Name: Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Lernen Sie die Aktivierung von Müller-Glia-Zellen bei laserinduzierter Netzhautdegeneration und -regeneration im Zebrafisch-Modell kennen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Reparaturmechanismen in vivo.

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Wir danken Martin Zinkernagel, MD, PhD und Miriam Reisenhofer, PhD für ihre wissenschaftlichen Beiträge zur Festsetzung von Modell und Federica Bisignani für ihre hervorragenden technischen Betreuung.

alle Experimente der Anweisung für den Einsatz von Tieren in Ophthalmic und Vision Research Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) eingehalten und beachten Sie die damit verbundenen Vorschriften der staatlichen Behörden.
 1. Tiere <ol><li>pflegen TgBAC (Gfap:gfap-GFP) Zebrafisch 167 (AB) Belastung im Alter von 6-9 Monate unter normalen Bedingungen in Wasser mit einer Temperatur von 26,5 ° C und eine 14/10 h hell/dunkel-Zyklus 18.</li>
	<li>Richtlinien der Tierbetreuung der beteiligten Institutionen für die Tierversuche nach Genehmigung durch die staatlichen Behörden.</li>
</ol> 2. Reversible systemische Narkose <ol><li>Vorbereitung der Stammlösung Ethyl-3-Aminobenzoate-Methanesulfonate-Salz (Tricaine) durch Auflösen von 400 mg Tricaine Pulver in 97,9 mL Wassertank und 2,1 mL 1 M Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS). Passen Sie auf pH 7,0 mit 1 M Tris (pH 9) und Store bei 4 ° C in den dunklen bis zu einem Monat. 
	Hinweis: Tricaine sollten bereit sein, im Wasser wie die natürlichen Lebensbedingungen der Tiere, vorzugsweise original Wassertank verwendet werden sollten.</li>
	<li>Der Stammlösung 01:25 im Tank Wasser zu verdünnen und sofort nutzen.</li>
	<li>Setzen der Zebrabärbling in einer 10 cm Petrischale mit 50 mL Anästhesie-Lösung, bis sie unbeweglich und nicht auf äußere Reize (ca. 2-5 min, je nach Gewicht und Alter reagieren).</li>
	<li>Übertragen jeden Fisch von hand auf eine maßgeschneiderte Silikon Stift Halterung für Laser-Behandlung ( Abb. 1A). 
	VORSICHT! Der Fisch kann außerhalb des Behälters für bis zu 10 min nur betäubt bleiben.</li>
	<li>Um die Narkose nach der Behandlung und/oder Bildgebung umzukehren, legen der Zebrabärbling in Behälter, Tank Wasser.</li>
	<li>Zur Unterstützung der Wiederherstellung erstellen einen Wasserfluss frischen Tank über den Kiemen durch Verschieben der Zebrabärbling hin und her im Wasser.</li>
</ol> 3. Laser-fokalen Verletzungen auf Netzhaut Hinweis: A 532 nm Diodenlaser wird verwendet, um fokale leichte Schäden an der Netzhaut der Zebrafisch erstellen. Der Versuchsaufbau des Lasers ermöglicht die Einrichtung einer reproduzierbaren fokale Netzhaut Verletzung im Erwachsenen Zebrafisch.
<ol><li>Eingerichtet, die Ausgangsleistung des Lasers: 70 mW; Antenne Durchmesser: 50 µm, Impulsdauer: 100 Ms. Vorsicht! Die Verwendung von Laserlicht erfordert geeignete persönliche Schutzausrüstung und Kennzeichnung des Gebiets.</li>
	<li>1-2 Tropfen 2 % Hydroxypropylmethylcellulose topisch in die Augen vor der Behandlung und eine 2,0 mm Fundus Laserlinse verwenden, um den mit dem Ziel, Laser Strahl auf die Netzhaut zu konzentrieren. 
	VORSICHT! Hydroxypropylmethylcellulose Tropfen sind zähflüssig und kann Probleme verursachen, wenn es auf den Kiemen geht atmen.</li>
	<li>Platz vier Laser Spots rund um den Sehnerv auf der linken Seite Auge und verwenden Sie das richtige, unbehandelte Auge als interne Kontrolle.</li>
</ol> 4. In vivo Bildgebung der Netzhaut Morphologie <ol><li>am Tag 0, visualisieren die Zebrafisch Netzhaut direkt nach der Laser-Induktion ohne Wiederbelebung sie aus der Narkose. Zu allen anderen Zeitpunkten beschäftigen Vollnarkose (siehe Abschnitt 2: Reversible systemische Anästhesie). Legen Sie die immobilisierten Zebrafisch auf eine maßgeschneiderte Silikon-Pin-Halter ( Abbildung 1 B, b. 1).</li>
	<li>Um optimale Aufnahmen zu schneiden eine handelsübliche Hydrogel-Kontaktlinse Zebrafisch Auge passen (Ø = 5,2 mm, R = 2,70 mm Mittendicke = 0,4 mm) durch einen Locher. Füllen Sie die konkave Oberfläche der Linse mit Methylcellulose und legen Sie es über die Hornhaut.</li>
	<li>Statten das OCT-System mit einem 78D berührungslose Schlitz Lampe Objektiv.</li>
