisierenden Protein Tau, und eine Tau Form phosphoryliert und erkennt die Krankheit mit hoher Sensitivität und Spezifität in der diagnostischen Forschung Kriterien3aufgenommen wurde. In anderen neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Parkinson und Multiple Sklerose haben Proteomic Studien zahlreiche Biomarker Kandidaten identifiziert einige davon derzeit unter Bewertung klinischer Studien4,5 sind ,6.
Neben Proteinen enthält CSF auch eine Fülle von endogenen Peptiden7,8,9,10,11,12. Spaltprodukte des Gehirns abgeleitet Proteine bilden, stellen diese Peptide auch eine wichtige Quelle der Krankheit Biomarker. Um das Inventar der identifizierten endogene Peptide in menschlichen CSF zu erhöhen und CSF Endopeptidomic Analysen in klinischen Studien zu ermöglichen, wurde eine Methode entwickelt, für die Probenvorbereitung und LC-MS-Analyse (eine kurze Protokollschema ist in Abbildung 1 aufgenommen worden ). Die Anwendung dieser Methode in einer aktuellen Studie wurden fast 16.400 endogenen CSF Peptide in CSF Mischproben aus mehrere Personen der unspezifischen Diagnose, Erweiterung der bekannten CSF Endopeptidome um das Zehnfache13. Die Methode kann optional in Verbindung mit Isobaren Kennzeichnung Ansatz zur Quantifizierung verwendet werden.
Vorbereitung der Probe
Die wichtigste Quelle für Eiweiß Masse in CSF ist Plasma Bestandteile (z.B. Albumin und Immunglobuline) Überfahren der Blut Hirn-Schranke14,15. Ihre hohe Fülle erschwert die Erkennung von niedrig-reichlich, Brain-derived Beispielkomponenten. Endogene Peptide können leicht von der hohen reichlich Proteine, wodurch ein deutlich größeres Volumen von CSF-Peptid-Extrakt für LC-MS-Analyse, damit die Erkennung der unteren reichlich Peptide verwendet werden getrennt werden.
In dem hier vorgestellten Protokoll wurde Molekulargewicht Cut-Off (MWCO) Filtration verwendet die Proteinfraktion CSF Peptide getrennt; eine Methode, die in mehreren früheren verwendet wurde studiert8,9,10,11,12,16. Der Filtrationsschritt folgte ein offline RP HPLC Pre Fraktionierung Schritt über einen Gradienten von hohem pH-Wert mobilen Phase durchgeführt. Durch Schritten zwei RP HPLC im Tandem, mit pH wird der Hauptunterschied, ergibt sich der Unterschied in Selektivität zwischen den zwei Schritten hauptsächlich aus veränderten Peptid Thesaurierung als Folge unterschiedlicher Peptid Ladungszustände. Die Anwendung von hohem pH-Wert Peptid Pre Fraktionierung vor LC-MS unter sauren Bedingungen nachweislich effizient Peptid Identifikation17,18zu erhöhen und zu diesem Zweck in komplexen biologischen überlegen sein Proben im Vergleich zu mehr orthogonal Trennung Modi19, wie starke Katze-Ionenaustausch (SCX) und RP-20. Um die Analyse zu verkürzen, war eine Verkettung Schema verwendet bündeln alle 12th -Fraktion (z.B. Brüche 1, 13, 25, 37 und 49), die durch das hohe Auflösungsvermögen der RP-HPLC Co Elution von Peptiden aus verschiedenen noch weitgehend vermieden, Brüche in der LC-MS Schritt20,21.
Peptid-Identifikation
Peptid-Identifikation in Peptidomic Studien unterscheidet sich von der Proteomik-Studien, dass kein Enzym Spaltung in die Datenbankrecherche angegeben werden kann, und folglich Identifikation Preise in der Regel niedriger11 sind. Eine aktuelle Studie13 zeigte, dass die Identifizierung Preise für endogene Peptide mit Sequest und Maskottchen erhalten wesentlich verbessert wurden, wenn der Standardwert scoring-Algorithmus des jeweiligen Software-Programm mit der adaptive scoring geändert wurde Algorithmus Percolator, darauf hinweist, dass optimale scoring Algorithmen zur endogenen Peptiden unterscheidet sich von der tryptic Peptide13. Studie, Identifikation anhand automatischer Peptid de Novo Sequenzierung mit Hilfe der Software PEAKS (BSI) Ergänzend zu den zwei Fragment Ion fingerprinting-basierten Suchmaschinen gefunden wurde, identifiziert, wodurch eine erheblich größere Anzahl von Peptide.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 1 M Triethylammoniumbicarbonat</td><td>Fluka, Sigma-Aldrich</td><td>17902-100ML</td><td>TEAB</td></tr><tr><td>&nbsp; 8 M Guanidiniumhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7294-100ML</td><td>GdnHCl</td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid</td><td>Pierce</td><td>20490</td><td>TCEP</td></tr><tr><td>Iodacetamid</td><td>SIGMA</td><td>I1149-5G</td><td>IAA</td></tr><tr><td>Hydroxylamin 50% (w/w)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>457804-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril, Fern-UV, HPLC-Gradientenqualität</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-2L</td><td>AcN</td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Fluka, Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>56302-1mL-F</td><td>FA</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-10AMP</td><td>TFA</td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxidlösung</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>30501-1L-1M</td><td>NH4OH</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit mit Ultracel-30 Membran</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC903024</td><td>MWCO-Filter</td></tr><tr><td>Sep-Pak C18, 100 mg</td><td>Wasser</td><td>WAT023590</td><td>SPE-Säule</td></tr><tr><td>Resprep 12-Port SPE Verteiler&nbsp;</td><td>Restek</td><td>26077</td><td>Vakuumverteiler</td></tr><tr><td>TMT10plex Isobares Markierungsreagenzienset</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90110</td><td>TMT10plex</td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano LC System</td><td>Dionex</td><td>5200.0356</td><td>Online-Probentrennung</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binärsystem</td><td>Dionex</td><td>IQLAAAGABHFAPBMBEZ</td><td>Offline-Fraktionierung mit hohem pH-Wert</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Tribrid Massenspektrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td><td>Massenspektrometer für die Probenanalyse</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer 2.0&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGABSFAKJMAUH</td><td>Proteomics-Suchplattform</td></tr><tr><td>Mascot v2.4</td><td>Matrix Science</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Proteomik-Suchmaschine</td></tr><tr><td>Sequest HT</td><td>Thermo</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Proteomik-Suchmaschine</td></tr><tr><td>SPITZEN v7.5&nbsp;</td><td>Bioinformatik-Lösungen Inc.)</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Proteomik-Suchmaschine</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100, 75 & micro; m x 2 cm, C18, 100 & Aring; Porengröße, 3 & Mikro; m Partikelgröße</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>164535</td><td>Trap-Säule (Nano-HPLC)</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap C18, 75 & Mikro m x 500 mm, 100" Aring; Porengröße,&nbsp; 2 & Mikro; m Partikelgröße</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>164942</td><td>Trennsäule (Nano-HPLC)</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Hochleistungskonzentratoren</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SC210A-230</td><td>SpeedVac/Vakuum-Konzentrator</td></tr><tr><td>XBridge Peptide BEH C18 Säule, 130&Aring;, 3,5 &Mikro; m, 2,1 mm x 250 mm</td><td>Wasser</td><td>186003566</td><td>Trennsäule (Mikro-HPLC)</td></tr></tbody></table>

