Live-Darstellung der Brust Epithelzelle Migration nach der vorübergehenden Erschöpfung der TIP60

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Auswirkungen der Depletion bestimmter Gene von Interesse auf die Zellmigration zu beobachten. Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen bei der Metastasierung von Krebs zu beantworten, wie z.B. die Migration von Krebszellen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es ermöglicht, die dynamische Zellmigration in Echtzeit zu überwachen.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir zum ersten Mal, als wir Veränderungen der Zellmorphologie bei Patienten mit TIP60, einem Tumorsuppressor, beobachteten. Beginnen Sie mit der Aussaat von einer Million Brustepithelzellen in drei Millilitern Kulturmedium pro 10-Zentimeter-Schale. Geben Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubierte SRINA-Mischung Tropfen für Tropfen in die experimentelle Zellkultur.

Schütteln Sie beide Schalen manuell, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind, bevor Sie sie in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator legen. Ersetzen Sie nach sechs Stunden die Überstände durch acht Milliliter frisches Nährmedium pro Schale und stellen Sie die Kulturen wieder in den Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Morgen die Überstände durch drei Milliliter frisches Nährmedium pro Schale und geben Sie ein zweites Pflaster SIRNA-Mischung in die experimentelle Zellkultur, wie gerade gezeigt, indem Sie die Schale schütteln, um sicherzustellen, dass die Reagenzien vollständig vermischt sind, bevor Sie die Zellen wieder in den Inkubator geben.

Ersetzen Sie dann nach sechs Stunden die Überstände durch acht Milliliter frisches Nährmedium und inkubieren Sie die Kulturen über Nacht. Waschen Sie die Zellen am dritten Tag einmal mit zwei Millilitern BPS pro Platte und lösen Sie die Zellen in beiden Platten mit einem Milliliter tripson EDTA pro Schale für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation wird die Reaktion mit vier Millilitern vollständigem Nährmedium pro Platte gestoppt.

Resuspendieren Sie die Zellen durch Pipettieren und überführen Sie die Zellsuspensionen in einzelne 15-Milliliter-Röhrchen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in fünf Millilitern serumfreiem Medium pro Röhrchen. Verdünnen Sie nach der Zählung beide Zellkulturen auf eine Konzentration von 600.000 Zellen pro Milliliter und geben Sie 500 Mikroliter Zellen aus jeder Kultur in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, um eine 100%ige Konfluenz zu gewährleisten.

Wenn alle Zellen ausgesät sind, schütteln Sie die Platte vorsichtig hin und her und von einer Seite zur anderen, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten, und legen Sie die Platte für 24 Stunden in den Zellkultur-Inkubator. Um die Knock-Down-Effizienz des interessierenden Gens zu überprüfen, sammeln Sie die verbleibenden Zellen in den Entnahmeröhrchen mit einer weiteren Zentrifugation und isolieren Sie die RNA aus den Pellets unter Verwendung eines kommerziellen Reagenzes gemäß den Anweisungen des Herstellers für die quantitative PCR-Bewertung in Echtzeit. Schalten Sie am nächsten Morgen, mindestens eine Stunde vor Beginn der Bildgebung lebender Zellen, das Mikroskop und die Temperaturregelung ein.

Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius und die Kohlendioxidgaszufuhr auf 5 % einWenn die Kammer 37 Grad Celsius erreicht hat, bestätigen Sie mit Phasenkontrastmikroskopie, dass die Zellen konfluent und vollständig mit dem Boden der Vertiefungen verbunden sind. Kratzen Sie dann mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze vorsichtig eine gerade Linie über die gesamte Länge der Mitte jeder Vertiefung und waschen Sie alle Vertiefungen vorsichtig fünfmal mit serumfreiem Medium, um die abgelösten Zellen zu entfernen. Geben Sie nach der letzten Wäsche einen Milliliter freies Serummedium in jede Vertiefung

Platzieren Sie die Platte auf dem Mikroskoptisch unter dem Objektiv mit 10 Potenzen und richten Sie das emittierte Licht auf die Okulare statt auf die Kamera. Passen Sie den Fokus manuell an, um jede Wunde und die Zellen um sie herum zu lokalisieren. Geben Sie dann das emittierte Licht an die Kamera zurück und verwenden Sie ein Lebendzellenbeobachtungssystem, um die Position der Wunden zu markieren und die Zeitbedingungen einzustellen.

Bilden Sie die Zellen für den entsprechenden Versuchszeitraum ab, öffnen Sie dann das erste avi-Video in der entsprechenden Bildgebungssoftware und öffnen Sie das m track j-Plug-In. Klicken Sie auf die Registerkarte Hinzufügen, um eine Spur für die einzelnen Zellen hinzuzufügen, und wählen Sie eine Zelle an der Spitze der invasiven Vorderseite und eine Zelle aus, die von selbst wandern kann. Verfolgen Sie die Bewegung der ausgewählten Zellen auf dem Video mit mtrackJ, um ihren Handel zu verfolgen.

Klicken Sie dann auf die Registerkarte Messen, um den Abstand der Zellenbewegung zu messen und die Videos mit den Spuren im AVI-Format zu speichern. Nach Depletion von TIP60 sind Brustepithelzellen im Vergleich zu kontrolliert kultivierten Zellen mesenchymaler. Tatsächlich nimmt die TIP60-Expression sowie die Expression der Epithelzelladhäsionsmoleküle nach der siTIP60-Behandlung signifikant ab.

Andererseits ist die Expression spezifischer epithelialer zu mesenchymaler Übergangstreibergene bei TIP60-Depletion erhöht. Die Live-Bildgebung der Zellkulturen nach der Wundverabreichung zeigt eine schnellere Zellmigration von siTIP60-behandelten Zellen im Vergleich zu siControl-Kulturen, mit einem signifikanten Anstieg des Prozentsatzes migrierender Zellen, der als Reaktion auf eine TIP60-Depletion beobachtet wurde. Darüber hinaus bewegen sich siControl-Zellen als Blatt, während innerhalb der siTIP60-Kulturen mehr Einzelzellbewegungen beobachtet werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Bildgebungstechnik für lebende Zellen verwenden können, um dynamische Veränderungen der Zellmigration zu überwachen.