	<li>Konzentrieren sich die Infrarot (IR) Bild in der IR + OCT-Modus ( Abbildung 2A) zu visualisieren den Fundus des Auges die IR Bilder durch Klicken auf die &#34; erwerben &#34; Taste ( Abb. 2 b) zu lokalisieren die Laser-Flecken auf der Netzhaut, die mit dem System &#39; s Software.</li>
	<li>Visualisieren eine dreidimensionale Abschnitt der Netzhaut Schichten in der IR + OCT-Modus und nehmen Sie die Bilder durch Klicken auf die &#34; erwerben &#34; Taste ( Abb. 2 b). Die Schwere der Verletzungen in der nuklearen Außenschicht (ONL) zu beobachten (siehe Abschnitt 3: Laser-fokalen Verletzungen auf Netzhaut) in diesen Bildern.</li>
	<li>, Betäubung rückgängig zu machen, nachdem die Behandlung und/oder Bildgebung der Zebrabärbling in einem Behälter mit Wassertank platziert.</li>
	<li>Zur Unterstützung der Wiederherstellung erstellen einen Wasserfluss frischen Tank über den Kiemen durch Verschieben der Zebrabärbling hin und her im Wasser.</li>
	<li>Führen Sie ähnlich wie in-Vivo Bildgebung der Netzhaut Morphologie an Tag 1, 3, 7, 14 und Woche 6.</li>
</ol> 5. Hämatoxylin &#38; Eosin (H &#38; E) färben <ol><li>einschläfern Zebrafisch durch Eintauchen in kalt (4 ° C) Anästhesie-Lösung auf Eis für mindestens 10 min und Einatmung die Augen sofort mit Hilfe von kleinen gebogenen Pinzette.</li>
	<li>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° C für 20 h die ganze Augen in 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixieren und dann pausiert die Proben in einer Reihe von abgestuften Alkohol (Xylol, 100 % für 5 min zweimal, Ethanol 100 % für 5 min zweimal, Ethanol 96 % für 3 min zweimal und Ethanol 70 % 3 mi einmal n). 
	VORSICHT! PFA kann reizend auf die Augen, der Nase und der oberen Atemwege. PFA ist ein bekanntes menschliches Karzinogen und eine vermutete Gefahr für die reproduktive.</li>
	<li>Der Proben in Paraffin eingebettet, geschnitten 5 µm-Abschnitte auf der Ebene des Sehnervenkopfes und klebe sie auf Glasobjektträger.</li>
	<li>Fleck in den deparaffinized Abschnitten mit 0,1 % Säure Hämatoxylin Lösung für 5 min und Tauchen Sie die Folien zweimal in destilliertem Wasser nach dem Eintauchen der Folien in Salzsäure-Mix (2 mL 25 % HCl in 250 mL destilliertes Wasser) und Ammoniak (2 mL 25 % Ammoniak in 250 mL mischen destilliertes Wasser). Fleck in den Abschnitten mit Eosin G wässriger Lösung 0,5 % für 3 min nach der Entwicklung der Hämatoxylin-Färbung von Leitungswasser für mindestens 10 min.</li>
	<li>Montieren Sie dehydrierten Folien in Acrylharz Eindeckmittel und beobachten Sie die Folien unter dem Lichtmikroskop.</li>
</ol> 6. Immunohistochemistry für die Aktivierung von MC <ol><li>die deparaffinized Abschnitte in Antigen Abruf Puffer (Tris-EDTA + 0,05 % nicht-ionische Waschmittel, pH 9,0) für 3 min in eine geeignete Dampfgarer oder Mikrowelle für 10-15 min. erhitzen und waschen dreimal mit TBS für 5 min.</li>
	<li>Kreis in den Abschnitten mit einem Silikon Stift und hinzufügen 100 µL blockiert Lösung (TBS + 10 % normalem Ziegenserum + 1 % Rinderserumalbumin, pH 7.6) bei Raumtemperatur für 1 h.</li>
	<li>Fleck mit Anti-glial fibrillary sauren Protein (GFAP) Kaninchen polyklonalen Antikörper und Anti-Glutamin Synthestase (GS) Maus monoklonaler Antikörper, sowohl in einer Verdünnung von 1: 200 (40 µL pro Probe). Über Nacht inkubieren Sie die Folie in eine feuchte Kammer bei 4 ° C. Waschen dreimal mit TBS + 0,1 % Tween 20 für 5 min.</li>
	<li>Finish Visualisierung mit dem entsprechenden Sekundärantikörper. Dieses Protokoll verwendet eine Ziege Anti-Kaninchen IgG H &#38; L grün Sekundärantikörper für GFAP und eine Ziege Anti-Maus IgG H &#38; L leuchtend rot für GS, sowohl in einer Verdünnung von 1: 500 bei Raumtemperatur für 1 h</li>
	<li>Montieren Sie die Folien mit Eindeckmittel mit DAPI und beobachten Sie die Folien unter dem Fluoreszenzmikroskop.</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Regeneration/Degeneration der Netzhaut in der Zebrabärbling wurde durch verschiedene Ansätze wie Zytotoxin-vermittelte Zelle Tod22, mechanische Verletzungen23und thermische Schädigung24untersucht. Wir beschäftigten 532 nm Diodenlaser die Zebrafisch Netzhaut beschädigen. Unser Modell bietet dabei mehrere Vorteile. Zum Beispiel haben wir schnell einen klar umrissenen Bereich der Verletzung in der äußeren Netzhaut, speziell in der PRs-Schicht lokalisier...