probenvorbereitung für die endopeptidomic analyse im menschlichen liquor cerebrospinalis

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode entwickelt, um die endogene Peptide in menschlichen zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) zu identifizieren. Zu diesem Zweck eine zuvor entwickelte Methode basierend auf Molekulargewicht Cut-Off (MWCO) Filtration und massenspektrometrische Analyse wurde mit einer offline hohem pH-Wert umgekehrter Phase HPLC Pre Fraktionierung Schritt kombiniert.
Sekretion in Liquor ist der Hauptweg zur Entfernung von Molekülen durch Zellen des zentralen Nervensystems zu vergießen. So spiegeln sich viele Prozesse in das zentrale Nervensystem im Liquor, eine wertvolle diagnostische Flüssigkeit zu rendern. CSF hat eine komplexe Zusammensetzung enthält Proteine, die einen Konzentrationsbereich von 8-9 Größenordnungen umfassen. Neben Proteinen haben frühere Studien auch die Anwesenheit einer großen Anzahl von endogenen Peptiden gezeigt. Während weniger intensiv erforscht als Proteine, können diese auch potentielles Interesse als Biomarker halten.
Endogene Peptide wurden von der CSF Proteingehalt durch MWCO Filtration getrennt. Einen Großteil der Proteingehalt aus der Probe entfernen, ist es möglich, das Probenvolumen studiert und damit auch der Gesamtbetrag der endogene Peptide zu erhöhen. Die Komplexität der Mischung filtriert Peptid wurde behoben, indem unter anderem einen umgekehrten Phase HPLC (RP) Pre-Fraktionierung Schritt bei alkalischen pH-Wert vor der LC-MS-Analyse. Die Fraktionierung wurde kombiniert mit einem einfachen Verkettung Regelung denen 60 Brüche in 12 gebündelt wurden, konnte Analyse Zeitverbrauch dadurch verringert werden, Co Elution noch weitgehend zu vermeiden.
Automatisierte Peptid Identifikation erfolgte durch mit drei verschiedenen Peptid/Protein-Identifikation-Software-Programme und kombinieren anschließend die Ergebnisse. Die verschiedenen Programme wurden ergänzende als vergleichbar mit weniger als 15 % von Identifikationen, die zwischen den drei überlappt.

