Probenvorbereitung für die Endopeptidomic Analyse im menschlichen Liquor cerebrospinalis
4. Dezember 2017
Eine Methode für die massenspektrometrische Analyse von endogenen Peptiden in menschlichen zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) wird vorgestellt. Durch den Einsatz von Molekulargewicht Cut-off-Filtration, chromatographische Pre-Fraktionierung, massenspektrometrischen Analyse und eine anschließende Kombination von Peptid-Identifikation-Strategien, war es möglich, die bekannten CSF Peptidome fast um das Zehnfache im Vergleich zu erweitern zu früheren Studien.
Das Ziel dieses Protokolls ist die Aufbereitung und Analyse von humanen Liquorproben für die LC-MS-Analyse endogener Peptide. Ein Peptid-Vorfraktionierungsschritt vor der LC-MS erhöht die Anzahl der identifizierten Peptide und ermöglicht den Nachweis von Liquorpeptiden mit relativ geringer Abundanz. Endogene Peptide im Liquor sind Kalziummoleküle, die noch nicht umfassend erforscht sind und möglicherweise wichtige neue Biomarker für neurodegenerative Erkrankungen enthalten könnten. Diese Methode ermöglicht eine umfassende Charakterisierung des Liquorpeptidoms mittels Massenspektrometrie. Die Hauptvorteile dieser Methode bestehen darin, dass sie die Injektion von Liquorpeptiden mit geringer Abundanz ermöglicht und mit isobaren Multiplex-Markierungstechniken kompatibel ist, wodurch sie für klinische Studien anwendbar ist. Bisher haben wir diese Methode vor allem bei der Analyse von Liquor cerebrospinalis angewendet. Wir haben jedoch vorläufige Daten, die darauf hindeuten, dass es mit geringfügigen Modifikationen auch für die Analyse von Plasma- und Gewebeproben verwendet werden kann. Beginnen Sie mit dem Auftauen von 1,5 Milliliter Liquor bei Raumtemperatur auf dem Rollenmischer. Nach dem Auftauen den Inhalt in 10-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen umfüllen. Und fügen Sie 80 Mikroliter eines molaren TAB als Puffermittel hinzu. Fügen Sie dann 0,65 Milliliter eines acht molaren Guanidiniumhydrochlorids hinzu, um Proteinaggregate aufzulösen, und wirbeln Sie es 10 Minuten lang sanft bei Raumtemperatur auf. Anschließend bei 60 Mikrolitern 200 Millimolar wässrigem TCEP inkubieren und bei 55
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Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur massenspektrometrischen Analyse endogener Peptide in menschlichem Liquor cerebrospinalis (CSF) vor. Durch die Anwendung einer Filtration mit Molekulargewichts-Cutoff, chromatographische Prä-Fraktionierung und massenspektrometrische Analyse erweitert die Forschung signifikant das bekannte CSF-Peptidom und verbessert dadurch die Identifizierung seltener Peptide, die als Biomarker für neurodegenerative Erkrankungen dienen könnten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Massenspektrometrie
- Biomarker-Entdeckung
Hintergrund
- Endogene Peptide im Liquor cerebrospinalis könnten bei der Identifizierung neurodegenerativer Erkrankungen von Bedeutung sein.
- Peptide im Liquor cerebrospinalis mit geringer Abundanz wurden bisher nicht umfassend untersucht.
- Bisherige Methoden haben nur begrenzte Daten zum Peptidom des Liquor cerebrospinalis geliefert.
Ziel der Studie
- Die Identifizierung und Charakterisierung endogener Peptide im menschlichen Liquor cerebrospinalis zu verbessern.
- Einen umfassenderen Überblick über das Liquor-Peptidom zu liefern.
- Das Potenzial neuer Biomarker bei neurodegenerativen Erkrankungen zu untersuchen.
Verwendete Methoden
- Massenspektrometrie mit Vorfraktionierung von CSF-Proben.
- Umfasst das Auftauen und Verarbeiten von 1,5 Milliliter Aliquots von CSF mit spezifischen Reagenzien.
- Vereinbar mit multiplexen isobaren Markierungstechniken.
- Kann mit geringen Modifikationen für die Analyse von Plasma- und Gewebeproben angepasst werden.
Hauptergebnisse
- Die Methode ermöglicht den Nachweis einer deutlich größeren Anzahl von Peptiden im Vergleich zu früheren Studien.
- Wesentliche Ergebnisse deuten auf das Vorhandensein bisher unerforschter Peptide mit geringer Häufigkeit hin.
- Liefert Erkenntnisse, die zur Entdeckung neuer Biomarker führen könnten.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert einen effizienten Ansatz zur Charakterisierung des CSF-Peptidoms.
- Die Vielseitigkeit der Methode eröffnet neue Möglichkeiten für klinische Studien zu neurodegenerativen Erkrankungen.
- Mögliche Implikationen für das Verständnis neuronaler Mechanismen und die Identifizierung von Krankheitsmarkern.