Vision ist wahrscheinlich der wichtigste Sinn des Menschen und seiner Beeinträchtigung hat eine hohe sozio-ökonomische Auswirkungen. In der industrialisierten Welt entfallen degenerative Netzhauterkrankungen die Mehrheit der Sehbehinderung und Blindheit bei der erwachsenen Bevölkerung1. Retinitis Pigmentosa (RP) ist die häufigste erbliche Ursache für Erblindung bei Menschen im Alter zwischen 20 und 60, Auswirkungen auf etwa 1,5 Millionen Menschen weltweit2,3. Es ist eine heterogene Familie von retinalen Erbkrankheiten durch fortschreitenden Verlust der Photorezeptoren (PRs), gefolgt von Degeneration des retinalen Pigmentepithels und anschließend Gliosis und Umbau des inneren Neuronen4gekennzeichnet. Der Krankheitsverlauf lässt sich erklären durch den inkrementellen Verlust der PR zwei Zelltypen, Stangen, die sind verantwortlich für achromatische Vision im Dämmerlicht und Zapfen, die für Color Vision und Sehschärfe5sind in der Regel ab. Ein einzelnes Gendefekt reicht für RP. Bisher wurden mehr als 130 Mutationen in mehr als 45 Genen verbunden mit der Krankheit-6. Dies führt zu unterschiedlichen Phänotypen der Krankheit und ist einer der Gründe, die Gentherapie nicht verallgemeinerbare ist und somit eine komplexe therapeutische Ansatz. Daher ist dringend erforderlich, neue allgemeine Therapieansätze zur Behandlung von retinaler Degenerationen in blendenden Krankheiten zu entwickeln.
Netzhautdegeneration oft schließt PR Verlust; Daher ist PR Zelltod ein Markenzeichen für die degenerativen Prozesse in der Netzhaut-7. Es wurde bereits nachgewiesen, dass PR Zelltod Müller Glia Zelle (MC) Aktivierung und Proliferation8stimuliert. MCs, großen glialen Zelltyp in der vertebrate Retina galten einmal als nichts anderes als ein "Klebstoff" zwischen Netzhaut Neuronen. In den letzten Jahren haben viele Studien gezeigt, dass MCs zu handeln, als mehr als bloße strukturelle9unterstützen. Unter den verschiedenen Funktionen MCs beteiligen sich auch an Neurogenese und10zu reparieren. In der Tat, in Reaktion auf diffusiblem Faktoren von der degenerierenden Netzhaut, MCs deutlich erhöhen glial fibrillary sauer (GFAP) Proteinexpression. Daher kann als Marker für MC Aktivierung als sekundäre Reaktion auf Netzhaut Verletzung und Degeneration11GFAP Kennzeichnung verwendet werden.
Vor kurzem haben wir eine neuartige Anpassung der fokalen Verletzungen mit Hilfe eines Lasers induzieren Netzhautdegeneration im Zebrafisch (Danio Rerio) entwickelt. Fokalen Verletzung ist vorteilhaft für das Studium bestimmte biologische Prozesse wie die Wanderung von Zellen auf der verletzten Seite und der genaue Zeitpunkt der Ereignisse, die während der Netzhaut Regeneration12stattfinden. Darüber hinaus ist der Zebrabärbling aufgrund der Ähnlichkeiten zwischen seine visuellen System und dem von anderen Wirbeltieren in visuelle Forschung wichtig geworden. Grobe morphologischen und histologischen Merkmale des menschlichen und teleost Netzhaut zeigen einige Unterschiede. Dementsprechend enthalten Mensch und Zebrafisch Netzhaut die gleichen großen Zelle Klassen organisiert in dem gleichen geschichteten Muster, wo lichtempfindlichen Photorezeptoren die äußerste Schicht, besetzen, während die Netzhaut Projektion Neuronen, die Ganglienzellen im Innersten wohnen neuronalen Ebene, proximal an der Linse. Die Netzhaut Interneuronen, die amakrinen, bipolar, und horizontalen Zellen zwischen den Photorezeptoren und Ganglienzellen Zelle Schichten13zu lokalisieren. Darüber hinaus ist die Zebrafisch Netzhaut Kegel beherrscht und daher näher an der menschlichen Netzhaut als zum Beispiel intensiv studierte Nagetier Netzhaut. Ein faszinierende Unterschied zwischen teleost und Säugetiere ist die anhaltende Neurogenese in Fisch Netzhaut und Netzhaut Regeneration nach Schaden. Im Zebrafisch können MCs Gewebestammzelle und Regeneration im geschädigte Netzhaut14,15vermitteln. Bei Hühnern haben MCs einige Fähigkeit auch, geben Sie den Zellzyklus und Gewebestammzelle. Nach Netzhaut Verletzung bei Erwachsenen Fischen MCs übernehmen bestimmte Merkmale der Stammvater und Stammzellen, migrieren, die beschädigte Netzhautgewebe und produzieren neue Neuronen16. Gen Expression profiling von Säugetieren MCs offenbart unerwartete Ähnlichkeiten mit retinalen Stammväter, und Beweise für die innewohnende Potenzial neurogenen MCs im Huhn, Nager und auch die menschliche Netzhaut wächst17. Dennoch, warum die regenerative Antwort in Vögel und Säugetiere niedriger, verglichen mit der starke Reaktion in Fisch ist noch nicht geklärt. Daher kann die körpereigene Reparaturmechanismen im Zebrafisch Verständnis Strategien für anregende retinalen Regeneration bei Säugetieren und beim Menschen vorschlagen. Einsatz der körpereigene Reparaturmechanismus der MCs als therapeutisches Werkzeug für die Behandlung von Patienten mit Netzhautdegeneration hervorragend für unsere Gesellschaft auswirken würde.
Hier bieten wir Ihnen die notwendigen Schritte zur Degeneration/Regeneration Modell in Augenheilkunde beschäftigen. Wir konzentrierte sich zunächst auf Induktion fokalen Schäden in der neurosensorischen Netzhaut, dann auf die Darstellung der Ereignisse am Verletzung Aufstellungsort und schließlich visualisieren Beteiligung der benachbarten MCs entwickeln. Das allgemeine Protokoll ist relativ einfach durchzuführen und öffnet eine Vielzahl von Möglichkeiten für die Bewertung der Netzhaut danach.

