Beurteilung der Harnwege Junction Obstruktion Mängel durch Methylenblau-Dye-Injektion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Obstruktionen der Harnwegsübergänge durch Injektion von Methylenfarbstoff in die Niere zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Entwicklung der Niere und der unteren Harnwege zu beantworten, wie z. B. die Verbindung der Harnblase. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine einfache Methode zur Visualisierung der Harnwegsstruktur im schlimmsten Fall bietet, was eine Analyse der Harnwegsentwicklung ermöglicht.

Messen Sie zu Beginn des Experiments 0,1 Gramm Methylenblaupulver. Das Methylenblau in 10 Millilitern 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS auflösen und das Gemisch vortexen. Filtern Sie anschließend die Methylenblaulösung mit 10 Milligramm pro Milliliter mit einem Spritzenfilter, um Verstopfungen während der Injektion zu vermeiden.

Setzen Sie dann ein steriles Kopfhautvenenset mit einer Drei-Milliliter-Einwegspritze zusammen und füllen Sie die Spritze mit drei Millilitern gefilterter Methylenblaulösung. Reinigen Sie Präparierscheren und -zangen mit 70% Ethanol. Um perinatale Embryonen bei E18.5 oder E19.5 zu gewinnen, euthanasieren Sie zuerst trächtige Mäuse durch Kohlendioxid-Inhalation.

Führen Sie dann eine Gebärmutterhalsluxation gemäß den NIH-Richtlinien durch. Sprühen Sie anschließend 70% Ethanol auf die ventrale Bauchfläche des Tieres. Anschließend wird mit der sterilen Präparierschere und der Pinzette die Bauchhöhle ventral geöffnet.

Heben Sie die gesamte Gebärmutter an und trennen Sie sie an den Spitzen der Gebärmutterhörner vom Körper. Spülen Sie dann die gesamte Gebärmutter mit 1x PBS in einer Petrischale aus. Schneiden Sie die Gebärmutter segmental mit einer Präparierschere und entfernen Sie die Plazenta-Dezidua mit einer Präparierzange, um die Embryonen und Dottersäcke freizulegen.

Entfernen Sie zuerst den Dottersack und entfernen Sie dann die Amnionmembran mit einer Präparierzange, um die perinatalen Embryonen zu befreien. Enthaupten Sie den Embryo mit einer Präparierschere. Fixieren Sie den Embryo mit seiner Bauchfläche nach oben auf ein Präpariermikroskop, das mit einer Digitalkamera für die Bildgebung ausgestattet ist.

Sammeln Sie seinen Schwanz für die Genotypisierung. Reißen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Haut auf, um die Bauchhöhle des Embryos zu öffnen. Entfernen Sie dann vorsichtig überschüssige Organe und Gewebe wie Leber, Magen und Darm mit einer Pinzette, indem Sie sie durchtrennen oder herausziehen, um die Nieren, die Harnleiter und die Blase freizulegen, die sich dorsal befinden.

Nehmen Sie überschüssiges Blut aus dem präparierten Embryo mit sterilen Mullbinden auf und fahren Sie dann mit der Färbeinjektion fort. Entfernen Sie Blasen in der Nadel und im Schlauch, indem Sie die Methylenblaulösung durch hydrostatischen Druck aus der Nadelspitze ausstoßen. Heben Sie die Spritze mit der Farbstofflösung über die Höhe der Nadelspitze, um den Fluss zu starten.

Senken Sie dann die Spritze ab, um den Fluss zu stoppen. Führen Sie dann die Nadel in das Nierenbecken in der Nähe des proximalen Harnleiters ein und achten Sie darauf, dass sie nach dem Platzieren nicht gestört wird. Führen Sie eine Farbstoffinjektion in eine Niere durch, um die Obstruktion der Harnwege zu bestimmen.

Nach dem Einführen einer Nadel in das Nierenbecken sollte eine Nadel in das Nierenbecken in Richtung des Harnleiters eingeführt werden, die weder durch die Niere noch in Richtung des Blutgefäßes verläuft. Heben Sie die Spritze etwa 20 Zentimeter nach oben, um hydrostatischen Druck zu erzeugen, und lassen Sie 15 bis 16 Mikroliter der Farbstofflösung fließen. Überwachen Sie dann die blaue Farbe des Farbstoffs, beginnend zuerst im Nierenbecken, dann in der Länge des Harnleiters und schließlich im Blasenlumen.

Legen Sie die Spritze nach unten, um den Farbstofffluss zu stoppen, und entfernen Sie die Nadel aus der Niere. Notieren Sie die Hydronephrose der Niere, des Hydroureters und die endgültige Position der Farbstofflösung in einem Labornotizbuch. Führen Sie schließlich die Injektion der kontralateralen Niere durch und lassen Sie den Farbstoff insgesamt 20 Sekunden lang fließen.

Nehmen Sie Bilder der Niere, des Harnleiters und der Blase auf, die mit Farbstofflösung verfolgt wurden, mit der Kamera und dem Bildgebungsprogramm, die mit einem Stereomikroskop verbunden sind. Nach der Injektion in eine Niere fließt der Farbstoff Methylenblau aus dem Nierenbecken durch den Harnleiter in die Blase, was zu einer sichtbaren blauen Farbe im Harnleiter und im Blasenlumen führt. Ein stärkeres Blau erscheint im Blasenlumen aufgrund eines längeren Flusses etwa 20 Sekunden nach der Injektion beider Nieren mit Farbstoff, was auf das Fehlen einer Obstruktion des Harnwegsübergangs im zweiten Harnsystem hinweist.

Bei der Injektion eines abnormal dilatierten Hydroureters ist die endgültige Position der Farbstofflösung unklar. Und eine Obstruktion des ureterovesikalen Übergangs oder UVJO kann trotz des Fehlens des Farbstoffs im Blasenlumen nicht nachgewiesen werden, da der abnormale Hydroureter in der Mitte beschädigt wurde. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Farbstoffsack-Perinatalembryonen zu berechnen, um ein intaktes Harnsystem zu erhalten.

Und entfernen Sie Blasen, um den Farbstofffluss nicht zu blockieren.