Müller Glia-Zell-Aktivierung in einer laserinduzierten Netzhautdegeneration und Regeneration Modell im Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, zu zeigen, wie zelluläre Veränderungen in vivo nach einer fokalen, laserinduzierten Netzhautschädigung bei Zebrafischen überwacht werden können. Dieses Modell kann dabei helfen, zentrale Fragen zur Netzhautregeneration zu beantworten, wie beispielsweise morphologische Veränderungen, Kinetik sowie beteiligte Zelltypen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass biologische Prozesse durch die Induktion einer fokalen Verletzung direkt am Ort der Schädigung untersucht werden können.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Regeneration der Zebrafisch-Retina ermöglichen kann, lässt sie sich auch zur Untersuchung der Reparaturmechanismen in verschiedenen Tiermodellen anwenden. Bereiten Sie eine Stammlösung des Anästhetikums zu, indem Sie 400 Milligramm Tricain-Pulver in 97,9 Milliliter Beckenwasser und 2,1 Milliliter einmolarer TBS lösen. Stellen Sie den pH-Wert mit einmolarer Tris-Lösung (pH 9) auf pH 7,0 ein.

Um die Arbeitslösung herzustellen, verdünnen Sie die Tricain-Standardlösung 1 zu 25 in Beckenwasser und geben Sie 50 Milliliter in eine Petrischale. Danach bringen Sie die Zebrafische für zwei bis fünf Minuten in die Anästhetikum-Lösung, bis sie bewegungslos sind und nicht mehr auf äußere Reize reagieren. Überführen Sie jeden Fisch von Hand in einen speziell angefertigten Silikon-Pin-Holder für die Laserbehandlung.

Eine geeignete Anästhesie ist entscheidend für das Wohlergehen des Tieres und den Erfolg des Eingriffs. Daher ist eine frisch zubereitete Tricain-Lösung unerlässlich, und die Zeit außerhalb des Wassers sollte 10 Minuten nicht wesentlich überschreiten. Stellen Sie die Ausgangsleistung des 532 Nanometer eingestellten Lasers auf 70 Milliwatt, die Impulsdauer auf 100 Millisekunden und den Luftdurchmesser auf 50 Mikrometer ein.

Tröpfeln Sie anschließend ein bis zwei Tropfen 2 % Hydroxypropylmethylcellulose auf das Auge. Achten Sie darauf, dass die viskose Lösung beim Auftragen von Methylcell auf das Auge nicht in die Kiemen gelangt. Verwenden Sie danach eine 2-Millimeter-Funduslaserlinse, um den Laserzielstrahl auf die Netzhaut zu fokussieren.

Platzieren Sie vier Laserpunkte um den Sehnerv am linken Auge und verwenden Sie das rechte, unbehandelte Auge als internen Kontrollwert. Unmittelbar nach der Laserinduktion wird der noch anästhesierte Zebrafisch auf einen speziell angefertigten Silikon-Pinhalter im Bildgebungsareal platziert. Um optimale Bilder zu erhalten, schneiden Sie eine handelsübliche Hydrogel-Kontaktlinse mithilfe eines Lochstanzers passend zur Augenform des Zebrafischs zurecht.

Füllen Sie die konkave Fläche der Linse mit Methylcellulose und setzen Sie sie dann über die Hornhaut. Rüsten Sie das optische Kohärenztomographie-System mit einer 78D-Spaltlampe-Linse ohne Kontakt aus. Fokussieren Sie das Infrarotbild im IR-plus-OCT-Modus, um den Augenhintergrund sichtbar zu machen.

Erzeugen Sie anschließend die IR-Bilder, indem Sie auf die Schaltfläche „Acquire“ klicken, um die Laserpunkte auf der Netzhaut zu lokalisieren. Visualisieren Sie dann einen dreidimensionalen Ausschnitt der Netzhautschichten im IR- plus OCT-Modus und nehmen Sie die Bilder auf, indem Sie erneut auf die Schaltfläche „Acquire“ klicken. Beobachten Sie das Ausmaß der Verletzung in der äußeren nukleären Schicht in diesen Bildern.

Um die Anästhesie nach der Behandlung und Bildgebung umzukehren, stellen Sie den Zebrabärbling in einen Behälter mit Beckenwasser. Um die Erholung zu unterstützen, erzeugen Sie durch Hin- und Herbewegen des Zebrabärblings im Wasser einen Strom frischen Beckenwassers über die Kiemen. Unmittelbar nach der Laserbehandlung wurde ein diffuses hyperreflektives Signal in der äußeren Retina lokalisiert.

Es erstreckte sich vom retinalen Pigmentepithel bis zur äußeren plexiformen Schicht. Das diffuse hyperreflektive Signal ist in der Netzhaut des kontrollierten, nicht geschädigten Auges nicht vorhanden. Ein ähnliches diffuses hyperreflektives Signal wurde am ersten Tag nach der Verletzung detektiert.

Nach Tag drei wurde dieses diffuse Signal organisierter und dichter. Es war durchgehend in der äußeren nukleären Schicht zu beobachten und reichte in die Photorezeptorschicht hinein. Nach der ersten Woche zeigte sich eine signifikante Abnahme der durchschnittlichen Läsionsgröße, und nur ein kleines hyperreflektives Signal war nachweisbar.

Ausgehend vom Tag 14 bis zum spätesten untersuchten Zeitpunkt waren die Laserstellen in den IR- und OCT-Aufnahmen nicht mehr sichtbar, und die Morphologie der Netzhaut ist mit der der Kontrollseite vergleichbar, wie hier dargestellt. Die H&E-Färbung wurde angewandt, um Umfang und Kinetik der Netzhautdegeneration und -regeneration zu untersuchen. Dieses Bild zeigt den Kontrollschnitt.

Dieses Bild zeigt die H&E-Färbung drei Tage nach der Verletzung, zu dem Zeitpunkt, zu dem der maximale Verlust von Photorezeptoren sichtbar ist. Eine Immunhistochemie zur Visualisierung der Marker für Gliazellen, Glutaminsynthetase in Rot und des glialen fibrillären sauren Proteins in Grün, wurde durchgeführt. Dieses Bild zeigt eine Kontrollretina, bei der nur sehr wenig grüne Fluoreszenz zu erkennen ist, was auf GFAP hinweist.

Das GFAP-Signal war drei Tage nach der Verletzung hochreguliert, während das rote Glutaminsynthetase-Signal unverändert blieb. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Zweiphotonenmikroskopie sowie zelluläre und molekulare Analysen durchgeführt werden, um die Beteiligung molekularer Zellen an endogenen Reparaturmechanismen zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine fokale Schädigung der Zebrafischretina induziert und die anschließenden degenerativen und regenerativen Prozesse in vivo verfolgt.