<table><tbody><tr><td>Saure Hämatoxylin-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>2852</td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>A07030</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Eindeckmedium</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, USA</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin G wässrige Lösung 0,5%</td><td>Carl Roth, Arlesheim, Schweiz</td><td>X883.2</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG H& L Alexa Fluor&reg; 488</td><td>Life Technologies, Zug, Schweiz</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Maus-IgG H& L Alexa Fluor&reg; 594</td><td>Life Technologies, Zug, Schweiz</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Normalserum</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogel Kontaktlinse</td><td>Johnson & Johnson AG, Zug, Schweiz</td><td>n.a.1-Day</td> <td>Acuvue Moist</td></tr><tr><td>Hydroxypropylmethylcellulose 2%</td><td>OmniVision, Neuhausen, Schweiz</td><td>n.a.Methocel</td> <td>2%</td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>A5040</td><td>Tricain, MS-222</td></tr><tr><td>Visulas 532s</td><td>Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Deutschland</td><td>n.a.532</td> <td>nm Laser</td></tr><tr><td>Maus monoklonaler Anti-GS-Antikörper</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>HRA + OCT Imaging System</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Deutschland</td><td>n.a.Spectralis</td><td></td></tr> <tr><td>Heidelberg Eye Explorer</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Deutschland</td><td>n.a.Version</td> <td>1.9.10.0</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen anti-GFAP polyklonaler Antikörper</td><td>Invitrogen, Waltham, MA, USA</td><td>180063</td><td></td></tr><tr><td>Silikonstifthalter</td><td>Huco Vision AG Schweiz</td><td>n.a.Von</td> <td>Hand aus Silikonstiftmatte der Sterilisationsschale entsprechend schneiden.</td></tr><tr><td>Spaltlampe BM900</td><td>Haag-Streit AG, Koeniz, Schweiz</td><td>n.a.Spaltlampenadapter</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Iridex Corp., Mountain View, CA, USA</td><td>n.a.Superfrost</td><td></td></tr> <tr><td>Plus Glasdias</td><td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Deutschland</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain</td><td>KIT, Karlsruhe, Deutschland</td><td>15204</td><td>http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3</td></tr><tr><td>Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>78D berührungslose Spaltlampenlinse</td><td>Volk Optical, Mentor, OH, USA</td><td>V78C</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Schweiz</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Augenfundus-Laserlinse</td><td>Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA</td><td>OFA2-0</td><td></td></tr><tr><td>2100 Retriever</td><td>Aptum Biologics Ltd., Southampton, Vereinigtes Königreich</td><td>R2100-EU</td><td>Dampfgarer</td></tr></tbody></table>