Häufig gestellte Fragen
Praktische Bedeutung für die Industrie
Diese Methode verbessert die Detektion von endogenen Peptiden mit geringer Häufigkeit in menschlichem Liquor cerebrospinalis, einem zentralen Bioliquid für die Entdeckung von Biomarkern bei neurodegenerativen Erkrankungen. Durch die Verringerung der Proteinvielfalt mittels MWCO-Fraktionierung und die Verbesserung der Peptidabdeckung über eine Vorfraktionierung mittels RP-HPLC bei hohem pH-Wert wird die analytische Empfindlichkeit für Target-Validierungsansätze erhöht. Der Ansatz unterstützt die mechanistische Risikominderung, indem er eine tiefere Profilierung des Peptidoms ermöglicht, die zur Abschätzung des Targetvertrauens in frühen Entwicklungsstadien und zur Auswahl prädiktiver Biomarker in zentralnervösen Wirkstoffentwicklungsprogrammen beitragen kann.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung endogener Peptidpopulationen, die pathophysiologische Prozesse im zentralen Nervensystem widerspiegeln, und unterstützt die Überprüfung von Wirkhypothesen.
- Operativer Wert: Verringert die Störung durch den dynamischen Bereich hochabundanter CSF-Proteine und verbessert dadurch die Detektion von Signalpeptiden in niedrigen Konzentrationen, die für die Modulation von Signalwegen relevant sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt reproduzierbare Peptid-Fraktionierungsmuster, die konsistente LC-MS/MS-Auslesungen für die Assay-Standardisierung ermöglichen.
- Operationaler Wert: Kompatibel mit multiplexen isobaren Markierungen, wodurch vergleichende Peptidom-Analysen zwischen Krankheits- und Kontrollkohorten in Biomarker-Screening-Workflows möglich sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Entdeckung von Biomarkern, indem CSF-abgeleitete Peptide identifiziert werden, die mit Mechanismen neurodegenerativer Erkrankungen korrelieren könnten.
- Operationaler Wert: Mit geringen Modifikationen auf Plasma- und Gewebeproben übertragbar, was die Validierung über verschiedene Probenarten hinweg in translationsmedizinischen Abläufen unterstützt.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und unterstützt die hypothesengetriebene Erforschung des Peptidoms vor den Stadien der Leitstruktur-Identifizierung und präklinischen Validierung.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die unvoreingenommene Profilierung endogener Peptide, um krankheitsassoziierte Signalwege aufzuklären und die Zielvalidierung zu entlasten.
- Screening: Ermöglicht den Nachweis von Peptiden mit hoher Vertrauenswürdigkeit durch verminderte Probenvielfalt und verbesserte chromatographische Trennung.
- Analytik: Erzeugt quantitative, auflösungsabhängige Peptid-Daten, die mit markierungsbasierten Multiplexing-Methoden für vergleichende Studien kompatibel sind.
- Translationale Forschung: Bietet eine Grundlage für die Biomarker-Korrelierung, indem Veränderungen des Peptidoms im Liquor cerebrospinalis mit neurodegenerativen Prozessen verknüpft werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Der Kernablauf – MWCO-Filterung, Fraktionierung bei hohem pH-Wert und LC-MS – kann über verschiedene Labore hinweg standardisiert werden, um reproduzierbare Peptidomanalysen zu ermöglichen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Ausbeute an identifizierten Peptiden und ermöglicht den Nachweis von Spezies mit geringer Abundanz, die als mechanistische oder krankheitsassoziierte Indikatoren dienen können.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Vorfractionierung und verringert die technische Variabilität bei der Analyse komplexer Bioflüssigkeiten.
- Strategischer Wert: Steigert die Entscheidungssicherheit bei der Target-Validierung, indem der beobachtbare biologische Raum im Liquor cerebrospinalis erweitert wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Biomarkern durch umfassendere Abdeckung des Peptidoms und verbesserte Signalerkennung.
Durchführungsaspekte
- Es sind Fachkenntnisse im Umgang mit Liquor cerebrospinalis, der Proteaseinhibition und der massenspektrometrischen Peptidomik erforderlich.
- Die Ausstattung muss LC-MS/MS-Systeme umfassen, die mit einer Fraktionierung bei hohem pH-Wert kompatibel sind und eine empfindliche Peptiderkennung ermöglichen.
- Die Standardisierung zwischen verschiedenen Standorten erfordert eine konsistente Auswahl der MWCO-Filter, der Zusammenführung der Fraktionen sowie einheitliche, softwarebasierte Identifizierungsparameter.
- Die Anpassung an Plasma oder Gewebe erfordert die Optimierung der Lysing, Depletion und Fraktionierungsbedingungen, um der unterschiedlichen Matrixkomplexität Rechnung zu tragen.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören ein möglicher Peptidverlust während der Filtration sowie die Notwendigkeit einer sorgfältigen Kontaminationskontrolle aufgrund der Analyse niedrig abgereicherter Zielpeptide.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Pre-treatment of Bulk Volume CSF without Quantification
2:24
Pre-treatment of Small Volume CSF Samples with Isobaric Labeling
4:00
MWCO Filtration, Desalting, and Sample Clean-up by Solid Phase Extraction
6:00
Offline High-pH Reverse Phase HPLC Sample Fractionation
7:09
LC-MS Analysis
7:47
Results: Peptide Identification After LC-MS Analysis
9:13
Conclusion