Die hier beschriebene Methode wurde angewendet und evaluiert in drei Studien vor der Einführung der Probe vor Fraktionierung (Tabelle 1). Die erste Studie offline LC für spotting CSF Fraktionen auf eine MALDI-Zieltafel verwendet und 730 identifizierten endogene Peptide11ergeben. In den beiden folgenden Studien wurde die Isobaren Kennzeichnung eingesetzt. In erster Linie in einem Fall/Dimmer Studie zur Identifizierung und Charakterisierung potenzieller Biomarker in der CSF Endopeptidome und Proteom...

Eine Methode für die massenspektrometrische Analyse von endogenen Peptiden in menschlichen zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) wird vorgestellt. Durch den Einsatz von Molekulargewicht Cut-off-Filtration, chromatographische Pre-Fraktionierung, massenspektrometrischen Analyse und eine anschließende Kombination von Peptid-Identifikation-Strategien, war es möglich, die bekannten CSF Peptidome fast um das Zehnfache im Vergleich zu erweitern zu früheren Studien.

Probenvorbereitung für die Endopeptidomic Analyse im menschlichen Liquor cerebrospinalis

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, humane Liquorproben für die LC-MS-Analyse endogener Peptide vorzubereiten und zu analysieren. Ein Peptid-Präfraktionierungsschritt vor der LC-MS erhöht die Anzahl identifizierter Peptide und ermöglicht den Nachweis relativ seltener Liquorpeptide. Endogene Peptide im Liquor sind Calciummoleküle, die bisher wenig erforscht wurden und möglicherweise wichtige neue Biomarker neurodegenerativer Erkrankungen enthalten. Diese Methode ermöglicht eine umfassende Charakterisierung des Liquor-Peptidoms mittels Massenspektrometrie. Die Hauptvorteile dieser Methode liegen darin, dass sie die Injektion seltener Liquorpeptide ermöglicht und mit multiplexen isobaren Markierungstechniken kompatibel ist, wodurch sie für klinische Studien geeignet ist. Bisher haben wir diese Methode hauptsächlich zur Analyse von Liquor cerebrospinalis angewandt. Wir verfügen jedoch über Vorläufedaten, die darauf hindeuten, dass sie mit geringfügigen Modifikationen auch zur Analyse von Plasma- und Gewebeproben verwendet werden kann. Beginnen Sie damit, 1,5 Milliliter Aliquots des Liquors bei Raumtemperatur auf einem Rollmischer aufzutauen. Nach dem Auftauen überführen Sie den Inhalt i

sample-preparation-for-endopeptidomic-analysis-human-cerebrospinal

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Archiv Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten (FFPE) klinische Proben sind wertvolles Material für die Untersuchung von Krankheiten. Hier zeigen wir eine Probenvorbereitung Workflow ermöglicht eingehende Proteomanalyse mikrodissezierten FFPE Gewebe.

Proteomik Probenvorbereitung von Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten Gewebe

Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

Eine gemeinsame Proteinextraktionsprotokoll unter Verwendung von Harnstoff / Thioharnstoff / SDS Puffer für Mensch und Maus Hirngewebe ermöglicht indentification von Proteinen mittels 2D-DIGE und ihre anschließende Charakterisierung von Mini 2DE Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht es, mehr reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse aus menschlichen Biopsien und experimentellen Modellen zu erhalten.

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Wir beschreiben ein Hochdurchsatz-Multiplex, und gezielte proteomic Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) -Assay mit Potential für klinische Umsetzung entwickelt. Der Test kann für Neurodegeneration, wie Apolipoprotein E-Varianten (E2, E3 und E4), und messen deren allelische Expression potentielle Marker und Risikofaktoren zu quantifizieren.

Ein hoher Durchsatz, Multiplexed und Proteom-CSF-Assay Gezielte Quantifizieren Neurodegenerative Biomarkers und Apolipoprotein E Isoformen-Status

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Facettenreiche massenspektrometrische Untersuchung von Neuropeptiden in Callinectes sapidus

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Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn

Hier etablieren wir ein Protokoll mit minimalen Mengen an frisch gefrorenen Hirngewebeschnitten und einer zugänglichen Hochgeschwindigkeits-Zentrifugationsmethode in Verbindung mit Größenausschlusschromatographie, um kleine extrazelluläre Vesikel als Quellen für microRNA (miRNA)-Biomarker für neurologische Erkrankungen zu gewinnen.

Nutzung der Kraft von microRNA-Ladungen in kleinen extrazellulären Vesikel, die aus frisch gefrorenen menschlichen Gehirnabschnitten freigesetzt werden 

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Isolierung von Liquor aus Rodent Embryonen für die Verwendung mit Dissected Cerebral Kortikale Explantate

Lernen Sie eine Methode zur Endopeptidomanalyse in menschlichem Liquor cerebrospinalis mittels Massenspektrometrie. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung niedrig abundanter Peptide als potenzielle Biomarker für neurodegenerative Erkrankungen.

Probenvorbereitung für die Endopeptidomic Analyse im menschlichen Liquor cerebrospinalis

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