müller glia-zell-aktivierung in einer laserinduzierten netzhautdegeneration und regeneration modell im zebrafisch

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Ein faszinierende Unterschied zwischen teleost und Säugetiere ist das lebenslange Potenzial der teleost Netzhaut Netzhaut Neurogenese und Regeneration nach schweren Schäden. Die Regeneration Wege im Zebrafisch untersucht könnte neue Einblicke in innovative Strategien für die Behandlung von degenerativen Erkrankungen der Netzhaut bei Säugetieren bringen. Hierin, konzentrierten wir uns auf die Induktion einer fokalen Läsion an der äußeren Netzhaut in Erwachsenen Zebrafisch mittels einem 532 nm Diodenlaser. Eine lokalisierte Verletzung ermöglicht die Untersuchung biologischer Prozesse, die während retinalen Degeneration und Regeneration direkt auf dem Gelände des Schadens stattfinden. Verwendung von nicht-invasiven optischen Kohärenztomografie (OCT), konnten wir die Position der beschädigte Bereich und Monitor anschließende Regeneration definieren in-vivo. In der Tat produziert OCT-Bildgebung Cross-sectional hochauflösende Bilder der Zebrafisch Netzhaut, Bereitstellung von Informationen, die zuvor nur mit histologischen Analysen verfügbar war. Um die Daten in Echtzeit OCT bestätigen, histologische Abschnitte wurden durchgeführt und regenerative Reaktion nach der Induktion der Netzhaut Verletzung wurde von Immunohistochemistry untersucht.

Echtzeit-OCT: ein Laser Verletzungen Modell induzieren eine gut abgegrenzte Zone von Schäden in der Netzhaut Zebrafisch verwendet, um die Analyse der Rolle der MCs in retinalen Reparatur. Die Website des Schadens wurde mittels in Vivo OCT zum ersten Mal (Tag 0) innerhalb von 60 Minuten nach der Verletzung (Abbildung 3) abgebildet. Um die Optik des Auges Fisch zu kompensieren, wurde eine maßgeschneiderte Kontaktlinse auf die Hornhaut ...

Der Zebrabärbling ist eine beliebte Tiermodell, Mechanismen der retinalen Degeneration/Regeneration bei Wirbeltieren zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um lokalisierte Verletzung die äußeren Netzhaut mit minimaler Beschädigung der inneren Retina stören zu induzieren. Anschließend überwachen wir in Vivo die Netzhaut Morphologie und der Müller Gliazellen Antwort in der gesamten Netzhaut Regeneration.

Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, zu zeigen, wie zelluläre Veränderungen in vivo nach einer fokalen, laserinduzierten Netzhautschädigung bei Zebrafischen überwacht werden können. Dieses Modell kann dabei helfen, zentrale Fragen zur Netzhautregeneration zu beantworten, wie beispielsweise morphologische Veränderungen, Kinetik sowie beteiligte Zelltypen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass biologische Prozesse durch die Induktion einer fokalen Verletzung direkt am Ort der Schädigung untersucht werden können.Obwohl diese Methode Einblicke in die Regeneration der Zebrafisch-Retina ermöglichen kann, lässt sie sich auch zur Untersuchung der Reparaturmechanismen in verschiedenen Tiermodellen anwenden. Bereiten Sie eine Stammlösung des Anästhetikums zu, indem Sie 400 Milligramm Tricain-Pulver in 97,9 Milliliter Beckenwasser und 2,1 Milliliter einmolarer TBS lösen. Stellen Sie den pH-Wert mit einmolarer Tris-Lösung (pH 9) auf pH 7,0 ein.Um die Arbeitslösung herzustellen, verdünnen Sie die Tricain-Standardlösung 1 zu 25 in Beckenwasser und geben Sie 50 Milliliter in eine Petrischale. Danach bringen Sie die Zebrafische für zwei bis fünf Minuten in die Anästhetikum-Lösu

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Induktion von Netzhautdegeneration bei erwachsenen Zebrafischen mittels Laserverletzung. Der Laser zielt auf Photorezeptorzellen in der Netzhaut ab und löst den Zelltod und einen degenerativen Prozess aus. Diese Schädigung aktiviert Müller-Gliazellen (MG), was zu ihrer Dedifferenzierung in Stammzellvorläuferzellen führt, die die Regeneration der Netzhaut unterstützen.

Modellierung der Netzhautdegeneration und -regeneration im Zebrafisch mit Hilfe einer fokalen Laserverletzung

Quelle: Lahne, M., et.al. Kultur von adulten transgenen Zebrafisch-Netzhaut-Explantaten für die Bildgebung lebender Zellen mittels Multiphotonenmikroskopie. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Live-Zell-Bildgebung der Kernmigration von Müller-Gliazellen in Agarose-eingebetteten Zebrafisch-Netzhautexplantaten nach lichtinduzierter Photorezeptorschädigung. Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α), der von geschädigten Photorezeptoren freigesetzt wird, aktiviert Müller-Gliazellen und löst die...

Lebendzell-Bildgebung der Müller-Gliakernmigration während der Netzhautregeneration von Zebrafischen

Obwohl die peripheren Nervensystem (PNS) in der Lage ist signifikant Reparatur nach Verletzung, ist wenig über die zellulären und molekularen Mechanismen, die dieses Phänomen regeln bekannt. Mit Live-transgene Zebrafisch und einer reproduzierbaren Nervendurchtrennung Assay können wir dynamische Gliazellen Verhalten während Nerv Degeneration und Regeneration zu studieren.

Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

Mehrere leichte Schäden Protokolle, um Schäden Photorezeptoren beschrieben worden und folglich induzieren eine Netzhautregeneration Reaktion in erwachsenen Zebrafisch. Dieses Protokoll beschreibt ein verbessertes Verfahren, das in pigmentierten Tieren verwendet werden kann und dass Schäden, die überwiegende Mehrheit der lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen über die gesamte Netzhaut.

A Novel leichte Schäden Paradigm for Use in Retinal Regeneration Studies in Adult Zebrafisch

Hier zeigen wir Quantifizierung der Netzhaut De- und Regeneration und ihre Auswirkungen auf die visuelle Funktion mit N-Methyl-N -nitrosourea im erwachsenen Zebrafisch. Verlust der Sehschärfe und verminderte Photorezeptorzahlen wurden durch Proliferation in der inneren Kernschicht gefolgt. Vollständige morphologische und funktionelle Regeneration aufgetreten 30 Tage nach der ersten Behandlung.

Methylnitrosoharnstoff (MNU) induzierten Netzhautdegeneration und Regeneration im Zebrafisch: Die histologische und funktionelle Eigenschaften

Gezielte Manipulationen, um gezielten Stress oder Tod in einzelnen Zellen zu verursachen, waren relativ schwierig zu bewerkstelligen. Hier wird ein Ablationsansatz mit Einzelzellauflösung beschrieben, um einzelne Zellen in Zellkulturen und lebenden Tieren selektiv zu stressen und abzutöten, basierend auf einem konfokalen Standard-UV-Laser.

Das Auslösen Zellstress und Tod unter Verwendung von herkömmlichen UV-Laser konfokale Mikroskopie

Zebrabärbling retinale Regeneration hat meist unter Verwendung von Festnetzhäuten untersucht. Allerdings dynamische Prozesse wie interkinetic Kern Migration treten während der regenerativen Reaktion und erfordern Live-Cell-Imaging die zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen. Hier beschreiben wir Kultur und Abbildungsbedingungen Interkinetic Kern Migration (INM) in Echtzeit unter Verwendung von Multiphotonen-Mikroskopie zu überwachen.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

Laserablation ist eine weit verbreitete Technologie zur Untersuchung der Regeneration in biologischen Systemen. Das vorgestellte Protokoll beschreibt den Einsatz eines Standard-Laserscanning-Konfokalmikroskops zur Laserablation und anschließender Zeitraffer-Bildgebung regenerierender Interneuromastzellen in der Zebrafisch-Seitenlinie.

Konfokale Mikroskop-basierte Laserablation und Regenerationstest in Zebrafisch Interneuromastzellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion gewebespezifischer und hochreproduzierbarer Verletzungen in Zebrafischlarven unter Verwendung eines Laserläsionssystems in Kombination mit einer automatisierten mikrofluidischen Plattform für die Larvenhandhabung.

Kontrollierte halbautomatische laserinduzierte Verletzungen zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischlarven

Der Artikel erklärt, wie man Augen von lebenden Zebrafischlarven chirurgisch entfernt, als ersten Schritt zur Untersuchung, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des optischen Tektums beeinflusst. Darüber hinaus enthält der Artikel Informationen über Larvenanästhesie, Fixierung und Hirndissektion, gefolgt von Immunhistochemie und konfokaler Bildgebung.

Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur genetischen Ablation des retinalen Pigmentepithels (RPE) unter Verwendung eines transgenen Zebrafischmodells. Die Anpassung des Protokolls an die Modulation des Signalwegs unter Verwendung pharmakologischer Verbindungen ist ausführlich beschrieben. Eine MATLAB-Plattform zur Quantifizierung der RPE-Regeneration auf Basis von Pigmentierung wurde entwickelt und wird vorgestellt und diskutiert.

Nitroreduktase/Metronidazol-vermittelte Ablation und eine MATLAB-Plattform (RpEGEN) zur Untersuchung der Regeneration des Zebrafisch-Netzhautpigmentepithels

Lernen Sie die Aktivierung von Müller-Glia-Zellen bei laserinduzierter Netzhautdegeneration und -regeneration im Zebrafisch-Modell kennen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Reparaturmechanismen in vivo.

Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch

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